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    光譜法結(jié)合計(jì)算模擬探究胡桃醌與脯氨酰順反異構(gòu)酶1的相互作用

    2021-09-02 03:44:08蔣曉玙馬超余凱周安朱國飛
    現(xiàn)代食品科技 2021年8期
    關(guān)鍵詞:作用力殘基氫鍵

    蔣曉玙,馬超,余凱,周安,朱國飛

    (1.貴陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院生化工程系,貴州貴陽 550081)(2.貴州理工學(xué)院食品藥品制造工程學(xué)院,貴州貴陽 550003)

    關(guān)鍵字:胡桃醌;脯氨酰順反異構(gòu)酶1(Pin1);光譜學(xué);計(jì)算模擬;定點(diǎn)突變

    胡桃楸和核桃在我國資源豐富,很多部分均可食用,具有很高的營養(yǎng)價(jià)值。大量研究結(jié)果表明,其含有的有效成分胡桃醌(Julgone,又名5-羥基-1,4-萘醌,屬于萘醌類化合物),不僅具有顯著的抗菌、止血功能,還具有較好的抗腫瘤功效,能有效地抑制胃癌,肝癌,卵巢癌,宮頸癌,肺癌,結(jié)腸癌等惡性腫瘤的增殖[1-3]。然而,胡桃醌的這種抗腫瘤作用的分子機(jī)制任然還不是很清楚。

    脯氨酰順反異構(gòu)酶 1(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1,Pin1)可以特異性調(diào)節(jié)磷酸化蛋白質(zhì)中絲氨酸或蘇氨酸-脯氨酸模體(pSer/Thr-Pro)從順式構(gòu)象轉(zhuǎn)為反式構(gòu)象,從而調(diào)節(jié)該蛋白功能,影響一系列信號通路[4]。Pin1的底物蛋白在有絲分裂、轉(zhuǎn)錄、分化和DNA損傷應(yīng)答等各種生物功能起著重要的作用。尤其值得注意的是,Pin1在原癌基因信號通路中也起著關(guān)鍵的作用,并且在乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和甲狀腺癌等多種腫瘤細(xì)胞中過量表達(dá),其表達(dá)量高低與腫瘤惡性程度成正相關(guān),而抑制腫瘤細(xì)胞中 Pin1蛋白的活性能夠觸發(fā)細(xì)胞凋亡[5,6]。盡管研究表明,胡桃醌可作為 Pin1小分子抑制劑,能有效抑制其活性,從而抑制腫瘤增殖,但是胡桃醌與Pin1具體作用機(jī)制還知之甚少[7]。

    為了從分子水平上探究胡桃醌對 Pin1的抑制機(jī)制,本研究采用最常用的光譜法結(jié)合計(jì)算模擬探究了胡桃醌與 Pin1的互作機(jī)理[8,9]。在本研究中,首先使用熒光光譜推斷出Pin1與胡桃醌的淬滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)以及熱力學(xué)參數(shù)等信息。其次,使用同步熒光光譜和圓二色譜探究胡桃醌對 Pin1構(gòu)象的影響。再次,利用分子對接預(yù)測出潛在的結(jié)合位點(diǎn),并對潛在的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了定點(diǎn)突變,構(gòu)建了H59A,L61A,C113A,S114和S154A等多個(gè)突變體,然后通過突變體熒光滴定對結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證。最后,采用分子動力學(xué)模擬探究 Pin1與胡桃醌在體外隨時(shí)間變化的結(jié)合信息。申炳俊等探究了胡桃醌與人血清白蛋白的相互作用研究[3],為從分子水平上了解胡桃醌在體內(nèi)可能的運(yùn)轉(zhuǎn)、代謝、排泄等提供了信息。本研究將從分子水平上探究胡桃醌與Pin1的相互作用,為闡明胡桃醌的抗腫瘤作用提供參考,為擴(kuò)大胡桃醌的應(yīng)用,綜合開發(fā)利用我國胡桃楸和核桃資源,研發(fā)具有防癌、抑癌、治癌功能的保健食品、藥品提供相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 材料與儀器

    試劑:三羥甲基氨基甲烷(Tris)和二甲基亞砜(DMSO)購買自Sigma公司;胡桃醌(Julgone)購買自源葉公司;胰蛋白胨和酵母提取物購買自O(shè)XOID公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和氨芐青霉素購買自生工公司;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

    儀器:日立F-4700熒光光譜儀,Jasco J-815圓二色譜儀,戴爾T440塔式服務(wù)器。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 Pin1及其突變體原核表達(dá)與純化

    Pin1及其突變體H59A、L61A、C113A、S114和S154A重組質(zhì)粒pET-19b由實(shí)驗(yàn)室保存。首先將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3),然后接種在含氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中,待其長到對數(shù)期時(shí),18 ℃,加入IPTG誘導(dǎo)10 h。離心收集菌體,然后重懸菌體,超聲破碎,高速離心,棄沉淀,收集上清。將上清液倒入 Ni2+-NTA-Sepharose親和層析柱中,先用 20 mmol/L咪唑溶液洗脫雜蛋白,再用400 mmol/L咪唑溶液洗脫目的蛋白,最后使用超濾管去除咪唑溶液。

    1.2.2 熒光光譜

    在石英比色皿中,加入200 μL的5 μmol/L Pin1溶液,每次滴加適量的1 mmol/L胡桃醌溶液,測量熒光光譜,控制胡桃醌終濃度為 0、5、10、15、20和30 μmol/L。內(nèi)源熒光光譜采用295 nm作為激發(fā)波長,掃描波長為 310~400 nm。同步熒光光譜測定使用Δλ=15 nm和Δλ=60 nm,掃描范圍分別為270~310 nm和250~310 nm。激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫分別設(shè)置為5和10 nm,激發(fā)電壓為700 V,掃描速度為1200 r/mim。

    1.2.3 圓二色譜

    在比色皿中,加入200 μL的10 μmol/L Pin1溶液,每次滴定適量的1 mmol/L胡桃醌溶液,測量圓二色譜,控制胡桃醌終濃度為0、10和30 μmol/L。掃描速度設(shè)置為200 nm/min,響應(yīng)時(shí)間設(shè)置為2 s,掃描波長為200~260 nm。

    1.2.4 分子對接

    Pin1的三維結(jié)構(gòu)(PDB_ID:4TNS)下載自PDB蛋白數(shù)據(jù)庫[10]。胡桃醌的三維結(jié)構(gòu)(ZINC_ID:ZINC526257)下載自ZINC數(shù)據(jù)庫[11]。使用ADT工具對Pin1蛋白進(jìn)行預(yù)處理,包括去除配體,去除結(jié)晶水,加氫,加電荷以及確定對接盒子。使用AutoDock Vina 1.0軟件進(jìn)行分子對接[12]。

    1.2.5 分子動力學(xué)模擬

    使用GROMACS 4.6.5程序?qū)Ψ肿訉又蟮慕Y(jié)合模型進(jìn)行分子動力學(xué)模擬,使用 pdb2gmx和Ambertools程序分別獲取Pin1和胡桃醌參數(shù)文件[13]。Pin1與胡桃醌復(fù)合物的分子力場選用AMBER99SB,并進(jìn)行20 ns分子動力學(xué)模擬。使用GROMACS 4.6.5自帶的工具進(jìn)行模擬分析。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 熒光發(fā)射光譜檢測胡桃醌與Pin1相互作用

    熒光發(fā)射光譜能夠監(jiān)測蛋白結(jié)構(gòu)中發(fā)色基團(tuán)微環(huán)境的改變。Pin1蛋白包含三個(gè)色氨酸殘基和三個(gè)酪氨酸殘基,具有內(nèi)源熒光現(xiàn)象。當(dāng)激發(fā)波長為295 nm,主要呈現(xiàn)色氨酸殘基微環(huán)境變化。如圖1a所示,隨著胡桃醌濃度的增加,Pin1的內(nèi)源熒光強(qiáng)度逐漸下降。表明胡桃醌結(jié)合到Pin1中,導(dǎo)致Pin1熒光淬滅。

    熒光淬滅可以分為兩種,動態(tài)淬滅和靜態(tài)淬滅,可以根據(jù)Stern-Volmer方程計(jì)算淬滅常數(shù)(Ksv)和動態(tài)熒光淬滅速率常數(shù)(Kq)得出。公式如下所示:

    式中,F(xiàn)為有胡桃醌時(shí)Pin1的熒光強(qiáng)度;F0為無胡桃醌時(shí)Pin1的熒光強(qiáng)度;τ0為胡桃醌不存在時(shí)熒光體的熒光壽命,約為10-8s[14];[Q]為胡桃醌濃度。

    根據(jù)公式 1,以F0/F對[Q]進(jìn)行線性擬合,做出Stern-Volmer圖,根據(jù)擬合直線的斜率可以得出不同溫度下的Ksv和Kq值。如圖1b和表1所示,在293 K,胡桃醌對Pin1淬滅常熟(Ksv)為1.36×104L/mol,隨著溫度的增加,Ksv值逐漸降低,表明溫度升高會導(dǎo)致胡桃醌對Pin1的淬滅程度降低,這是一個(gè)典型的靜態(tài)淬滅特征。此外,在293 K和303 K條件下,Kq值分別為 1.36×1012L/(mol·s)和 0.66×1012L/(mol·s),均遠(yuǎn)大于最大擴(kuò)散碰撞淬滅常數(shù)2×1010L/(mol·s)[14],進(jìn)一步表明胡桃醌對 Pin1的熒光淬滅過程是靜態(tài)淬滅過程。

    圖1 內(nèi)源熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence spectra

    對于靜態(tài)淬滅過程,可以使用 Lineweaver-Burk雙對數(shù)方程計(jì)算結(jié)合常數(shù)(Ka)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n),公式如下所示:

    式中,F(xiàn)為有胡桃醌時(shí)Pin1的熒光強(qiáng)度;F0為無胡桃醌時(shí)Pin1的熒光強(qiáng)度;[Q]為胡桃醌濃度。

    根據(jù)公式2,以lg[(F0-F)/F]對lg[Q]進(jìn)行線性擬合,做出 Lineweaver-Burk雙對數(shù)圖,以擬合直線的斜率和截距可以得出不同溫度下的n和Ka值。如圖1c和表1所示,在293 K條件下,Ka值為2.32×104L/mol,隨著溫度的增加,Ka值逐漸降低,表明溫度升高會導(dǎo)致胡桃醌對Pin1的結(jié)合程度降低,這也是靜態(tài)淬滅的典型特征之一。此外,在293 K和303 K條件下,n值分別為0.85和0.80,均接近1,表明胡桃醌對Pin1的結(jié)合只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

    表1 胡桃醌與Pin1相互作用熱力學(xué)參數(shù)Table 1 Thermodynamic parameters between juglone and Pin1

    藥物與蛋白質(zhì)之間的作用力主要有氫鍵,范德華力,疏水作用力和靜電作用力,它們可以通過 Van’t Hoff方程計(jì)算焓變(ΔH),熵變(ΔS)和吉布斯自由能(ΔG)來判斷[15]。公式如下所示:

    式中,Ka為公式2中計(jì)算的結(jié)合常數(shù);T為實(shí)驗(yàn)溫度;R為氣體常數(shù)。

    根據(jù)公式3~5,可以分別計(jì)算出ΔH,ΔS和ΔG,結(jié)果如表1所示。在293 K和303 K條件下,ΔG分別為-24.49和-22.80 kJ/mol,表明胡桃醌與Pin1的結(jié)合是自發(fā)結(jié)合過程。根據(jù)Ross等歸納出來的熱力學(xué)規(guī)律[16,17]:當(dāng)ΔH>0和ΔS>0時(shí),作用力為疏水作用力;當(dāng)ΔH<0和ΔS>0時(shí),作用力為靜電作用力;當(dāng)ΔH<0和ΔS<0時(shí),作用力為氫鍵和范德華力。在293 K條件下,ΔH和 ΔS分別是 12.97 kJ/mol和 127.83 J/(mol·K)。這個(gè)結(jié)果表明胡桃醌與Pin1的結(jié)合過程中,主要的作用力是疏水作用力。此外,胡桃醌化學(xué)結(jié)構(gòu)表明其有一個(gè)疏水性萘醌環(huán)組成,并含有一個(gè)羥基。因此,除了疏水作用力,氫鍵作用也不應(yīng)該排除,詳細(xì)的作用力類型將在對接模型和MM/PBSA結(jié)合自由能中進(jìn)一步討論。

    2.2 同步熒光光譜檢測胡桃醌對 Pin1構(gòu)象的影響

    同步熒光光譜可以檢測蛋白質(zhì)中色氨酸或酪氨酸微環(huán)境構(gòu)象的變化。當(dāng)Δλ(Δλ=λem–λex)分別等于15 nm和60 nm時(shí),分別表示色氨酸和酪氨酸同步熒光光譜。如圖2a所示,當(dāng)Δλ=15 nm時(shí),隨著胡桃醌濃度的增大,酪氨酸熒光強(qiáng)度逐漸降低,表明胡桃醌可以淬滅酪氨酸內(nèi)源熒光。并且,最大發(fā)射波長從 291 nm輕微紅移至293 nm,表明酪氨酸殘基周圍微環(huán)境疏水性降低,極性增加。如圖2b所示,當(dāng)Δλ=60 nm時(shí),隨著胡桃醌濃度的增大,色氨酸熒光強(qiáng)度逐漸降低,表明胡桃醌可以淬滅色氨酸內(nèi)源熒光。與酪氨酸同步熒光類似,最大發(fā)射波長從281 nm輕微紅移至283 nm,表明色氨酸殘基周圍微環(huán)境疏水性降低,極性增加。

    圖2 胡桃醌與Pin1相互作用同步熒光光譜。Fig.2 Synchronous fluorescence spectra between juglone and Pin1

    2.3 圓二色譜檢測胡桃醌對 Pin1二級結(jié)構(gòu)的影響

    圓二色譜是最常見的檢測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化的技術(shù)之一[18,19]。如圖3所示,Pin1的圓二色譜在208和222 nm附近有兩個(gè)負(fù)峰,是典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)。隨著胡桃醌濃度的增加,譜圖中負(fù)峰強(qiáng)度減弱,表明胡桃醌與Pin1結(jié)合會導(dǎo)致Pin1的α-螺旋結(jié)構(gòu)減少??赡苁呛阴c Pin1中α-螺旋結(jié)構(gòu)中的氨基酸發(fā)生氫鍵締合等作用,引起Pin1空間變化,α-螺旋數(shù)量下降[20,21]。為了進(jìn)一步定量α-螺旋含量的變化,使用如下兩個(gè)公式計(jì)算:

    圖3 胡桃醌與Pin1相互作用圓二色譜Fig.3 Circular dichroism between juglone and Pin1

    式中,Cp表示Pin1摩爾濃度(10 μM);n表示Pin1氨基酸殘基數(shù)(163);l表示樣品池的厚度(0.1 cm);MRE208表示蛋白質(zhì)在208 nm處的平均殘基橢圓率。

    根據(jù)公式6和7,計(jì)算Pin1中α-螺旋含量。如圖3所示,當(dāng)加入胡桃醌和Pin1的摩爾比分別為1:0、1:1和1:3時(shí),對應(yīng)的Pin1的α-螺旋含量為23.44%、20.11%和17.82%。表明胡桃醌會導(dǎo)致Pin1中的α-螺旋含量減少。同時(shí)譜圖形狀和峰尖位置沒有明顯變化,也進(jìn)一步說明胡桃醌主要影響Pin1中的α-螺旋結(jié)構(gòu)。

    2.4 分子對接預(yù)測胡桃醌與Pin1的結(jié)合模型

    分子對接是最常見預(yù)測藥物和蛋白結(jié)合的方法之一[22-24]。利用AutoDock Vina對胡桃醌和Pin1進(jìn)行分子對接,預(yù)測兩者結(jié)合模型和作用機(jī)制。如圖4A所示,胡桃醌進(jìn)入 Pin1疏水空腔中,并且與關(guān)鍵殘基His59、Leu61、Cys113、Ser114和Ser154相互接觸。為了進(jìn)一步分析胡桃醌與 Pin1中關(guān)鍵殘基作用力類型,詳細(xì)的結(jié)果展現(xiàn)在圖4B中,胡桃醌與Cys113、Ser114和Ser154形成三個(gè)氫鍵,以及與Cys113形成一個(gè)Pi-Alkyl鍵(一種疏水作用力),與His59和Leu61形成范德華力。這個(gè)結(jié)果與熱力學(xué)參數(shù)結(jié)論一致,表明胡桃醌與Pin1的作用力類型主要是疏水作用力,氫鍵和范德華力。

    圖4 胡桃醌與Pin1相互作用預(yù)測結(jié)合模型Fig.4 Predicted binding model between juglone and Pin1

    2.5 定點(diǎn)突變檢測胡桃醌與Pin1的結(jié)合殘基

    為了進(jìn)一步驗(yàn)證胡桃醌與 Pin1相互作用的結(jié)合模型,采用定點(diǎn)突變技術(shù)將His59、Leu61、Cys113、Ser114和Ser154突變?yōu)楸彼釟埢H缓髮⒑阴渭拥絇in1野生型和突變體中,測量內(nèi)源熒光光譜。如果突變體熒光滴定結(jié)果與Pin1野生型差異較大,表明該殘基是胡桃醌主要作用殘基,反之,則表明該殘基不是關(guān)鍵殘基。如圖5所示,突變體C113A與Pin1野生型和其它突變體結(jié)果差異較大,表明胡桃醌結(jié)合的關(guān)鍵殘基為Cys113。這個(gè)結(jié)果與之前文獻(xiàn)報(bào)道是一致的,進(jìn)一步揭示胡桃醌結(jié)合Cys113殘基,導(dǎo)致Pin1酶活降低[7]。

    圖5 胡桃醌對Pin1及其突變體熒光滴定結(jié)果Fig.5 Fluorescence titration between juglone and Pin1 and mutants

    2.6 分子動力學(xué)模擬

    分子動力學(xué)模擬可以模擬藥物與蛋白在生理狀態(tài)下,隨時(shí)間變化的結(jié)合情況[25]。均方根偏差(RMSD)可以反映藥物與蛋白結(jié)合穩(wěn)定性。如圖6a所示,Pin1-胡桃醌(Pin1-Julgone)體系和Pin1體系在20 ns模擬時(shí)間中,RMSD值變化幅度不大,表明胡桃醌可以穩(wěn)定的結(jié)合到Pin1中。然而,C113A-胡桃醌(C113A-Julgone)體系在模擬時(shí)間內(nèi),RMSD值變化幅度明顯大于Pin1-胡桃醌和Pin1體系,表明Cys113殘基突變會影響胡桃醌對Pin1的結(jié)合。這個(gè)結(jié)果印證了突變體熒光滴定實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步表明胡桃醌結(jié)合的關(guān)鍵殘基是Cys113。均方根波動(RMSF)可以反映藥物與蛋白結(jié)合的柔韌性。如圖6c所示,Pin1-胡桃醌體系中的His59、Leu61、Cys113、Ser114和Ser154的RMSF明顯低于Pin1體系,表明胡桃醌可以穩(wěn)定的結(jié)合到這些關(guān)鍵殘基。

    圖6 胡桃醌對Pin1的分子動力學(xué)模擬Fig.6 Molecular dynamics simulation between juglone and Pin1

    蛋白質(zhì)回旋半徑(Rg)能反映藥物與蛋白結(jié)合的緊湊程度。如圖6b,Pin1-胡桃醌體系的Rg值略微低于Pin1體系,表明胡桃醌結(jié)合到Pin1,促使其結(jié)構(gòu)變得略緊湊。藥物與蛋白結(jié)合關(guān)鍵作用力之一是氫鍵,分析氫鍵的變化能揭示結(jié)合的穩(wěn)定性。如圖6d,Pin1-胡桃醌體系的氫鍵在模擬時(shí)間內(nèi)一直存在,且平均值為2.51,非常接近對接模型的結(jié)果,表明氫鍵是胡桃醌與Pin1的作用力之一。

    使用MM/PBSA方法,預(yù)測了Pin1-胡桃醌和C113A-胡桃醌體系結(jié)合自由能。如表2所示,Pin1-胡桃醌和C113A-胡桃醌體系的結(jié)合自由能(ΔGbind)分別為-62.93和-14.54 kJ/mol,表明Cys113殘基突變會顯著性減少結(jié)合自由能。此外,Pin1-胡桃醌體系中的范德華能(ΔEvdw),電勢能(ΔEele),極性溶劑能(ΔGpolar)和非極性溶劑能(ΔGnonpolar)分別為-78.36 kJ/mol,-1.05 kJ/mol,22.69 kJ/mol和-6.38 kJ/mol。表明胡桃醌結(jié)合到Pin1過程中,范德華力具有十分重要的作用。此外,Pin1-胡桃醌體系中的非極性自由能(ΔEvdw+ΔGnonpolar)和極性自由能(ΔEele+ΔGpolar)分別為-84.74和21.69 kJ/mol。表明胡桃醌結(jié)合到Pin1過程中,非極性自由能利于結(jié)合,而極性自由能不利于結(jié)合。

    表2 MM/PBSA結(jié)合自由能分析(kJ/mol)Table 2 Analysis of binding energy using MM/PBSA method

    3 結(jié)論

    本文通過熒光光譜,圓二色譜,分子對接和分子動力學(xué)模擬等技術(shù),研究胡桃醌與Pin1的相互作用。熒光光譜結(jié)果表明,胡桃醌對Pin1的熒光淬滅機(jī)制是典型的靜態(tài)淬滅,兩者形成Pin1-胡桃醌復(fù)合物。同步熒光光譜表明,胡桃醌結(jié)合到Pin1過程中淬滅了色氨酸和酪氨酸內(nèi)源熒光,最大波長輕微紅移,導(dǎo)致其構(gòu)象改變。此外,圓二色譜結(jié)果表明,胡桃醌結(jié)合到Pin1中,導(dǎo)致α-螺旋含量降低。熱力學(xué)參數(shù),分子對接和分子動力學(xué)模擬結(jié)果表明,胡桃醌結(jié)合到 Pin1過程中,疏水作用力,氫鍵和范德華力是最要作用力。對接模型,突變體熒光滴定和分子動力學(xué)模擬結(jié)果揭示了胡桃醌主要作用于Cys113殘基。本研究提供了Pin1與胡桃醌相互作用的一些數(shù)據(jù),有助于進(jìn)一步了解胡桃醌對Pin1抑制機(jī)理,為綜合利用我國胡桃楸和核桃資源開發(fā)功能性食品、藥品提供一定的科學(xué)依據(jù)。

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