益氣除痰方聯(lián)合CTL免疫過(guò)繼療法對(duì)肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制

李雪松 周迎春 李婳婳 李溪

(1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

國(guó)家癌癥中心發(fā)布的2015年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)今肺癌發(fā)病率與死亡率均居我國(guó)惡性腫瘤的首位〔1〕，其中非小細(xì)胞肺癌占臨床肺癌患者的80%～90%。由于早期診斷困難，且缺乏有效的治療措施，癌癥患者總體預(yù)后較差。益氣除痰方是由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科所創(chuàng)制的治療肺癌的經(jīng)驗(yàn)方，前期研究表明，益氣除痰方在臨床治療中具有良好療效〔2，3〕。近年來(lái)，基于免疫細(xì)胞在惡性腫瘤治療方面的巨大潛力，免疫細(xì)胞過(guò)繼療法已成為繼手術(shù)、放療和化療之外的一種新的治療方法〔4〕。同時(shí)，傳統(tǒng)中醫(yī)藥聯(lián)合細(xì)胞治療的方法也被越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)研究所證實(shí)。本文擬探究益氣除痰方聯(lián)合細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

1 資料與方法

1.1細(xì)胞株 人源性肺腺癌A549細(xì)胞由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科惠贈(zèng)。A549細(xì)胞中加入含10%胎牛血清(FBS)RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱飽和濕度下培養(yǎng)、傳代，待細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，于細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2藥物 西洋參、法半夏、浙貝、山慈菇、茯苓等均購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)鑒定均為正品。

1.3動(dòng)物 SPF及SD雌性大鼠20只，體重200～220 g，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(粵)2008-0020。

1.4主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基(Thermo公司，批號(hào)：NZ3422)，RPMI1640(Gibco公司，批號(hào)：D6429)，F(xiàn)BS(Corning公司，批號(hào)：C11875)，磷酸鹽緩沖液(PBS，Corning公司，批號(hào)：210-040-cvc)，青鏈霉素(Penicillin G/sterptomycin，Gibco公司，批號(hào)：FBSSA500-S)，重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白、重組人白細(xì)胞介素(IL)-4蛋白(近岸蛋白質(zhì)科技有限公司，批號(hào)：0331243/0331322)、Anti-Human CD3PE-Cy5、Anti-Human CD8a FITC、Anti-Human CD28PE、Anti-Human CD86PE、Anti-Human CD11c APC(BioGems公司，批號(hào)：05131-65-100、10131-50-100、10311-60-100、02911-50-100、03231-80-100)。

1.5主要儀器 Herocell 240型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(RADOBIO公司)，Mini型蛋白電泳系統(tǒng)(Bio-rad公司)，冷凍高速離心機(jī)(Microfuge 20R，美國(guó)Beckman Coulter公司)，RT-6000自動(dòng)酶標(biāo)儀(深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司)，倒置熒光顯微鏡(Ti2-U)(日本Nikon公司)，流式細(xì)胞儀(Cell Lab Quanta SC)(美國(guó)Beckman Coulter公司)。

1.6含藥血清的制備 益氣除痰方水煎煮2次。第1次8倍水提取1 h，第2次6倍水提取1 h，200目篩過(guò)濾，合并濾液后放入真空干燥打粉即得益氣除痰方凍干粉，密封干燥保存。1 g凍干粉相當(dāng)于5.12 g生藥。臨用前加入0.5%羧甲基纖維素鈉促溶，使用PBS調(diào)至所需濃度。大鼠灌胃生藥量為每天63 g/kg，以2.08 g/ml藥物濃度灌胃，2次/d，連續(xù)6 d，末次給藥1 h后腹主動(dòng)脈取血，4℃冰箱靜置2 h后3 000 r/min，離心15 min后分離血清，56℃水浴箱滅活血清30 min，0.22 μm濾膜除菌，分裝于1.5 ml EP管，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7樹(shù)突細(xì)胞制備 用密度梯度離心法經(jīng)Ficoll淋巴細(xì)胞分離液從健康成人外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中24 h，培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞分為貼壁細(xì)胞與非貼壁細(xì)胞，吸取非貼壁細(xì)胞即外周血淋巴細(xì)胞(PBLs)到另一培養(yǎng)瓶中，貼壁細(xì)胞即為外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)。加入含有25 ng/ml GM-CSF、50 ng/ml IL-4和10%FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基，每隔3 d半量換液1次。

1.8腫瘤全抗原制備 肺癌A549細(xì)胞株在RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)、傳代，消化收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)離心洗滌后封裝入1.5 ml凍存管中，放入液氮內(nèi)10 min后，馬上取出置入60℃水浴箱中10 min，該凍融步驟共重復(fù)3次，隨后將其放入離心機(jī)中12 000 r/min離心20 min，取上清液，0.22 μm濾膜過(guò)濾，所得液體即為腫瘤相關(guān)抗原；后利用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定腫瘤抗原濃度，取定濃度為100 μg/ml。

1.9CTL細(xì)胞的培養(yǎng) 將1.7中的非貼壁細(xì)胞(即T細(xì)胞)連同培養(yǎng)液一起吸入T75的培養(yǎng)瓶中，加入含有25 ng/ml IL-2的RPMI1640完全培養(yǎng)基，放置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每3天半量換液1次; 將體外培養(yǎng)5 d的T細(xì)胞與上述負(fù)載腫瘤抗原的成熟DCs進(jìn)行混合共培養(yǎng)，T細(xì)胞∶樹(shù)突細(xì)胞=10∶1，加入IL-2 25 ng/ml，每3天半量換液1次，共培養(yǎng)7 d，形成腫瘤特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞。

1.10顯微鏡下觀察A549細(xì)胞形態(tài) 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，按照1×105/ml接種于6孔板中，每孔2 ml，將6孔板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，第2天用30%空白血清、30%益氣除痰方含藥血清、CTL細(xì)胞、30%益氣除痰方含藥血清聯(lián)合CTL細(xì)胞分別處理A549細(xì)胞株48 h，后于顯微鏡下觀察各處理組A549細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)變化。

1.11Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)侵襲能力 將稀釋后的Matrigel基質(zhì)膠鋪在Transwell小室上室面，24孔板每孔40 μl，置于培養(yǎng)箱中過(guò)夜。用胰酶消化與分離不同處理組處理48 h后的A549細(xì)胞并計(jì)數(shù)，濃度為3×105/ml，取200 μl鋪于Transwell小室上室面；24孔板的下室面加入600 μl含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基；24 h后，用棉簽擦去Matrigel基質(zhì)膠和上室內(nèi)的培養(yǎng)液以及未穿過(guò)基質(zhì)膠的細(xì)胞。將小室放入加有4%多聚甲醛的燒杯里固定20 min。20 min后，將小室放入染色0.1%結(jié)晶紫染液中，染色20 min，后清洗干凈染液并于通風(fēng)處晾干，倒置顯微鏡下拍照，每孔拍3張100倍典型視野，取平均數(shù)作為該孔的穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.12Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)遷移能力 實(shí)驗(yàn)步驟同1.11，僅無(wú)需鋪置Matrigel基質(zhì)膠。

1.13PI單染流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)12 h待細(xì)胞貼壁后，用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，各組進(jìn)行處理，每組設(shè)5個(gè)平行孔，制成單細(xì)胞懸液，800 r/min，離心5 min，沉淀細(xì)胞；加入1 ml PBS充分重懸成單細(xì)胞，輕輕邊渦旋邊緩慢滴加3 ml預(yù)冷的無(wú)水乙醇，至終濃度75%，4℃靜置過(guò)夜。取出固定細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入500 μl染色工作液，37℃避光溫浴30 min，300目篩網(wǎng)過(guò)濾后流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，采用適當(dāng)分析軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA含量分析和光散射分析。

1.14AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)處理，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。1 ml預(yù)冷的PBS共洗滌2次，于細(xì)胞沉淀中加入1倍結(jié)合緩沖液工作液，重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度達(dá)到1×106/ml。取100 μl細(xì)胞懸液到一EP管中，加入5 μl AnnexinV-FITC和10 μl PI，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min；染色孵育后，每管加入400 μl 1倍結(jié)合緩沖液工作液，混勻后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果用Cell Quest軟件進(jìn)行分析。

1.15統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1樹(shù)突細(xì)胞培養(yǎng) 不成熟的樹(shù)突細(xì)胞在細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下逐漸成熟，鏡下觀察，樹(shù)突細(xì)胞表面有毛刺狀突起，呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)，見(jiàn)圖1。

圖1 樹(shù)突細(xì)胞倒置顯微鏡下形態(tài)(×100)

2.2CTL細(xì)胞培養(yǎng) 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定經(jīng)IL-2因子誘導(dǎo)，并與負(fù)載腫瘤抗原的樹(shù)突細(xì)胞共培養(yǎng)后，CD3+CD8+CD28+細(xì)胞的比例增高，鏡下觀察細(xì)胞體積變大，見(jiàn)圖2。

圖2 CTL細(xì)胞倒置顯微鏡下形態(tài)(×100)

2.3顯微鏡觀察各組A549細(xì)胞形態(tài) 當(dāng)A549細(xì)胞經(jīng)各組處理后，鏡下觀察到，30%空白血清組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，呈典型的鋪路石樣，細(xì)胞之間鏈接緊密，胞體飽滿；30%益氣除痰方含藥血清組及CTL細(xì)胞組細(xì)胞變細(xì)邊長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞間距變大；聯(lián)合組細(xì)胞不完整，胞膜破損，見(jiàn)圖3。

圖3 各處理組A549細(xì)胞顯微鏡下形態(tài)(×200)

2.4各組細(xì)胞侵襲能力比較 當(dāng)分別用30%空白血清、30%益氣除痰方含藥血清、CTL細(xì)胞、30%益氣除痰方含藥血清+CTL細(xì)胞處理A549細(xì)胞后，A549細(xì)胞株侵襲細(xì)胞數(shù)分別為(1 067.22±27.50)、(556.00±15.93)、(748.45±16.85)、(338.67±11.85)個(gè)，與30%空白血清組相比，其余3個(gè)處理組侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P<0.001)；且聯(lián)合組細(xì)胞侵襲數(shù)目最少，相較于30%益氣除痰方含藥血清組與CTL細(xì)胞組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)圖4。

圖4 各處理組A549細(xì)胞侵襲(結(jié)晶紫，×100)

2.5各組細(xì)胞遷移能力比較 當(dāng)分別用30%空白血清、30%益氣除痰方含藥血清、CTL細(xì)胞、30%益氣除痰方含藥血清+CTL細(xì)胞處理A549細(xì)胞后，A549細(xì)胞株遷移細(xì)胞數(shù)分別為(1469.78±8.03)、(651.00±10.40)、(735.33±7.23)、(350.22±16.32)個(gè)；與30%空白血清組相比，其余3個(gè)處理組侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；且聯(lián)合組遷移細(xì)胞數(shù)目最少，與30%益氣除痰方含藥血清組和CTL細(xì)胞組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)圖5。

圖5 各處理組A549細(xì)胞遷移(結(jié)晶紫，×100)

2.6流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定各處理組對(duì)A549細(xì)胞周期的影響 各處理組能夠誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞株阻滯于G0/G1期，各處理組相較于30%空白血清組，G0/G1期面積表現(xiàn)為不同程度的增大，其中30%益氣除痰方含藥血清組最明顯，有(61.53±2.45)%細(xì)胞阻滯于G0/G1期；聯(lián)合組比例為(55.51±0.82)%分布于G0/G1期，相較于30%空白血清組的(49.22±1.61)%差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，P<0.05)，CTL細(xì)胞組有(54.68±4.14)%分布于G0/G1期，與30%空白血清組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；對(duì)于S期，4個(gè)處理組的分布比例分別為(24.28±1.95)、(19.60±0.28)、(25.46±1.83)、(29.68±1.46)，30%益氣除痰方含藥血清組S期細(xì)胞分布比例最小，聯(lián)合組比例最大，與30%空白血清組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；對(duì)于G2/M期，30%益氣除痰方含藥血清組分布比例最大(12.71±0.17)%，相比30%空白血清組(10.48±0.96)%差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；CTL細(xì)胞組與聯(lián)合組細(xì)胞分布比例小于30%空白血清組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.001)，見(jiàn)圖6。

圖6 各處理組對(duì)細(xì)胞周期的影響

2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各處理組A549細(xì)胞凋亡率 當(dāng)分別用30%空白血清、30%益氣除痰方含藥血清、CTL細(xì)胞、聯(lián)合(30%益氣除痰方含藥血清+CTL細(xì)胞)處理A549細(xì)胞后，各處理組的細(xì)胞凋亡率分別為(4.92±1.85)%、(22.61±1.88)%、(31.60±1.00)%、(44.20±2.75)%，與30%空白血清組相比，其余各處理組的細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.001)；30%益氣除痰方含藥血清組細(xì)胞凋亡率顯著低于CTL細(xì)胞組(P<0.001)；聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率最高，與30%益氣除痰方含藥血清組、CTL細(xì)胞組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)圖7。

圖7 各處理組對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響

3 討 論

肺癌在中醫(yī)古籍見(jiàn)于“肺積”“息賁”“肺癰”“勞嗽”等疾病。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肺脾兩臟在氣的生成及津液循行等方面關(guān)系密切，肺癌發(fā)病不離肺脾，肺脾氣虛或氣機(jī)不暢，均可使痰濁內(nèi)生，聚而成積；肺主宣發(fā)、通百脈，痰濁郁結(jié)于肺，常表現(xiàn)為氣郁痰瘀互結(jié)。故肺癌之治療，既離不開(kāi)除痰、解毒，祛邪以扶正；也離不開(kāi)益氣、健脾，扶正以祛邪。益氣除痰方作為我院治療腫瘤的經(jīng)驗(yàn)方，以補(bǔ)氣健脾、除痰通瘀為主治，在改善臨床癥狀、穩(wěn)定病灶、提高患者生存質(zhì)量和延長(zhǎng)生存期以及對(duì)化療增效減毒等方面均顯示了一定的作用。前期基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究中，進(jìn)一步證實(shí)了益氣除痰方能夠抑制血管新生、增強(qiáng)免疫功能、提高化療敏感性等〔5～7〕。近年來(lái)，免疫細(xì)胞過(guò)繼治療腫瘤成為廣大學(xué)者研究的熱點(diǎn)。Rohaan等〔8〕進(jìn)一步提出免疫細(xì)胞過(guò)繼療法在腫瘤治療方面的廣闊前景。因此，益氣除痰方扶正祛邪的功用，配合CTL免疫細(xì)胞過(guò)繼療法增強(qiáng)免疫的效能，兩者相輔相成，可能進(jìn)一步提高殺傷腫瘤的作用，目前已有類似研究報(bào)道〔9〕。

本研究結(jié)果表明，益氣除痰方聯(lián)合CTL細(xì)胞對(duì)肺腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)影響最為顯著，可以明顯抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲與遷移能力，提高凋亡率，影響細(xì)胞的分裂與增殖情況。