牛乳中β-乳球蛋白檢測(cè)方法的建立

楊?lèi)?ài)君，紀(jì)坤發(fā)，楊美豐，利志鋒，邢益俊，何瑛

（廣東燕塘乳業(yè)股份有限公司，廣東廣州 510700）

牛乳中蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，是人類(lèi)不可缺少的營(yíng)養(yǎng)食品。牛乳蛋白質(zhì)主要有酪蛋白和乳清蛋白，其中酪蛋白成分約80%，乳清蛋白成分約20%；乳清蛋白中的β-乳球蛋白是主要組分，約占乳清蛋白的50%[1]。牛乳中的β-乳球蛋白分子質(zhì)量約為180000 u，等電點(diǎn)為5.1~5.3，一共由162個(gè)氨基酸殘基組成，有2個(gè)遺傳變異體。β-乳球蛋白在牛乳中主要以二聚體形式存在，由非共價(jià)鍵連接的2個(gè)單位亞基組成。在pH<3.5或pH>8.0時(shí)，β-乳球蛋白二聚體解離成單體。每個(gè)單體含有 2個(gè)二硫鍵Cys66-Cys160和Cys106-Cys199，還有1個(gè)Cys121自由硫氫基[2]。β-乳球蛋白具有多種生物學(xué)活性，在食品加工中有一定的應(yīng)用；同時(shí)還具有降血壓、抗菌、抗氧化、抗癌、免疫調(diào)節(jié)、降膽固醇等功效[3]。研究發(fā)現(xiàn)，β-乳球蛋白是牛乳中主要的熱敏感蛋白質(zhì)，過(guò)度加熱會(huì)造成β-乳球蛋白變性并與乳中其他蛋白質(zhì)形成大分子結(jié)構(gòu)[4-6]。因此，檢測(cè)牛乳中β-乳球蛋白含量可以判斷牛乳熱處理程度，對(duì)研究牛乳熱處理方式的選擇具有重大的意義。

目前，檢測(cè)牛乳中β-乳球蛋白含量還沒(méi)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，已發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)中有農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1663-2008《乳與乳制品中β-乳球蛋白的測(cè)定 聚丙烯胺凝膠電泳法》[7]和團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/TDSTIA 007-2019《奶及奶制品中β-乳球蛋白的測(cè)量 液相色譜法》[8]。其中《乳與乳制品中β-乳球蛋白的測(cè)定 聚丙烯胺凝膠電泳法》試樣用SDS-PAGE凝膠電泳后，用光密度計(jì)對(duì)β-乳球蛋白進(jìn)行測(cè)定分析而求得β-乳球蛋白的含量，該標(biāo)準(zhǔn)液態(tài)樣品的檢出限為240 mg/L，固液態(tài)和固體樣品的檢出限為2400 mg/kg[7]；《奶及奶制品中β-乳球蛋白的測(cè)量 液相色譜法》通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行調(diào)酸到 pH至 4.60時(shí)，酪蛋白及變性的乳清蛋白可以通過(guò)沉淀去除，濾液中未變性的β-乳球蛋白經(jīng)離心后在高效液相色譜儀上，經(jīng)蛋白質(zhì)分離柱分離，選擇210 nm檢測(cè)波長(zhǎng)，紫外光檢測(cè)，外標(biāo)法定量，該標(biāo)準(zhǔn)生乳、液態(tài)奶的定量限為25.0 mg/kg，乳粉的定量限為50.0 mg/kg[8]。前者操作方法繁雜，檢出限高，后者檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，均不適用于企業(yè)日?？焖俜治鰴z測(cè)。

本文主要是開(kāi)發(fā)用超高效液相色譜法（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）來(lái)測(cè)定牛乳中β-乳球蛋白的含量的方法[9-19]。該方法前處理簡(jiǎn)便、分析時(shí)間短、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、精密度好，能夠準(zhǔn)確而又快速檢測(cè)牛乳中β-乳球蛋白含量。根據(jù)GB/T 27417-2017《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》[20]通過(guò)加標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果從線(xiàn)性范圍、精密度、正確度三個(gè)方面來(lái)驗(yàn)證方法的可行性。該方法為乳及乳制品中β-乳球蛋白檢測(cè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Waters H-CLASS超高效液相色譜儀（配有PDA檢測(cè)器），美國(guó)Waters公司；Waters BEH C4色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm粒徑），美國(guó)Waters公司；Mettler Tledo XSR205DU電子分析天平，瑞士Mettler Tledo公司；Minipole 超純水系統(tǒng)，默克化工；Sigma 2-16KL冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司；移液器，德國(guó)Brand公司；Waters GHP針式濾膜，美國(guó)Waters公司。

乙腈、三氟乙酸（色譜純），德國(guó) Merck公司；冰醋酸（優(yōu)級(jí)純），廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)；β-乳球蛋白（L-046-100 MG），純度：97.23%，Sigm a-Aldrich公司；本試驗(yàn)中用水符合GB/T 6682-2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》[21]中一級(jí)水的規(guī)定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)原理

牛乳中酪蛋白的等電點(diǎn)為4.60，因此當(dāng)牛乳試樣pH至4.60時(shí)，酪蛋白及變性的乳清蛋白可以通過(guò)沉淀去除，濾液中未變性的β-乳球蛋白經(jīng)超高效液相色譜儀分離，經(jīng) PDA檢測(cè)器測(cè)定，外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)定量[8]。

1.2.2 試樣前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g試樣于50 mL離心管，加水至25 mL，混勻后再加入冰醋酸調(diào)節(jié)pH為4.60±0.05，渦旋震蕩1 min，然后室溫靜置60 min，待試樣沉淀分層，將試樣高速離心（10000 r/min，4 ℃，15 min），取1 mL上清液，稀釋至適當(dāng)濃度，過(guò)0.20 μm針式濾膜，進(jìn)行UPLC檢測(cè)[5]。

1.2.3 溶劑的配制

很多朋友對(duì)排卵期出血并不陌生，也有一些病人跑來(lái)門(mén)診就說(shuō)：“醫(yī)生，我排卵期出血，要吃什么藥？”其實(shí)，排卵期出血應(yīng)該是一種排除性疾病，就是說(shuō)需要排除其他可能引起月經(jīng)間期出血的疾病之后才能判斷下來(lái)。

流動(dòng)相①（0.1%三氟乙酸水溶液）：取900 mL一級(jí)水倒入1 L的容量瓶中，加入1 mL三氟乙酸后立即蓋上蓋子，輕搖至三氟乙酸全部溶解沒(méi)有霧氣，用一級(jí)水定容至刻度線(xiàn)，將容量瓶中的溶液全部轉(zhuǎn)移至棕色藍(lán)蓋瓶中，超聲脫氣10 min；流動(dòng)相②（0.085%三氟乙酸乙腈溶液）：取900 mL乙腈倒入1 L的容量瓶中，加入0.85 mL三氟乙酸后立即蓋上蓋子，輕搖至三氟乙酸全部溶解沒(méi)有霧氣，用乙腈定容至刻度線(xiàn)，將容量瓶中的溶液全部轉(zhuǎn)移至棕色藍(lán)蓋瓶中，超聲脫氣10 min；強(qiáng)洗溶液（90%乙腈水溶液）：取900 mL乙腈倒入1 L的容量瓶中，用一級(jí)水定容至刻度線(xiàn)，將容量瓶中的溶液全部轉(zhuǎn)移至棕色藍(lán)蓋瓶中，超聲脫氣 15 min；弱洗溶液（10%乙腈水溶液）：取100 mL乙腈倒入1 L的容量瓶中，用一級(jí)水定容至刻度線(xiàn)，將容量瓶中的溶液全部轉(zhuǎn)移至棕色藍(lán)蓋瓶中，超聲脫氣15 min。

1.2.4 色譜條件

經(jīng)過(guò)測(cè)試，超高效液相色譜儀的色譜條件如表1。

表1 洗脫梯度Table 1 Elution gradient

色譜柱：Waters BEH C4 100 mm×2.1 mm，1.7 μm粒徑；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：60 ℃；流速：0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；流動(dòng)相：流動(dòng)相①為0.1%三氟乙酸水溶液、流動(dòng)相②為0.085%三氟乙酸乙腈溶液；洗脫梯度：見(jiàn)表1。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的制作

1.3.1β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（9211.57 mg/L）的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取94.74 mg的β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（純度：97.23%）于50 mL的燒杯中，記錄稱(chēng)樣量，用少量一級(jí)水進(jìn)行溶解，并轉(zhuǎn)移定容到10 mL容量瓶中，得到濃度為9211.57 mg/L的β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液；

1.3.2β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制

取2 mL超高效液相色譜儀進(jìn)樣瓶5個(gè)，用移液器分別準(zhǔn)確吸取 8.14 μL、16.28 μL、24.42 μL、32.56 μL、65.12 μLβ-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液（9211.57 mg/L），用一級(jí)水定容至1.5 mL，配置成濃度為50、100、150、200、400 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液通過(guò)超高效液相色譜儀分析，以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液色譜峰面積為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)。

1.4 計(jì)算

1.4.1 試樣檢測(cè)

將待測(cè)溶液上機(jī)檢測(cè)，根據(jù)計(jì)算公式得到試樣中β-乳球蛋白的含量。

1.4.2 計(jì)算公式

試樣中的β-乳球蛋白的含量X按以下公式計(jì)算：

式中：X表示試樣中β-乳球蛋白的含量，mg/kg；c表示待測(cè)樣液中β-乳球蛋白濃度，mg/L；V表示加入水后定容體積，mL；m表示吸取試樣的質(zhì)量，g；F表示待測(cè)上清液稀釋倍數(shù)；β-乳球蛋白的含量以β-乳球蛋白A和β-乳球蛋白B含量之和計(jì)。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理

本方法所有試驗(yàn)均重復(fù)測(cè)定 6次，采用 Waters Empowe 3（版本號(hào)：7.30.00.00）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)GB/T 27417-2017《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》[20]通過(guò)加標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果從線(xiàn)性范圍、精密度、正確度三個(gè)方面來(lái)驗(yàn)證方法的可行性。

2.1 濃度范圍、變異系數(shù)、回歸方程、相關(guān)系數(shù)

對(duì)β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液每個(gè)濃度點(diǎn)按 1.2.4的色譜條件重復(fù)測(cè)定 6次，得到標(biāo)準(zhǔn)工作溶液每個(gè)濃度點(diǎn)的色譜平均峰面積及其變異系數(shù)（CV），標(biāo)準(zhǔn)工作溶液色譜平均峰面積如表2，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液色譜圖如圖1。

圖1 β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖50（mg/L）Fig.1 Standard working solution chromatogram 50 (mg/L)

表2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液色譜平均峰面積Table 2 Average peak area of standard working solution chromatography

從表2可知，本方法采用校準(zhǔn)曲線(xiàn)法定量，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的濃度范圍為50~400 mg/L，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液每個(gè)濃度點(diǎn)重復(fù)測(cè)定 6次，變異系數(shù)（CV）在0.04%~0.23%之間符合標(biāo)準(zhǔn)要求，適合用于實(shí)際分析檢測(cè)。

以β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液色譜平均峰面積為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，做線(xiàn)性回歸方程，得到β-乳球蛋白測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)濃度范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)。β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)濃度范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)如表3，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)如圖2。

從表3、圖2得到β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的濃度范圍（50~400 mg/L）、回歸方程（y=6E-05x+4.2877）、相關(guān)系數(shù)（R2=1.00）。本方法用校準(zhǔn)曲線(xiàn)法定量，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)在50~400 mg/L的濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性良好，R2等于1.00，符合GB/T 27417-2017《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》[20]采用校準(zhǔn)曲線(xiàn)法定量，線(xiàn)性回歸方程的相關(guān)系數(shù)不低于0.99的要求，可用于實(shí)際分析檢測(cè)。

表3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)濃度范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)Table 3 Standard working curve concentration range,regression equation, correlation coefficient

圖2 β-乳球蛋白的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)Fig.2 Standard working curve for-lactoglobulin

2.2 準(zhǔn)確性和精密度

2.2.1 試樣的檢測(cè)

因?yàn)楦邷丶訜釙?huì)使牛乳中β-乳球蛋白失去活性，所以分別使用某公司生產(chǎn)的超高溫滅菌乳和巴氏殺菌乳按1.2的試驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品設(shè)置6個(gè)平行試驗(yàn)，并與第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)（北京畜牧研究所）的結(jié)果對(duì)比，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4，超高溫滅菌乳、巴氏殺菌乳β-乳球蛋白色譜圖見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 超高溫滅菌乳β-乳球蛋白色譜圖Fig.3 Chromatogram of high temperature sterilization milk β-lactoglobulin

圖4 巴氏殺菌乳β-乳球蛋白色譜圖Fig.4 Chromatogram of pasteurized milk β-lactoglobulin

從圖3、圖4、表4可知超高溫滅菌乳的β-乳球蛋白含量為25.39 mg/kg，變異系數(shù)為0.92%，巴氏殺菌乳的β-乳球蛋白含量為3541.39 mg/kg，變異系數(shù)為0.14%,兩種殺菌乳的重復(fù)測(cè)試穩(wěn)定性較好，變異系數(shù)<1%,符合實(shí)際分析的要求；兩種殺菌乳的檢測(cè)結(jié)果與第三方機(jī)構(gòu)檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異，偏差<1%。

表4 超高溫滅菌乳、巴氏殺菌乳β-乳球蛋白含量Table 4 The content of ultra-high temperature sterilization milk and pasteurized milk-lactoglobulin

2.2.2 回收率和變異系數(shù)

從 2.2.1的試驗(yàn)結(jié)果默認(rèn)超高溫滅菌乳為低本底β-乳球蛋白含量，巴氏殺菌乳為高本底β-乳球蛋白含量，添加β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率測(cè)定，超高溫滅菌乳β-乳球蛋白的具體添加量為200，300，400 mg/kg，巴氏殺菌乳β-乳球蛋白的具體添加量為2500，3200，4000 mg/kg，每個(gè)濃度的陽(yáng)性試樣設(shè)置六個(gè)平行試驗(yàn)，計(jì)算陽(yáng)性試樣的加標(biāo)回收率及變異系數(shù)（CV），以評(píng)估方法精密度和正確度。陽(yáng)性試樣的加標(biāo)回收率及變異系數(shù)（CV），見(jiàn)表5。

表5 陽(yáng)性試樣添加回收試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Positive sample addition recovery test results

根據(jù)GB/T 27417-2017《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》附錄 A要求，當(dāng)被測(cè)組分加標(biāo)濃度>100 mg/kg時(shí)，被測(cè)組分加標(biāo)回收率范圍在95%~105%之間；標(biāo)準(zhǔn)的附錄B要求，被測(cè)組分含量在 100 mg/kg~1000 mg/kg時(shí)，測(cè)試結(jié)果的變異系數(shù)<3.8%；當(dāng)被測(cè)組分含量在0.1%~1%時(shí)，測(cè)試結(jié)果的變異系數(shù)<2.7%[6]。

從表5可知，低本底的超高溫滅菌乳β-乳球蛋白陽(yáng)性試樣的平均加標(biāo)回收率在97.15%~99.11%之間，變異系數(shù)（CV）在0.53%~0.71%之間；高本底的巴氏殺菌乳β-乳球蛋白陽(yáng)性試樣的平均加標(biāo)回收率在96.56%~98.43%之間，變異系數(shù)（CV）在0.04%~0.15%之間?？梢?jiàn)陽(yáng)性試樣的本底值無(wú)論高還是低，本方法的精密度和正確度均符合上述標(biāo)準(zhǔn)要求。本方法加標(biāo)回收率穩(wěn)定，重現(xiàn)性高，可作為實(shí)際試樣的準(zhǔn)確定量檢測(cè)方法。

2.3 討論

目前測(cè)定β-乳球蛋白含量的方法很多，高星等建立的超高效液相色譜法可以快速檢測(cè)牛乳中β-乳球蛋白含量，該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性（R2=0.99）,方法回收率（70%~90%），變異系數(shù)（CV=0.93%~3.22%），檢出限為40.0 mg/kg[22]；趙大偉等研究設(shè)計(jì)了可用于分析牛乳中β-乳球蛋白的高效液相色譜法，該方法分析時(shí)間長(zhǎng)（t=30 min）,標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性（R2=0.99）,暫無(wú)寫(xiě)出方法回收率，變異系數(shù)（CV=2.9%）[23]；孫國(guó)慶等研究設(shè)計(jì)了可分析牛乳中β-乳球蛋白的毛細(xì)管電泳法，該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性（R2=0.99）,方法回收率（75.2%~105.2%），變異系數(shù)（CV=1.09%~3.1%）[24]。而我們建立的使用超高效液相色譜法對(duì)牛乳中β-乳球蛋白進(jìn)行檢測(cè)的方法，其標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性（R2=1.00）,方法回收率（96.56%~99.11%），變異系數(shù)（CV=0.04%~0.71%），分析檢測(cè)時(shí)間（t=9 min），檢出限為20.41 mg/kg，方法定量限為61.23 mg/kg，均比上述方法有一定的優(yōu)勢(shì)，具有前處理簡(jiǎn)便、分析時(shí)間短、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、精密度好等優(yōu)點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確而又快速檢測(cè)牛乳中β-乳球蛋白含量。

3 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜法檢測(cè)巴氏殺菌乳和超高溫滅菌乳中β-乳球蛋白含量的方法。通過(guò)驗(yàn)證表明，該方法線(xiàn)性關(guān)系良好（R2=1.00），平均回收率在96.56%~99.11%之間，變異系數(shù)在0.04%~0.71%之間，β-乳球蛋白方法檢出限為20.41 mg/kg（S/N=3），方法定量限為61.23 mg/kg，符合標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27417-2017《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》的要求。該方法簡(jiǎn)便易行、定量準(zhǔn)確、精密度好，可用于液態(tài)乳中β-乳球蛋白的定量分析測(cè)定。