• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    光譜法結(jié)合計(jì)算模擬探究胡桃醌與脯氨酰順反異構(gòu)酶1的相互作用

    2021-09-02 03:44:08蔣曉玙馬超余凱周安朱國飛
    現(xiàn)代食品科技 2021年8期
    關(guān)鍵詞:作用力殘基氫鍵

    蔣曉玙,馬超,余凱,周安,朱國飛

    (1.貴陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院生化工程系,貴州貴陽 550081)(2.貴州理工學(xué)院食品藥品制造工程學(xué)院,貴州貴陽 550003)

    關(guān)鍵字:胡桃醌;脯氨酰順反異構(gòu)酶1(Pin1);光譜學(xué);計(jì)算模擬;定點(diǎn)突變

    胡桃楸和核桃在我國資源豐富,很多部分均可食用,具有很高的營養(yǎng)價(jià)值。大量研究結(jié)果表明,其含有的有效成分胡桃醌(Julgone,又名5-羥基-1,4-萘醌,屬于萘醌類化合物),不僅具有顯著的抗菌、止血功能,還具有較好的抗腫瘤功效,能有效地抑制胃癌,肝癌,卵巢癌,宮頸癌,肺癌,結(jié)腸癌等惡性腫瘤的增殖[1-3]。然而,胡桃醌的這種抗腫瘤作用的分子機(jī)制任然還不是很清楚。

    脯氨酰順反異構(gòu)酶 1(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1,Pin1)可以特異性調(diào)節(jié)磷酸化蛋白質(zhì)中絲氨酸或蘇氨酸-脯氨酸模體(pSer/Thr-Pro)從順式構(gòu)象轉(zhuǎn)為反式構(gòu)象,從而調(diào)節(jié)該蛋白功能,影響一系列信號通路[4]。Pin1的底物蛋白在有絲分裂、轉(zhuǎn)錄、分化和DNA損傷應(yīng)答等各種生物功能起著重要的作用。尤其值得注意的是,Pin1在原癌基因信號通路中也起著關(guān)鍵的作用,并且在乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和甲狀腺癌等多種腫瘤細(xì)胞中過量表達(dá),其表達(dá)量高低與腫瘤惡性程度成正相關(guān),而抑制腫瘤細(xì)胞中 Pin1蛋白的活性能夠觸發(fā)細(xì)胞凋亡[5,6]。盡管研究表明,胡桃醌可作為 Pin1小分子抑制劑,能有效抑制其活性,從而抑制腫瘤增殖,但是胡桃醌與Pin1具體作用機(jī)制還知之甚少[7]。

    為了從分子水平上探究胡桃醌對 Pin1的抑制機(jī)制,本研究采用最常用的光譜法結(jié)合計(jì)算模擬探究了胡桃醌與 Pin1的互作機(jī)理[8,9]。在本研究中,首先使用熒光光譜推斷出Pin1與胡桃醌的淬滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)以及熱力學(xué)參數(shù)等信息。其次,使用同步熒光光譜和圓二色譜探究胡桃醌對 Pin1構(gòu)象的影響。再次,利用分子對接預(yù)測出潛在的結(jié)合位點(diǎn),并對潛在的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了定點(diǎn)突變,構(gòu)建了H59A,L61A,C113A,S114和S154A等多個(gè)突變體,然后通過突變體熒光滴定對結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證。最后,采用分子動力學(xué)模擬探究 Pin1與胡桃醌在體外隨時(shí)間變化的結(jié)合信息。申炳俊等探究了胡桃醌與人血清白蛋白的相互作用研究[3],為從分子水平上了解胡桃醌在體內(nèi)可能的運(yùn)轉(zhuǎn)、代謝、排泄等提供了信息。本研究將從分子水平上探究胡桃醌與Pin1的相互作用,為闡明胡桃醌的抗腫瘤作用提供參考,為擴(kuò)大胡桃醌的應(yīng)用,綜合開發(fā)利用我國胡桃楸和核桃資源,研發(fā)具有防癌、抑癌、治癌功能的保健食品、藥品提供相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 材料與儀器

    試劑:三羥甲基氨基甲烷(Tris)和二甲基亞砜(DMSO)購買自Sigma公司;胡桃醌(Julgone)購買自源葉公司;胰蛋白胨和酵母提取物購買自O(shè)XOID公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和氨芐青霉素購買自生工公司;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

    儀器:日立F-4700熒光光譜儀,Jasco J-815圓二色譜儀,戴爾T440塔式服務(wù)器。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 Pin1及其突變體原核表達(dá)與純化

    Pin1及其突變體H59A、L61A、C113A、S114和S154A重組質(zhì)粒pET-19b由實(shí)驗(yàn)室保存。首先將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3),然后接種在含氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中,待其長到對數(shù)期時(shí),18 ℃,加入IPTG誘導(dǎo)10 h。離心收集菌體,然后重懸菌體,超聲破碎,高速離心,棄沉淀,收集上清。將上清液倒入 Ni2+-NTA-Sepharose親和層析柱中,先用 20 mmol/L咪唑溶液洗脫雜蛋白,再用400 mmol/L咪唑溶液洗脫目的蛋白,最后使用超濾管去除咪唑溶液。

    1.2.2 熒光光譜

    在石英比色皿中,加入200 μL的5 μmol/L Pin1溶液,每次滴加適量的1 mmol/L胡桃醌溶液,測量熒光光譜,控制胡桃醌終濃度為 0、5、10、15、20和30 μmol/L。內(nèi)源熒光光譜采用295 nm作為激發(fā)波長,掃描波長為 310~400 nm。同步熒光光譜測定使用Δλ=15 nm和Δλ=60 nm,掃描范圍分別為270~310 nm和250~310 nm。激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫分別設(shè)置為5和10 nm,激發(fā)電壓為700 V,掃描速度為1200 r/mim。

    1.2.3 圓二色譜

    在比色皿中,加入200 μL的10 μmol/L Pin1溶液,每次滴定適量的1 mmol/L胡桃醌溶液,測量圓二色譜,控制胡桃醌終濃度為0、10和30 μmol/L。掃描速度設(shè)置為200 nm/min,響應(yīng)時(shí)間設(shè)置為2 s,掃描波長為200~260 nm。

    1.2.4 分子對接

    Pin1的三維結(jié)構(gòu)(PDB_ID:4TNS)下載自PDB蛋白數(shù)據(jù)庫[10]。胡桃醌的三維結(jié)構(gòu)(ZINC_ID:ZINC526257)下載自ZINC數(shù)據(jù)庫[11]。使用ADT工具對Pin1蛋白進(jìn)行預(yù)處理,包括去除配體,去除結(jié)晶水,加氫,加電荷以及確定對接盒子。使用AutoDock Vina 1.0軟件進(jìn)行分子對接[12]。

    1.2.5 分子動力學(xué)模擬

    使用GROMACS 4.6.5程序?qū)Ψ肿訉又蟮慕Y(jié)合模型進(jìn)行分子動力學(xué)模擬,使用 pdb2gmx和Ambertools程序分別獲取Pin1和胡桃醌參數(shù)文件[13]。Pin1與胡桃醌復(fù)合物的分子力場選用AMBER99SB,并進(jìn)行20 ns分子動力學(xué)模擬。使用GROMACS 4.6.5自帶的工具進(jìn)行模擬分析。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 熒光發(fā)射光譜檢測胡桃醌與Pin1相互作用

    熒光發(fā)射光譜能夠監(jiān)測蛋白結(jié)構(gòu)中發(fā)色基團(tuán)微環(huán)境的改變。Pin1蛋白包含三個(gè)色氨酸殘基和三個(gè)酪氨酸殘基,具有內(nèi)源熒光現(xiàn)象。當(dāng)激發(fā)波長為295 nm,主要呈現(xiàn)色氨酸殘基微環(huán)境變化。如圖1a所示,隨著胡桃醌濃度的增加,Pin1的內(nèi)源熒光強(qiáng)度逐漸下降。表明胡桃醌結(jié)合到Pin1中,導(dǎo)致Pin1熒光淬滅。

    熒光淬滅可以分為兩種,動態(tài)淬滅和靜態(tài)淬滅,可以根據(jù)Stern-Volmer方程計(jì)算淬滅常數(shù)(Ksv)和動態(tài)熒光淬滅速率常數(shù)(Kq)得出。公式如下所示:

    式中,F(xiàn)為有胡桃醌時(shí)Pin1的熒光強(qiáng)度;F0為無胡桃醌時(shí)Pin1的熒光強(qiáng)度;τ0為胡桃醌不存在時(shí)熒光體的熒光壽命,約為10-8s[14];[Q]為胡桃醌濃度。

    根據(jù)公式 1,以F0/F對[Q]進(jìn)行線性擬合,做出Stern-Volmer圖,根據(jù)擬合直線的斜率可以得出不同溫度下的Ksv和Kq值。如圖1b和表1所示,在293 K,胡桃醌對Pin1淬滅常熟(Ksv)為1.36×104L/mol,隨著溫度的增加,Ksv值逐漸降低,表明溫度升高會導(dǎo)致胡桃醌對Pin1的淬滅程度降低,這是一個(gè)典型的靜態(tài)淬滅特征。此外,在293 K和303 K條件下,Kq值分別為 1.36×1012L/(mol·s)和 0.66×1012L/(mol·s),均遠(yuǎn)大于最大擴(kuò)散碰撞淬滅常數(shù)2×1010L/(mol·s)[14],進(jìn)一步表明胡桃醌對 Pin1的熒光淬滅過程是靜態(tài)淬滅過程。

    圖1 內(nèi)源熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence spectra

    對于靜態(tài)淬滅過程,可以使用 Lineweaver-Burk雙對數(shù)方程計(jì)算結(jié)合常數(shù)(Ka)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n),公式如下所示:

    式中,F(xiàn)為有胡桃醌時(shí)Pin1的熒光強(qiáng)度;F0為無胡桃醌時(shí)Pin1的熒光強(qiáng)度;[Q]為胡桃醌濃度。

    根據(jù)公式2,以lg[(F0-F)/F]對lg[Q]進(jìn)行線性擬合,做出 Lineweaver-Burk雙對數(shù)圖,以擬合直線的斜率和截距可以得出不同溫度下的n和Ka值。如圖1c和表1所示,在293 K條件下,Ka值為2.32×104L/mol,隨著溫度的增加,Ka值逐漸降低,表明溫度升高會導(dǎo)致胡桃醌對Pin1的結(jié)合程度降低,這也是靜態(tài)淬滅的典型特征之一。此外,在293 K和303 K條件下,n值分別為0.85和0.80,均接近1,表明胡桃醌對Pin1的結(jié)合只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

    表1 胡桃醌與Pin1相互作用熱力學(xué)參數(shù)Table 1 Thermodynamic parameters between juglone and Pin1

    藥物與蛋白質(zhì)之間的作用力主要有氫鍵,范德華力,疏水作用力和靜電作用力,它們可以通過 Van’t Hoff方程計(jì)算焓變(ΔH),熵變(ΔS)和吉布斯自由能(ΔG)來判斷[15]。公式如下所示:

    式中,Ka為公式2中計(jì)算的結(jié)合常數(shù);T為實(shí)驗(yàn)溫度;R為氣體常數(shù)。

    根據(jù)公式3~5,可以分別計(jì)算出ΔH,ΔS和ΔG,結(jié)果如表1所示。在293 K和303 K條件下,ΔG分別為-24.49和-22.80 kJ/mol,表明胡桃醌與Pin1的結(jié)合是自發(fā)結(jié)合過程。根據(jù)Ross等歸納出來的熱力學(xué)規(guī)律[16,17]:當(dāng)ΔH>0和ΔS>0時(shí),作用力為疏水作用力;當(dāng)ΔH<0和ΔS>0時(shí),作用力為靜電作用力;當(dāng)ΔH<0和ΔS<0時(shí),作用力為氫鍵和范德華力。在293 K條件下,ΔH和 ΔS分別是 12.97 kJ/mol和 127.83 J/(mol·K)。這個(gè)結(jié)果表明胡桃醌與Pin1的結(jié)合過程中,主要的作用力是疏水作用力。此外,胡桃醌化學(xué)結(jié)構(gòu)表明其有一個(gè)疏水性萘醌環(huán)組成,并含有一個(gè)羥基。因此,除了疏水作用力,氫鍵作用也不應(yīng)該排除,詳細(xì)的作用力類型將在對接模型和MM/PBSA結(jié)合自由能中進(jìn)一步討論。

    2.2 同步熒光光譜檢測胡桃醌對 Pin1構(gòu)象的影響

    同步熒光光譜可以檢測蛋白質(zhì)中色氨酸或酪氨酸微環(huán)境構(gòu)象的變化。當(dāng)Δλ(Δλ=λem–λex)分別等于15 nm和60 nm時(shí),分別表示色氨酸和酪氨酸同步熒光光譜。如圖2a所示,當(dāng)Δλ=15 nm時(shí),隨著胡桃醌濃度的增大,酪氨酸熒光強(qiáng)度逐漸降低,表明胡桃醌可以淬滅酪氨酸內(nèi)源熒光。并且,最大發(fā)射波長從 291 nm輕微紅移至293 nm,表明酪氨酸殘基周圍微環(huán)境疏水性降低,極性增加。如圖2b所示,當(dāng)Δλ=60 nm時(shí),隨著胡桃醌濃度的增大,色氨酸熒光強(qiáng)度逐漸降低,表明胡桃醌可以淬滅色氨酸內(nèi)源熒光。與酪氨酸同步熒光類似,最大發(fā)射波長從281 nm輕微紅移至283 nm,表明色氨酸殘基周圍微環(huán)境疏水性降低,極性增加。

    圖2 胡桃醌與Pin1相互作用同步熒光光譜。Fig.2 Synchronous fluorescence spectra between juglone and Pin1

    2.3 圓二色譜檢測胡桃醌對 Pin1二級結(jié)構(gòu)的影響

    圓二色譜是最常見的檢測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化的技術(shù)之一[18,19]。如圖3所示,Pin1的圓二色譜在208和222 nm附近有兩個(gè)負(fù)峰,是典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)。隨著胡桃醌濃度的增加,譜圖中負(fù)峰強(qiáng)度減弱,表明胡桃醌與Pin1結(jié)合會導(dǎo)致Pin1的α-螺旋結(jié)構(gòu)減少??赡苁呛阴c Pin1中α-螺旋結(jié)構(gòu)中的氨基酸發(fā)生氫鍵締合等作用,引起Pin1空間變化,α-螺旋數(shù)量下降[20,21]。為了進(jìn)一步定量α-螺旋含量的變化,使用如下兩個(gè)公式計(jì)算:

    圖3 胡桃醌與Pin1相互作用圓二色譜Fig.3 Circular dichroism between juglone and Pin1

    式中,Cp表示Pin1摩爾濃度(10 μM);n表示Pin1氨基酸殘基數(shù)(163);l表示樣品池的厚度(0.1 cm);MRE208表示蛋白質(zhì)在208 nm處的平均殘基橢圓率。

    根據(jù)公式6和7,計(jì)算Pin1中α-螺旋含量。如圖3所示,當(dāng)加入胡桃醌和Pin1的摩爾比分別為1:0、1:1和1:3時(shí),對應(yīng)的Pin1的α-螺旋含量為23.44%、20.11%和17.82%。表明胡桃醌會導(dǎo)致Pin1中的α-螺旋含量減少。同時(shí)譜圖形狀和峰尖位置沒有明顯變化,也進(jìn)一步說明胡桃醌主要影響Pin1中的α-螺旋結(jié)構(gòu)。

    2.4 分子對接預(yù)測胡桃醌與Pin1的結(jié)合模型

    分子對接是最常見預(yù)測藥物和蛋白結(jié)合的方法之一[22-24]。利用AutoDock Vina對胡桃醌和Pin1進(jìn)行分子對接,預(yù)測兩者結(jié)合模型和作用機(jī)制。如圖4A所示,胡桃醌進(jìn)入 Pin1疏水空腔中,并且與關(guān)鍵殘基His59、Leu61、Cys113、Ser114和Ser154相互接觸。為了進(jìn)一步分析胡桃醌與 Pin1中關(guān)鍵殘基作用力類型,詳細(xì)的結(jié)果展現(xiàn)在圖4B中,胡桃醌與Cys113、Ser114和Ser154形成三個(gè)氫鍵,以及與Cys113形成一個(gè)Pi-Alkyl鍵(一種疏水作用力),與His59和Leu61形成范德華力。這個(gè)結(jié)果與熱力學(xué)參數(shù)結(jié)論一致,表明胡桃醌與Pin1的作用力類型主要是疏水作用力,氫鍵和范德華力。

    圖4 胡桃醌與Pin1相互作用預(yù)測結(jié)合模型Fig.4 Predicted binding model between juglone and Pin1

    2.5 定點(diǎn)突變檢測胡桃醌與Pin1的結(jié)合殘基

    為了進(jìn)一步驗(yàn)證胡桃醌與 Pin1相互作用的結(jié)合模型,采用定點(diǎn)突變技術(shù)將His59、Leu61、Cys113、Ser114和Ser154突變?yōu)楸彼釟埢H缓髮⒑阴渭拥絇in1野生型和突變體中,測量內(nèi)源熒光光譜。如果突變體熒光滴定結(jié)果與Pin1野生型差異較大,表明該殘基是胡桃醌主要作用殘基,反之,則表明該殘基不是關(guān)鍵殘基。如圖5所示,突變體C113A與Pin1野生型和其它突變體結(jié)果差異較大,表明胡桃醌結(jié)合的關(guān)鍵殘基為Cys113。這個(gè)結(jié)果與之前文獻(xiàn)報(bào)道是一致的,進(jìn)一步揭示胡桃醌結(jié)合Cys113殘基,導(dǎo)致Pin1酶活降低[7]。

    圖5 胡桃醌對Pin1及其突變體熒光滴定結(jié)果Fig.5 Fluorescence titration between juglone and Pin1 and mutants

    2.6 分子動力學(xué)模擬

    分子動力學(xué)模擬可以模擬藥物與蛋白在生理狀態(tài)下,隨時(shí)間變化的結(jié)合情況[25]。均方根偏差(RMSD)可以反映藥物與蛋白結(jié)合穩(wěn)定性。如圖6a所示,Pin1-胡桃醌(Pin1-Julgone)體系和Pin1體系在20 ns模擬時(shí)間中,RMSD值變化幅度不大,表明胡桃醌可以穩(wěn)定的結(jié)合到Pin1中。然而,C113A-胡桃醌(C113A-Julgone)體系在模擬時(shí)間內(nèi),RMSD值變化幅度明顯大于Pin1-胡桃醌和Pin1體系,表明Cys113殘基突變會影響胡桃醌對Pin1的結(jié)合。這個(gè)結(jié)果印證了突變體熒光滴定實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步表明胡桃醌結(jié)合的關(guān)鍵殘基是Cys113。均方根波動(RMSF)可以反映藥物與蛋白結(jié)合的柔韌性。如圖6c所示,Pin1-胡桃醌體系中的His59、Leu61、Cys113、Ser114和Ser154的RMSF明顯低于Pin1體系,表明胡桃醌可以穩(wěn)定的結(jié)合到這些關(guān)鍵殘基。

    圖6 胡桃醌對Pin1的分子動力學(xué)模擬Fig.6 Molecular dynamics simulation between juglone and Pin1

    蛋白質(zhì)回旋半徑(Rg)能反映藥物與蛋白結(jié)合的緊湊程度。如圖6b,Pin1-胡桃醌體系的Rg值略微低于Pin1體系,表明胡桃醌結(jié)合到Pin1,促使其結(jié)構(gòu)變得略緊湊。藥物與蛋白結(jié)合關(guān)鍵作用力之一是氫鍵,分析氫鍵的變化能揭示結(jié)合的穩(wěn)定性。如圖6d,Pin1-胡桃醌體系的氫鍵在模擬時(shí)間內(nèi)一直存在,且平均值為2.51,非常接近對接模型的結(jié)果,表明氫鍵是胡桃醌與Pin1的作用力之一。

    使用MM/PBSA方法,預(yù)測了Pin1-胡桃醌和C113A-胡桃醌體系結(jié)合自由能。如表2所示,Pin1-胡桃醌和C113A-胡桃醌體系的結(jié)合自由能(ΔGbind)分別為-62.93和-14.54 kJ/mol,表明Cys113殘基突變會顯著性減少結(jié)合自由能。此外,Pin1-胡桃醌體系中的范德華能(ΔEvdw),電勢能(ΔEele),極性溶劑能(ΔGpolar)和非極性溶劑能(ΔGnonpolar)分別為-78.36 kJ/mol,-1.05 kJ/mol,22.69 kJ/mol和-6.38 kJ/mol。表明胡桃醌結(jié)合到Pin1過程中,范德華力具有十分重要的作用。此外,Pin1-胡桃醌體系中的非極性自由能(ΔEvdw+ΔGnonpolar)和極性自由能(ΔEele+ΔGpolar)分別為-84.74和21.69 kJ/mol。表明胡桃醌結(jié)合到Pin1過程中,非極性自由能利于結(jié)合,而極性自由能不利于結(jié)合。

    表2 MM/PBSA結(jié)合自由能分析(kJ/mol)Table 2 Analysis of binding energy using MM/PBSA method

    3 結(jié)論

    本文通過熒光光譜,圓二色譜,分子對接和分子動力學(xué)模擬等技術(shù),研究胡桃醌與Pin1的相互作用。熒光光譜結(jié)果表明,胡桃醌對Pin1的熒光淬滅機(jī)制是典型的靜態(tài)淬滅,兩者形成Pin1-胡桃醌復(fù)合物。同步熒光光譜表明,胡桃醌結(jié)合到Pin1過程中淬滅了色氨酸和酪氨酸內(nèi)源熒光,最大波長輕微紅移,導(dǎo)致其構(gòu)象改變。此外,圓二色譜結(jié)果表明,胡桃醌結(jié)合到Pin1中,導(dǎo)致α-螺旋含量降低。熱力學(xué)參數(shù),分子對接和分子動力學(xué)模擬結(jié)果表明,胡桃醌結(jié)合到 Pin1過程中,疏水作用力,氫鍵和范德華力是最要作用力。對接模型,突變體熒光滴定和分子動力學(xué)模擬結(jié)果揭示了胡桃醌主要作用于Cys113殘基。本研究提供了Pin1與胡桃醌相互作用的一些數(shù)據(jù),有助于進(jìn)一步了解胡桃醌對Pin1抑制機(jī)理,為綜合利用我國胡桃楸和核桃資源開發(fā)功能性食品、藥品提供一定的科學(xué)依據(jù)。

    猜你喜歡
    作用力殘基氫鍵
    教材和高考中的氫鍵
    基于各向異性網(wǎng)絡(luò)模型研究δ阿片受體的動力學(xué)與關(guān)鍵殘基*
    “殘基片段和排列組合法”在書寫限制條件的同分異構(gòu)體中的應(yīng)用
    高考中微粒間作用力大小與物質(zhì)性質(zhì)的考查
    蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)序列與殘基種類間關(guān)聯(lián)的分析
    基于支持向量機(jī)的蛋白質(zhì)相互作用界面熱點(diǎn)殘基預(yù)測
    院感防控有兩種作用力
    二水合丙氨酸復(fù)合體內(nèi)的質(zhì)子遷移和氫鍵遷移
    銥(Ⅲ)卟啉β-羥乙與基醛的碳?xì)滏I活化
    非穩(wěn)定流固耦合作用力下風(fēng)力機(jī)收縮盤接觸分析
    激情 狠狠 欧美| 久99久视频精品免费| 一级毛片久久久久久久久女| 偷拍熟女少妇极品色| 在线观看美女被高潮喷水网站| 亚洲最大成人av| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 99九九线精品视频在线观看视频| 中国美女看黄片| 99久久精品国产国产毛片| 久久久久九九精品影院| 三级毛片av免费| 99热全是精品| 最近最新中文字幕大全电影3| 女人被狂操c到高潮| 老女人水多毛片| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲美女搞黄在线观看 | 成人永久免费在线观看视频| 国产精品国产高清国产av| 亚洲电影在线观看av| av中文乱码字幕在线| 日本与韩国留学比较| 2021天堂中文幕一二区在线观| 免费av毛片视频| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 久久韩国三级中文字幕| 国产视频内射| 亚洲av电影不卡..在线观看| 人人妻人人看人人澡| 又黄又爽又免费观看的视频| 97碰自拍视频| 日本 av在线| 久久久久久大精品| 综合色丁香网| 久99久视频精品免费| 人妻久久中文字幕网| 欧美国产日韩亚洲一区| 观看免费一级毛片| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| avwww免费| 久久久久久国产a免费观看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 日韩亚洲欧美综合| 91精品国产九色| 国内精品久久久久精免费| 成人永久免费在线观看视频| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产淫片久久久久久久久| 免费看日本二区| 99热这里只有是精品50| 黄色配什么色好看| 日韩一本色道免费dvd| 精品国产三级普通话版| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚州av有码| 亚洲精品一区av在线观看| 在线天堂最新版资源| 亚洲第一区二区三区不卡| 日本五十路高清| 久久久久久久久久黄片| 国产黄a三级三级三级人| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久久久九九精品影院| 午夜福利成人在线免费观看| 直男gayav资源| 亚洲精品国产av成人精品 | 日本精品一区二区三区蜜桃| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 日本一二三区视频观看| 综合色av麻豆| 亚洲欧美精品综合久久99| 免费一级毛片在线播放高清视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 深夜a级毛片| 色综合站精品国产| 老司机午夜福利在线观看视频| 99热这里只有是精品50| 99久久精品一区二区三区| 国产一区二区在线观看日韩| 国产伦一二天堂av在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 中出人妻视频一区二区| 欧美成人精品欧美一级黄| 99久久精品国产国产毛片| av卡一久久| 六月丁香七月| 日韩欧美精品免费久久| 成人午夜高清在线视频| av在线播放精品| 日日摸夜夜添夜夜爱| 欧美成人a在线观看| 国产精品久久久久久av不卡| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 国产一区二区三区av在线 | 欧美高清成人免费视频www| 久久99热6这里只有精品| 91麻豆精品激情在线观看国产| 看十八女毛片水多多多| av在线亚洲专区| 国产在视频线在精品| 人妻久久中文字幕网| 成人亚洲精品av一区二区| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产亚洲欧美98| 美女高潮的动态| 国产精品久久久久久久久免| 午夜爱爱视频在线播放| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲最大成人手机在线| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美另类亚洲清纯唯美| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 日韩人妻高清精品专区| 国产私拍福利视频在线观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 99热全是精品| 国产精品人妻久久久久久| 国产精品一区二区性色av| 亚洲美女视频黄频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 免费看美女性在线毛片视频| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 精品久久久久久久久久免费视频| 大香蕉久久网| 午夜影院日韩av| 国产私拍福利视频在线观看| 男插女下体视频免费在线播放| 少妇人妻精品综合一区二区 | 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲欧美清纯卡通| 丝袜喷水一区| 成人特级黄色片久久久久久久| 欧美bdsm另类| 中国国产av一级| 麻豆国产av国片精品| 久久久a久久爽久久v久久| 内射极品少妇av片p| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久久久久久久大av| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲一区高清亚洲精品| 内地一区二区视频在线| 伦理电影大哥的女人| 久久久午夜欧美精品| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 两个人视频免费观看高清| 久久精品国产亚洲网站| 韩国av在线不卡| 老女人水多毛片| 亚洲色图av天堂| 美女黄网站色视频| 美女 人体艺术 gogo| 看片在线看免费视频| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 干丝袜人妻中文字幕| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产麻豆成人av免费视频| 91在线观看av| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲人成网站在线播| 看免费成人av毛片| 久久这里只有精品中国| 男人的好看免费观看在线视频| 午夜视频国产福利| 成人国产麻豆网| 最近手机中文字幕大全| 免费av观看视频| 亚洲自拍偷在线| 欧美在线一区亚洲| 日韩大尺度精品在线看网址| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲精品国产成人久久av| 桃色一区二区三区在线观看| 婷婷亚洲欧美| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 麻豆成人午夜福利视频| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲综合色惰| 国产中年淑女户外野战色| 伊人久久精品亚洲午夜| 免费高清视频大片| 成人二区视频| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说 | 日本与韩国留学比较| 美女内射精品一级片tv| 看片在线看免费视频| 最新中文字幕久久久久| 亚洲成人久久爱视频| 看免费成人av毛片| 九九热线精品视视频播放| 欧美色欧美亚洲另类二区| 色综合色国产| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产亚洲欧美98| 婷婷精品国产亚洲av| 黑人高潮一二区| 日本欧美国产在线视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 美女黄网站色视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 成年版毛片免费区| 露出奶头的视频| 国产91av在线免费观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 精品久久久久久成人av| 日韩av不卡免费在线播放| av在线播放精品| 国内精品久久久久精免费| 欧美+亚洲+日韩+国产| 一个人观看的视频www高清免费观看| 99精品在免费线老司机午夜| 久久久久久久久大av| 夜夜夜夜夜久久久久| 在线天堂最新版资源| 日韩欧美免费精品| 亚洲在线观看片| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 99久国产av精品| 在线观看免费视频日本深夜| 日日摸夜夜添夜夜爱| a级一级毛片免费在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 久久久久九九精品影院| 免费无遮挡裸体视频| 久久精品影院6| 干丝袜人妻中文字幕| 亚洲第一区二区三区不卡| 综合色丁香网| 老女人水多毛片| 美女大奶头视频| 精品欧美国产一区二区三| 伊人久久精品亚洲午夜| av在线天堂中文字幕| 国产成人a区在线观看| 午夜影院日韩av| 国产精品嫩草影院av在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产欧美日韩精品亚洲av| 免费黄网站久久成人精品| av天堂在线播放| 99久久精品国产国产毛片| 久久久久国产网址| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产色婷婷99| 日韩制服骚丝袜av| 免费观看的影片在线观看| 日韩成人伦理影院| 亚洲精品粉嫩美女一区| 久久久a久久爽久久v久久| 国产一区二区三区av在线 | 国产亚洲精品综合一区在线观看| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲久久久久久中文字幕| av天堂在线播放| 在现免费观看毛片| 在线观看免费视频日本深夜| 美女内射精品一级片tv| 色综合色国产| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产探花极品一区二区| 精品乱码久久久久久99久播| 天堂影院成人在线观看| 一区福利在线观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲欧美精品自产自拍| 成人无遮挡网站| 久久久久久久久久成人| 综合色av麻豆| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 在线观看一区二区三区| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲av中文av极速乱| 男人的好看免费观看在线视频| 少妇高潮的动态图| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲成av人片在线播放无| 久久精品影院6| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 最近视频中文字幕2019在线8| 国产色爽女视频免费观看| 国产不卡一卡二| 色视频www国产| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产探花极品一区二区| 日本免费a在线| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚州av有码| 亚洲国产精品国产精品| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 色视频www国产| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲av免费在线观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 日本与韩国留学比较| 成人性生交大片免费视频hd| 精品不卡国产一区二区三区| 99riav亚洲国产免费| 白带黄色成豆腐渣| 成人午夜高清在线视频| 大香蕉久久网| 欧美日韩乱码在线| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲真实伦在线观看| 中国美女看黄片| 亚洲国产精品合色在线| 男女之事视频高清在线观看| 精品久久久噜噜| 久久欧美精品欧美久久欧美| 能在线免费观看的黄片| 婷婷精品国产亚洲av| 天堂√8在线中文| 亚洲天堂国产精品一区在线| 成人三级黄色视频| 久久久久性生活片| 1000部很黄的大片| 好男人在线观看高清免费视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 日产精品乱码卡一卡2卡三| 久99久视频精品免费| 1000部很黄的大片| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 午夜精品在线福利| av在线蜜桃| 男人的好看免费观看在线视频| 小说图片视频综合网站| 午夜免费激情av| 亚洲av二区三区四区| 久久6这里有精品| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲欧美日韩卡通动漫| h日本视频在线播放| 69人妻影院| 内射极品少妇av片p| 91久久精品国产一区二区三区| 国产精品野战在线观看| 国产精品日韩av在线免费观看| 成人欧美大片| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 少妇的逼水好多| 有码 亚洲区| 一级毛片aaaaaa免费看小| 欧美精品国产亚洲| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 国产欧美日韩精品亚洲av| 成人美女网站在线观看视频| 免费av毛片视频| av黄色大香蕉| 精品午夜福利在线看| 97超碰精品成人国产| 国产精品,欧美在线| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| avwww免费| 老司机福利观看| 一a级毛片在线观看| 91精品国产九色| 亚洲乱码一区二区免费版| 成人av在线播放网站| 我的老师免费观看完整版| 99在线视频只有这里精品首页| 色哟哟哟哟哟哟| 精品一区二区三区视频在线| 国产午夜福利久久久久久| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久精品91蜜桃| 久久午夜亚洲精品久久| 中文字幕av成人在线电影| 久99久视频精品免费| 日韩av不卡免费在线播放| 热99re8久久精品国产| 午夜福利在线在线| 麻豆av噜噜一区二区三区| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产精品伦人一区二区| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 香蕉av资源在线| 日本一本二区三区精品| 久久精品影院6| 99久久精品一区二区三区| 亚洲无线在线观看| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 尾随美女入室| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产高清不卡午夜福利| 最近在线观看免费完整版| 在线观看av片永久免费下载| 久久精品国产亚洲网站| www日本黄色视频网| 成熟少妇高潮喷水视频| 精品一区二区免费观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 十八禁网站免费在线| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产一区二区三区av在线 | 赤兔流量卡办理| 一进一出好大好爽视频| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 黑人高潮一二区| 成人欧美大片| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲人成网站在线观看播放| 免费看美女性在线毛片视频| 精品福利观看| 亚洲欧美清纯卡通| 久久精品人妻少妇| 国产单亲对白刺激| 免费av毛片视频| 久久久精品大字幕| 综合色av麻豆| 黄色一级大片看看| 亚洲欧美清纯卡通| 欧美+亚洲+日韩+国产| 欧美3d第一页| 精品国产三级普通话版| 亚洲在线观看片| 成人特级av手机在线观看| 日韩欧美在线乱码| 丝袜美腿在线中文| 国产午夜福利久久久久久| 国产美女午夜福利| 在线观看av片永久免费下载| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 97碰自拍视频| 最后的刺客免费高清国语| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 一进一出抽搐动态| 白带黄色成豆腐渣| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 免费人成在线观看视频色| 一进一出好大好爽视频| 91精品国产九色| 午夜福利在线在线| 麻豆国产av国片精品| 在线天堂最新版资源| 久久韩国三级中文字幕| 日韩欧美在线乱码| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 麻豆av噜噜一区二区三区| 日韩av不卡免费在线播放| 国产亚洲精品久久久com| .国产精品久久| а√天堂www在线а√下载| 免费观看精品视频网站| 国产成人91sexporn| 如何舔出高潮| 麻豆久久精品国产亚洲av| 高清毛片免费观看视频网站| 婷婷亚洲欧美| 精品免费久久久久久久清纯| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 精品乱码久久久久久99久播| 看黄色毛片网站| 亚洲精品国产av成人精品 | 麻豆精品久久久久久蜜桃| 黄片wwwwww| 精品久久久久久久久久免费视频| 久久久精品欧美日韩精品| 色综合色国产| 男人和女人高潮做爰伦理| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲成av人片在线播放无| 免费搜索国产男女视频| 日本成人三级电影网站| 乱系列少妇在线播放| 午夜福利18| 精品午夜福利视频在线观看一区| 免费电影在线观看免费观看| 成人精品一区二区免费| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 大香蕉久久网| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲精品成人久久久久久| 久久久久久久亚洲中文字幕| 久久久精品欧美日韩精品| 网址你懂的国产日韩在线| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲精品成人久久久久久| 久久久久久久亚洲中文字幕| 一级毛片久久久久久久久女| 国产熟女欧美一区二区| 美女 人体艺术 gogo| 成人国产麻豆网| 99精品在免费线老司机午夜| 一区二区三区四区激情视频 | 国产精品三级大全| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 内射极品少妇av片p| 男人的好看免费观看在线视频| av天堂在线播放| 国产乱人偷精品视频| 欧美性猛交黑人性爽| 国内精品一区二区在线观看| 国产片特级美女逼逼视频| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产在视频线在精品| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 免费av不卡在线播放| 51国产日韩欧美| 国产精品av视频在线免费观看| 国产精品野战在线观看| 久久韩国三级中文字幕| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 成年av动漫网址| 亚洲熟妇熟女久久| 少妇熟女aⅴ在线视频| 久久国内精品自在自线图片| 欧美日本亚洲视频在线播放| 日韩欧美国产在线观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 成年版毛片免费区| 久久精品夜色国产| 免费av毛片视频| 91在线观看av| 午夜福利视频1000在线观看| 最好的美女福利视频网| 日本一本二区三区精品| 精品免费久久久久久久清纯| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲欧美精品综合久久99| 哪里可以看免费的av片| 亚洲最大成人中文| 简卡轻食公司| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 中文字幕久久专区| 欧美在线一区亚洲| 男女啪啪激烈高潮av片| 久久久久精品国产欧美久久久| 中国国产av一级| 亚洲国产高清在线一区二区三| 欧美中文日本在线观看视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产精品1区2区在线观看.| 午夜激情福利司机影院| 久久中文看片网| 色5月婷婷丁香| 一本一本综合久久| 亚洲成人中文字幕在线播放| av专区在线播放| 国产精品久久视频播放| 最好的美女福利视频网| 成人美女网站在线观看视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 久久99热6这里只有精品| 丰满人妻一区二区三区视频av| 久久亚洲国产成人精品v| 卡戴珊不雅视频在线播放| 亚洲av中文av极速乱| 国产综合懂色| 69人妻影院| 日韩av不卡免费在线播放| 日韩欧美国产在线观看| 男女之事视频高清在线观看| 午夜福利高清视频| 日本在线视频免费播放| 国产精品女同一区二区软件| 精品熟女少妇av免费看| 91精品国产九色| 色综合站精品国产| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 99热这里只有是精品在线观看| 日韩三级伦理在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 插逼视频在线观看| 久久草成人影院| 97在线视频观看| 小说图片视频综合网站| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 特级一级黄色大片| 老司机影院成人| 婷婷六月久久综合丁香| 国产午夜精品论理片| 国产欧美日韩一区二区精品| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲性久久影院| 99在线视频只有这里精品首页| 国产精品av视频在线免费观看| 欧美日韩国产亚洲二区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 精品一区二区免费观看| 国产探花极品一区二区| 51国产日韩欧美| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲经典国产精华液单| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲熟妇熟女久久| 九九在线视频观看精品| 久久草成人影院| 国产精品爽爽va在线观看网站|