布魯氏菌可視化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法的建立及應(yīng)用

張萌，陽(yáng)愛(ài)國(guó)，安翠紅，侯巍，郭莉，袁東波，尹杰，莫茜，郭楊，吳宣，高露，王新

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌 712100）（2.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川成都611130）（3.陜西省疾病預(yù)防控制中心，陜西西安 710054）（4.四川省疾病預(yù)防控制中心，四川成都 610041）

近年來(lái)，羊奶因其與人類(lèi)乳汁的相似性比牛奶更高、營(yíng)養(yǎng)豐富、易于消化吸收等特點(diǎn)備受人們喜愛(ài)，甚至被稱(chēng)為“奶中之王”[1]。陜西省因其特殊的地理位置和歷史原因，奶山羊產(chǎn)業(yè)鏈發(fā)展迅速，富平縣甚至被授予“中國(guó)羊乳之都”稱(chēng)號(hào)。2018年，陜西省啟動(dòng)了“千億級(jí)奶山羊全產(chǎn)業(yè)鏈”工程。奶山羊產(chǎn)業(yè)備受關(guān)注，人們對(duì)羊奶及其制品的需求越來(lái)越大。而羊是導(dǎo)致布魯氏菌病流行與爆發(fā)的主要食源性動(dòng)物。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年陜西省共突發(fā) 4起布魯氏菌病疫情、報(bào)告發(fā)病 15例[2]。因此，對(duì)布魯氏菌病的防治與快速診斷刻不容緩。

布魯氏菌（Brucellaspp.）是一種無(wú)運(yùn)動(dòng)性、無(wú)莢膜、兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌，且具有較強(qiáng)的致病性和宿主特異性[3]。1985年，布魯氏菌被系統(tǒng)地分為了6個(gè)種19個(gè)型，包括牛種布魯氏菌（B.abortus）8個(gè)型、豬種布魯氏菌（B.suis）5個(gè)型、羊種布魯氏菌（B.melitensis）3個(gè)型、犬種布魯氏菌（B.canis）、綿羊附睪種布魯氏菌（B.ovis）和沙林鼠布魯氏菌（B.neotome）各1個(gè)型[4]。由感染布魯氏菌而引起的人畜共患疾病稱(chēng)為布魯氏菌?。˙rucellosis，以下簡(jiǎn)稱(chēng)布?。Ｗ钜赘腥静疾〉膭?dòng)物包括牛、羊和豬[5]。動(dòng)物通過(guò)食用被污染的飼料和接觸被感染的動(dòng)物而患病?；疾『蟮膭?dòng)物表現(xiàn)為流產(chǎn)、不孕、產(chǎn)奶量下降等癥狀[6]。人類(lèi)通過(guò)接觸被感染的動(dòng)物、食用被污染的肉類(lèi)或者奶制品而患病[2]。眾所周知，布病已經(jīng)對(duì)畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失并且嚴(yán)重影響其發(fā)展，甚至威脅到人類(lèi)的健康安全。因此，建立一種快速、簡(jiǎn)單、靈敏的方法檢驗(yàn)布魯氏菌顯得尤為重要。

目前，用于檢測(cè)布魯氏菌的方法主要包括病原學(xué)檢測(cè)、血清學(xué)檢測(cè)及分子生物學(xué)方法[7]。其中最常用的檢測(cè)方法是病原學(xué)檢測(cè)，即分離培養(yǎng)出目標(biāo)菌株，被稱(chēng)作是檢測(cè)布病的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。但該方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室的要求較高、檢測(cè)周期較長(zhǎng)、靈敏度較低且常用于發(fā)病期檢測(cè)[8,9]。血清學(xué)檢測(cè)包括試管凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、虎紅平板凝集試驗(yàn)等方法，則具有單克隆抗體制備周期長(zhǎng)且復(fù)雜、實(shí)際操作中限制條件較多、檢測(cè)成本較高等缺點(diǎn)[10,11]。分子生物學(xué)檢測(cè)包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）等方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但這些大多需要昂貴的專(zhuān)業(yè)儀器設(shè)備，不適合現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)[11-14]。2000年，Notomi研發(fā)出了一種新的分子檢測(cè)技術(shù)，稱(chēng)為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）。這一技術(shù)采用 DNA 聚合酶和一組四個(gè)引物對(duì)DNA靶序列進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)可在60~65 ℃等溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增，一般60 min即可反應(yīng)完全[15]。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法比較，LAMP具有高特異性、高靈敏度、快速高效等優(yōu)點(diǎn)，適合基層與現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)[15-19]。

基于以上優(yōu)點(diǎn)，LAMP已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于病原微生物的快速檢測(cè)方面，如金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、腸球菌耶爾森氏菌、志賀氏菌等[20-23]。本研究主要針對(duì)布魯氏菌的保守基因Omp2a設(shè)計(jì)3對(duì)LAMP引物，對(duì)布魯氏菌進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)化LAMP反應(yīng)條件與反應(yīng)體系，建立了一種特異、靈敏和可視化的LAMP檢測(cè)布魯氏菌的方法。同時(shí)，本研究還檢測(cè)了該方法的特異性和靈敏度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和樣本來(lái)源

布氏菌病活疫苗（豬種S2株、牛種A19株、羊種M5株）為天康生物股份有限公司產(chǎn)品；大腸桿菌ATCC25922、沙門(mén)氏菌 H9812、金黃色葡萄球菌ATCC29213、單核細(xì)胞增生李斯特菌CMCC 54004、蠟樣芽孢桿菌ATCC14579、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和福氏志賀氏菌對(duì)照菌株均來(lái)西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食源性病原微生物實(shí)驗(yàn)室保存。實(shí)際羊種菌布魯氏菌核酸樣本及該方法的驗(yàn)證由某疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要試劑

基因組抽提試劑盒購(gòu)自杭州博日科技有限公司；10×ThermoPol Buffer、MgSO4、Bst DNA Polymerase Large Fragment聚合酶購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；dNTP Mix（10 mM）購(gòu)自上海笛醫(yī)生物科技有限公司；甜菜堿購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；羥基萘酚藍(lán)（HNB）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；SYBR Green Ⅰ（10000×）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

高壓滅菌鍋（MDF-U5411）購(gòu)自上海申安高壓儀器設(shè)備有限公司；超凈工作臺(tái)（NU-425-400E）購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司；超純水機(jī)（Milli-Q Synthesis）購(gòu)自法國(guó)Millpro公司；PCR儀（Mycircle）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；電泳儀（DYY-6C）購(gòu)自北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)（GEL DOC XR）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 LAMP引物的設(shè)計(jì)與合成

在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索布魯氏菌Omp2a基因序列，選取不同種屬的Omp2a基因序列（AY008719.1、MF966952.1、MF966953.1、AY008721.1、AY008720.1），通過(guò)Clustal軟件比對(duì)分析，選取特異性好的保守片段。通過(guò)在線軟件 PrimerExplorer V5（http://primerexplorer.jp/e/）設(shè)計(jì)一套 LAMP引物，包括兩條外引物（F3、B3）、兩條內(nèi)引物（FIP、BIP）和兩條環(huán)引物（LF、LB），如表1所示。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，用ddH2O溶解后分裝，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 LAMP引物序列Table 1 Primer sequence of LAMP assays

1.2.2 細(xì)菌基因組DNA的提取

取購(gòu)買(mǎi)布魯氏菌活疫苗株S2、A19和M5加入無(wú)菌水后，放置于80 ℃水浴鍋內(nèi)滅活30 min，按照細(xì)菌基因組提取試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行布魯氏菌基因組的提取，測(cè)定DNA模板濃度及純度，存放于-20 ℃冰箱備用。其它菌株的DNA由西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食源性病原微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2.3 LAMP檢測(cè)方法的優(yōu)化

根據(jù)Bst DNA Polymerase Large Fragment聚合酶的說(shuō)明書(shū)推薦，將雙蒸水、10×ThermoPol Buffer、MgSO4、dNTP Mix、甜菜堿、FIP和BIP、F3和B3、LF和LB、HNB、Bst DNA Polymerase Large Fragment和模板DNA（含量為10 ng、1 ng、0.1 ng等）在冰浴條件下依次加入到EP管中，混合均勻，于加熱器或PCR儀恒溫孵育1 h。反應(yīng)結(jié)束后，將EP管于85 ℃下滅活5 min，擴(kuò)增產(chǎn)物于4 ℃冰箱中保存。

1.2.3.1 LAMP反應(yīng)溫度優(yōu)化

設(shè)置反應(yīng)溫度為 60 ℃、61 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、65 ℃和66 ℃，以S2標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA（25.6 ng/μL）為反應(yīng)模板，檢測(cè)LAMP最適的反應(yīng)溫度。根據(jù)瓊脂糖凝膠結(jié)果選擇最適反應(yīng)溫度。

1.2.3.2 LAMP反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化

設(shè)置反應(yīng)時(shí)間為15、30、45、60、75和90 min，以S2標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA（25.6 ng/μL）為反應(yīng)模板，檢測(cè)LAMP最適的反應(yīng)時(shí)間。根據(jù)瓊脂糖凝膠結(jié)果選擇最適反應(yīng)時(shí)間。

1.2.3.3 Mg2+濃度優(yōu)化

設(shè)置Mg2+的濃度分別為0 mM、2 mM、4 mM、6 mM、8 mM、10 mM、12 mM和14 mM，以S2標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA（25.6 ng/μL）為反應(yīng)模板，檢測(cè)LAMP最適的Mg2+濃度。根據(jù)瓊脂糖凝膠結(jié)果選擇最適Mg2+濃度。

1.2.3.4 Bst聚合酶濃度優(yōu)化

設(shè)置Bst聚合酶的濃度分別為0.192 U/μL、0.256 U/μL、0.320 U/μL、0.384 U/μL 和 0.448 U/μL，以 S2標(biāo)準(zhǔn)菌株的 DNA（25.6 ng/μL）為反應(yīng)模板，檢測(cè)LAMP最適的Bst聚合酶濃度。根據(jù)瓊脂糖凝膠結(jié)果選擇最適Bst聚合酶濃度。

1.2.3.5 甜菜堿濃度優(yōu)化

設(shè)置甜菜堿的濃度分別為0 M、0.2 M、0.4 M、0.6 M、0.8 M和1.0 M，以S2標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA（25.6 ng/μL）為反應(yīng)模板，檢測(cè)LAMP最適的甜菜堿濃度。根據(jù)瓊脂糖凝膠結(jié)果選擇最適甜菜堿濃度。

1.2.3.6 dNTPs濃度優(yōu)化

設(shè)置dNTPs的濃度分別為0 mM、0.6 mM、1.0 mM、1.4 mM、1.8 mM和2.2 mM，以S2標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA（25.6 ng/μL）為反應(yīng)模板，檢測(cè)LAMP最適的dNTPs濃度。根據(jù)瓊脂糖凝膠結(jié)果選擇最適 dNTPs濃度。

1.2.3.7 內(nèi)外引物濃度比優(yōu)化

設(shè)置內(nèi)外引物的濃度比分別為2:1、4:1、6:1、8:1、10:1和12:1，以S2標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA（25.6 ng/μL）為反應(yīng)模板，檢測(cè)LAMP最適的內(nèi)外引物濃度比。根據(jù)瓊脂糖凝膠結(jié)果選擇最適內(nèi)外引物濃度比。

1.2.3.8 可視化染料HNB濃度優(yōu)化

設(shè)置HNB的濃度分別為0 μM、60 μM、120 μM、180 μM 和 240 μM，以 S2標(biāo)準(zhǔn)菌株的 DNA（25.6 ng/μL）為反應(yīng)模板，檢測(cè)LAMP最適的HNB濃度。根據(jù)瓊脂糖凝膠結(jié)果選擇最適HNB濃度。重復(fù)3次。

1.2.4 LAMP擴(kuò)增結(jié)果檢測(cè)

1.2.4.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

LAMP反應(yīng)擴(kuò)增后的產(chǎn)物是若干個(gè)不同長(zhǎng)度的莖環(huán)DNA混合物，其在瓊脂糖凝膠電泳的中的條帶呈現(xiàn)特殊的梯狀結(jié)構(gòu)。使用濃度為 2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。電泳時(shí)，DNA Marker（DL2000）與LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的點(diǎn)樣量分別是5 μL和2 μL，電壓為120 V，電泳時(shí)間為35 min。電泳后的凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中紫外成像。成像后的電泳條帶為特殊的梯狀結(jié)構(gòu)，則擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性；若無(wú)條帶，則擴(kuò)增結(jié)果為陰性。

1.2.4.2 可視化HNB染料檢測(cè)

LAMP反應(yīng)過(guò)程中會(huì)消耗混合溶液中的Mg2+。而羥基萘酚藍(lán)（HNB）是一種常見(jiàn)的金屬指示劑，含有不同濃度Mg2+的混合液體顏色不同。在白色背景下觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的顏色：若擴(kuò)增產(chǎn)物保持紫羅蘭色不變，則表明DNA未擴(kuò)增，結(jié)果為陰性；若擴(kuò)增產(chǎn)物顏色變?yōu)樗{(lán)色，則表明DNA擴(kuò)增，結(jié)果為陽(yáng)性。

1.2.5 LAMP特異性檢測(cè)

為確保建立方法的特異性，用優(yōu)化好的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件檢測(cè)3種布魯氏菌及7種非布魯氏菌，每種細(xì)菌的DNA模板添加量為1 μL。

1.2.6 LAMP靈敏度檢測(cè)

采用10倍梯度稀釋法檢測(cè)建立方法的檢測(cè)限。每個(gè)梯度的DNA模板取1 μL加于優(yōu)化好的反應(yīng)體系中，在最適反應(yīng)條件下擴(kuò)增并判斷結(jié)果。

1.2.7 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）比較驗(yàn)證

常規(guī)PCR的引物及反應(yīng)條件來(lái)自文獻(xiàn)[24]，其具體序列如表2所示。

表2 PCR引物序列Table 2 Primer sequence of PCR assays

PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：2.5 μL 的 10×Buffer、5 μL dNTP Mix（2.5 mM）、3 μL MgSO4（25 mM）、0.5 μL F3（12.5 μM）、0.5 μL B3（12.5 μM）、0.125 μL Taq酶（5 U/μL）、1 μL DNA 模板（含量分別為 10 ng、1 ng、0.1 ng等），用雙蒸水補(bǔ)足體系。

PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸5 min后在4 ℃下保存。

1.2.8 LAMP重復(fù)性檢測(cè)

本研究所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次及以上，以確保實(shí)驗(yàn)具有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。

1.2.9 LAMP進(jìn)行陽(yáng)性布魯氏菌DNA和陰性對(duì)照菌DNA的驗(yàn)證檢測(cè)

將本研究建立好的LAMP最佳試劑及其擴(kuò)增條件提供給某疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行9份陽(yáng)性布魯氏菌DNA和4份陰性對(duì)照菌DNA（包括大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、傷寒沙門(mén)菌和蠟樣芽胞桿菌）的驗(yàn)證檢測(cè)。

1.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)算LAMP檢測(cè)方法相對(duì)常規(guī)分離方法檢測(cè)布魯氏菌的敏感性和特異性。敏感性和特異性的計(jì)算公式如下：

LAMP和PCR的檢測(cè)結(jié)果，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)敏感性和特異性進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，p<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP檢測(cè)方法優(yōu)化結(jié)果

優(yōu)化后的LAMP檢測(cè)方法體系如表3所示。

表3 優(yōu)化后的LAMP體系Table 3 Optimization of LAMP assays

優(yōu)化后LAMP檢測(cè)方法的反應(yīng)條件是：62 ℃反應(yīng)45 min。

2.1.1 LAMP反應(yīng)溫度的優(yōu)化結(jié)果

在設(shè)置好的溫度梯度下進(jìn)行LAMP反應(yīng)，結(jié)果如圖1所示。由圖可見(jiàn)，在設(shè)置的反應(yīng)梯度溫度范圍內(nèi)，LMAP擴(kuò)增都有較清晰的梯狀條帶。其中反應(yīng)溫度為62 ℃時(shí)，LAMP的梯狀條帶最為清晰明亮。因此，選擇62 ℃為L(zhǎng)AMP反應(yīng)最適溫度。

圖1 反應(yīng)溫度的優(yōu)化結(jié)果Fig.1 Optimization of reaction temperature

2.1.2 LAMP反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果

在設(shè)置好的時(shí)間梯度下進(jìn)行LAMP反應(yīng)，結(jié)果如圖2所示。由圖可見(jiàn)，反應(yīng)時(shí)間為30 min時(shí)，LAMP擴(kuò)增即出現(xiàn)清晰明亮的梯狀條帶且呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢(shì)。為保證建立LAMP方法的靈敏度及穩(wěn)定性，選擇45 min為最優(yōu)反應(yīng)時(shí)間。

圖2 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Optimization of reaction time

2.1.3 Mg2+濃度的優(yōu)化結(jié)果

在設(shè)置好的Mg2+濃度下進(jìn)行LAMP反應(yīng)，結(jié)果如圖3所示。由圖可見(jiàn)，Mg2+濃度為4 mM~14 mM時(shí)，LAMP擴(kuò)增即出現(xiàn)清晰明亮的梯狀條帶且呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢(shì)。其中Mg2+濃度為8 mM時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物最多，電泳條帶最為清晰明亮。當(dāng)Mg2+濃度過(guò)高時(shí)，電泳條帶變得模糊，LAMP反應(yīng)被抑制。因此，選取8 mM為最適Mg2+濃度。

圖3 Mg2+濃度的優(yōu)化結(jié)果Fig.3 Optimization of the concentration of Mg2+

2.1.4 Bst聚合酶濃度的優(yōu)化結(jié)果

在設(shè)置好的Bst聚合酶濃度下進(jìn)行LAMP反應(yīng)，結(jié)果如圖4所示。由圖可見(jiàn)，Bst聚合酶濃度在0.192 U/μL~0.448 U/μL范圍內(nèi)，LAMP擴(kuò)增均出現(xiàn)清晰明亮的梯狀條帶。在設(shè)置范圍內(nèi)，Bst聚合酶濃度對(duì)LAMP擴(kuò)增的影響無(wú)明顯差異。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，選取0.320 U/μL為最適Bst聚合酶濃度。

圖4 Bst聚合酶濃度的優(yōu)化結(jié)果Fig.4 Optimization of the concentration of Bst DNA polymerase

2.1.5 甜菜堿濃度的優(yōu)化結(jié)果

甜菜堿濃度對(duì)LAMP反應(yīng)的影響結(jié)果如圖5所示。由圖可見(jiàn)，在設(shè)置的甜菜堿濃度范圍內(nèi)，不同濃度的甜菜堿對(duì)LAMP反應(yīng)的影響無(wú)顯著差異。

2.1.6 dNTPs濃度的優(yōu)化結(jié)果

dNTPs濃度對(duì)LAMP反應(yīng)的影響結(jié)果如圖6所示。由圖可見(jiàn)，dNTPs濃度在1.0~2.0 mM范圍內(nèi)，LAMP反應(yīng)均擴(kuò)增出清晰的電泳條帶。因此，選擇條帶最為清晰明亮的1.4 mM為最適dNTPs濃度。

圖6 dNTPs濃度的優(yōu)化結(jié)果Fig.6 Optimization of the concentration of dNTPs

2.1.7 內(nèi)外引物濃度比的優(yōu)化結(jié)果

內(nèi)外引物濃度比對(duì)LAMP反應(yīng)的影響結(jié)果如圖7所示。由圖可見(jiàn)，在設(shè)置的內(nèi)外引物濃度比范圍內(nèi)，LAMP反應(yīng)均擴(kuò)增出梯狀條帶。其中內(nèi)外引物濃度比為 8:1時(shí)，電泳條帶最為清晰明亮。因此，選擇 8:1為最佳內(nèi)外引物濃度比。

圖7 內(nèi)外引物濃度比的優(yōu)化結(jié)果Fig.7 Optimization of the concentration ratio of internal and external primers

2.1.8 可視化染料HNB濃度的優(yōu)化結(jié)果

HNB濃度比對(duì)LAMP反應(yīng)的影響結(jié)果如圖所示。由圖8a可見(jiàn)，在設(shè)置的HNB濃度范圍內(nèi)，LAMP反應(yīng)均擴(kuò)增出明亮的梯狀條帶，說(shuō)明HNB對(duì)LAMP反應(yīng)無(wú)抑制作用。由圖8b可見(jiàn)，HNB濃度為180 μM時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照與空白對(duì)照之間的顏色差異最為明顯。因此，選擇180 μM為最佳HNB濃度。

圖8 LAMP反應(yīng)HNB濃度的優(yōu)化結(jié)果Fig.8 Optimization of the concentration of HNB

2.2 LAMP特異性檢測(cè)結(jié)果

用7種非布魯氏菌的DNA以及3種布魯氏菌的DNA為模板，采用前面優(yōu)化過(guò)的 LAMP體系，在62 ℃恒溫反應(yīng)45 min，在自然光下觀察反應(yīng)管顏色。同時(shí)，取2 μL反應(yīng)產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析。如圖9所示，加入3種布魯氏菌模板的反應(yīng)管顏色均由紫羅蘭色變?yōu)樗{(lán)色，與電泳結(jié)果一致。表明設(shè)計(jì)引物的特異性良好，能準(zhǔn)確區(qū)分布魯氏菌與非布魯氏菌。

圖9 LAMP特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.9 Specificity of LAMP assays

2.3 LAMP靈敏度檢測(cè)結(jié)果

將濃度為256 ng/μL的DNA模板10倍梯度稀釋?zhuān)⑷? μL加到LAMP反應(yīng)體系中。62 ℃反應(yīng)45 min后，靈敏度檢測(cè)結(jié)果如圖10。結(jié)果表明，建立的LAMP方法檢測(cè)限為2.56×10-4ng/μL，且可視化結(jié)果與凝膠電泳結(jié)果一致。

圖10 LAMP靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.10 Sensitivity of LAMP assays

2.4 PCR結(jié)果分析

如圖11所示，PCR反應(yīng)的檢測(cè)限為 2.56×10-3ng/μL，靈敏度低于建立好的LAMP檢測(cè)方法。

2.5 LAMP進(jìn)行陽(yáng)性布魯氏菌DNA和陰性對(duì)照菌DNA的驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果

將構(gòu)建成功的 LAMP方法用于檢測(cè)某疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室提供9份陽(yáng)性布魯氏菌DNA和4份陰性對(duì)照菌 DNA進(jìn)行驗(yàn)證檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LAMP法相對(duì) 9份陽(yáng)性布魯氏菌 DNA和 4份陰性對(duì)照菌DNA（包括大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、傷寒沙門(mén)菌和蠟樣芽胞桿菌）的敏感性和特異性均為 100%，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見(jiàn)圖12，p>0.05）。

圖12 LAMP檢測(cè)9份陽(yáng)性布魯氏菌DNA和4份陰性對(duì)照菌DNA的驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果Fig.12 Detection results of 9 DNA samples of Brucella spp. and 4 DNA samples of control bacteria by LAMP

2.6 討論

布魯氏菌的寄主具有多樣性，動(dòng)物與人類(lèi)普遍易感[25]。近年來(lái)，消費(fèi)者們?cè)絹?lái)越關(guān)注食品安全問(wèn)題，同時(shí)食品行業(yè)和政府部門(mén)也表達(dá)了快速簡(jiǎn)便檢驗(yàn)布魯氏菌的迫切需求。目前，常用于檢測(cè)布魯氏菌的病原學(xué)檢測(cè)方法、免疫學(xué)檢測(cè)方法、PCR和RT-PCR檢測(cè)方法都具有一定的局限性，并不適用于資源匱乏的基層檢驗(yàn)與野外現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)[26,27]。作為一種新型的分子檢驗(yàn)技術(shù)，LAMP是一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速的檢測(cè)方法，且它不需要昂貴的儀器只要一臺(tái)穩(wěn)定的水浴鍋即可滿(mǎn)足試驗(yàn)條件[28]。

自LAMP方法建立以來(lái)，經(jīng)過(guò)數(shù)年的發(fā)展，該方法已經(jīng)較為成熟。其結(jié)果的判定方法從一開(kāi)始的濁度檢測(cè)和凝膠電泳檢測(cè)發(fā)展為現(xiàn)在的添加染料檢測(cè)方法。濁度儀機(jī)器昂貴且使用范圍小，凝膠檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)且容易造成污染，而添加染料檢測(cè)結(jié)果方便觀察且不易污染[29]。與其他研究采用SYBR Green、鈣黃綠素、SYTO-82等染料相比，本研究采用HNB染料作為指示劑，經(jīng)過(guò)濃度優(yōu)化后具有不影響LAMP擴(kuò)增、能準(zhǔn)確靈敏的反應(yīng)結(jié)果、顏色對(duì)比明顯、價(jià)格低廉且無(wú)需熒光即肉眼可見(jiàn)等優(yōu)點(diǎn)。這種不需要開(kāi)蓋檢測(cè)結(jié)果的方法大大減少了氣溶膠的形成與擴(kuò)散，降低了LAMP發(fā)生假陽(yáng)性的概率。

3 結(jié)論

為了建立一種快速、高效、特異性好的基于LAMP檢測(cè)布魯氏菌的方法，本研究針對(duì)布魯氏菌的保守基因Omp2a設(shè)計(jì)了一套六個(gè)引物，包括兩條外引物（F3、B3）、兩條內(nèi)引物（FIP、BIP）和兩條環(huán)引物（LF、LB）。為了檢驗(yàn) LAMP方法的特異性，本研究對(duì) 10種菌株純培養(yǎng)物（包括3種布魯氏菌和7種非布魯氏菌）和9個(gè)實(shí)際樣本進(jìn)行了檢測(cè)，并與常規(guī)病原學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，本研究?jī)?yōu)化好的LAMP方法可以準(zhǔn)確區(qū)分布魯氏菌與非布魯氏菌，在所用實(shí)際樣本檢測(cè)中的敏感性與特異性均為 100%。同時(shí)，靈敏度檢驗(yàn)結(jié)果表明優(yōu)化好的 LAMP檢測(cè)方法的靈敏度（檢測(cè)限為2.56×10-4ng/μL）是傳統(tǒng)PCR的10倍。并且在環(huán)引物的作用下，本研究的LAMP擴(kuò)增僅需45 min即可完成，較通常所需的60 min節(jié)省了時(shí)間。總而言之，本研究建立的LAMP方法可以準(zhǔn)確、快速的檢驗(yàn)布魯氏菌且適用于基層檢驗(yàn)和現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)。