過表達(dá)亮氨酸拉鏈假定腫瘤抑制基因1對胰腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、遷移能力的影響

李強(qiáng)，張翠翠

作者單位：1棗莊市立醫(yī)院消化內(nèi)科，山東 棗莊277100；2棗莊礦業(yè)集團(tuán)棗莊醫(yī)院消化內(nèi)科，山東 棗莊277100

胰腺癌是一種具有較強(qiáng)侵襲能力的消化道腫瘤，近年來的發(fā)病率呈顯著上升趨勢。據(jù)統(tǒng)計，胰腺癌在2030年將成為導(dǎo)致人類死亡率增加的主要原因。胰腺癌預(yù)后較差。據(jù)報道，胰腺癌的5年生存率約為5%，大多數(shù)病人由于發(fā)生轉(zhuǎn)移而失去手術(shù)根治的機(jī)會，同時具有較高的復(fù)發(fā)率；放療和化療易產(chǎn)生細(xì)胞放療或化療抵抗性，從而降低腫瘤治療效果。胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中受到多種基因多階段精細(xì)調(diào)控，其發(fā)病機(jī)制尚不能完全明確。近年來，分子靶向具有特異性高、副作用小等特點(diǎn)成為腫瘤臨床治療研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，亮氨酸拉鏈假定腫瘤抑制基因1（leucinezipper putative tumor suppressor1，LZTS1）在多種腫瘤組織中表達(dá)量缺失，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在胰腺癌中，研究結(jié)果顯示LZTS1的表達(dá)量顯著降低，但其在胰腺癌中的具體作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究從2018年5—12月開展實(shí)驗，探討過表達(dá)LZTS1對胰腺癌PANC-1生物學(xué)特性的影響，旨在為臨床分子靶向治療胰腺癌提供實(shí)驗依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人胰腺癌PANC-1細(xì)胞購自北納生物有限公司，胎牛血清、Lipofectamine 2000、DMEM培養(yǎng)基、Trizol試劑購自美國Sigma公司，細(xì)胞凋亡試劑盒、噻唑藍(lán)（MTT）購自北京索萊寶公司；pcDNA3.0 LZTS1-1、pcDNA 3.0 LZTS1-2以及陰性對照購自廣州銳博有限公司，Matrigel膠購自美國BD公司，Transwell小室購自美國Coring公司，兔抗LZTS1抗體、兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購自美國Abcam公司。酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀購自美國Thermo公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1

細(xì)胞的培養(yǎng)PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，顯微鏡觀察到細(xì)胞密度約80%～90%，加入胰酶消化、傳代。

1.2.2

細(xì)胞的轉(zhuǎn)染取對數(shù)期PANC-1細(xì)胞，按隨機(jī)數(shù)字表法分為四組，即對照組（常規(guī)培養(yǎng)）、NC組（轉(zhuǎn)染陰性對照）、pcDNA-LZTS1-1組（轉(zhuǎn)染pcDNA 3.0 LZTS1-1質(zhì)粒）、pcDNA-LZTS1-2組（轉(zhuǎn)染pcDNA 3.0 LZTS1-2質(zhì)粒）。轉(zhuǎn)染前24 h，胰酶消化、計數(shù)，收集5×10個PANC-1細(xì)胞接種至6孔板。根據(jù)Lipofectamine 2000說明書指示，分別稀釋Lipofectamine 2000和質(zhì)粒，將兩稀釋液晃動混勻，吸取100 μL加入每孔細(xì)胞，37℃培養(yǎng)4～6 h，更換為完全培養(yǎng)基。

1.2.3

蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）收集轉(zhuǎn)染后的PANC-1細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白。將所提取的總蛋白與適量上樣緩沖液混勻，沸水變性10 min；提前配置8%～10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。將電泳的目的條帶轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜；轉(zhuǎn)膜完，置于5%脫脂奶粉溶液封閉2 h；加入一抗，LZTS1 1∶5 000，GAPDH 1∶10 000，4℃孵育過夜，洗膜緩沖液漂洗3次×10 min，加入二抗，37℃孵育2 h，洗膜緩沖液漂洗3次×10 min，暗室中加入化學(xué)發(fā)光工作液孵育5 min，曝光、拍照，分析LZTS1蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。

1.2.4

MTT法吸取5×10個各組PANC-1細(xì)胞接種至96孔板上，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時，加入10 μL MTT溶液（0.5% MTT），37℃孵育4 h，加入100 μL二甲基亞砜，酶標(biāo)儀中檢測570 nm PANC-1細(xì)胞吸光度。

1.2.5

流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗根據(jù)凋亡檢測試劑盒的說明書，將對數(shù)期PANC-1細(xì)胞密度調(diào)整為1×10個/毫升，加入10 μL膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）和5 μL碘化丙啶（PI），避光孵育10～15 min，上機(jī)檢測。

1.2.6

Transwell實(shí)驗將適量Matrigel膠與300 μL無血清培養(yǎng)基混勻；侵襲實(shí)驗前，吸取100 μL Matrigel膠稀釋液加入Transwell上室膜，37℃孵育5 h，但遷移實(shí)驗Transwell上室膜不添加Matrigel膠，其實(shí)驗方法同侵襲實(shí)驗。收集各組5×10個PANC-1細(xì)胞加入上室，500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基加入Transwell下室，37℃孵育24 h；磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）清洗上室，擦去殘留PANC-1細(xì)胞，拍照、計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染pcDNA

-

LZTS1對LZTS1表達(dá)量的影響

PANC-1細(xì) 胞 中 轉(zhuǎn) 染pcDNA 3.0 LZTS1-1和pcDNA 3.0 LZTS1-2質(zhì)粒，蛋白質(zhì)印跡法檢測轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果如圖1所示，四組LZTS1的表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

F

=107.509，

P

＜0.05）。與對照組（1.000±0.085）相比，NC組PANC-1細(xì)胞中LZTS1的表達(dá)量（1.025±0.107）未發(fā)生顯著變化（

P=

0.591）；pcDNA-LZTS1-1組（2.835±0.301）和pcDNA-LZTS1-2組（4.125±0.385）細(xì)胞中LZTS1的表達(dá)量較對照組明顯增加（均

P

＜0.001）；其中pcDNA-LZTS1-2對細(xì)胞中LZTS1表達(dá)量的促進(jìn)作用高于pcDNA-LZTS1-1，因此后續(xù)選用pcDNA-LZTS1-2作為實(shí)驗對象。

圖1 轉(zhuǎn)染pcDNA-LZTS1對人胰腺癌PANC-1細(xì)胞亮氨酸拉鏈假定腫瘤抑制基因1（LZTS1）表達(dá)量的影響

2.2 過表達(dá)LZTS1對PANC

-

1細(xì)胞增殖的影響

MTT法檢測過表達(dá)LZTS1對PANC-1細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果如表1所示，與對照組相比，NC組PANC-1細(xì)胞增殖未發(fā)生明顯變化（均

P

＞0.05）；pcDNA-LZTS1-2組細(xì)胞增殖較對照組明顯降低（均

P

＜0.05）。

表1 過表達(dá)亮氨酸拉鏈假定腫瘤抑制基因1（LZTS1）對人胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖的影響/±s

2.3 過表達(dá)LZTS1對PANC

-

1細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá)LZTS1對PANC-1細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，三組細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

F

=143.933，

P

＜0.05）。與對照組（6.589±0.645）%相比，NC組PANC-1細(xì)胞凋亡率（7.352±0.698）%無明顯變化（

P

＞0.05），pcDNA-LZTS1-2組（23.252±2.152）%明顯增加（

P

＜0.05）。

2.4 過表達(dá)LZTS1對PANC

-

1細(xì)胞遷移的影響

Transwell法實(shí)驗檢測過表達(dá)LZTS1對PANC-1細(xì)胞遷移的影響，結(jié)果顯示，三組遷移細(xì)胞數(shù)比較差異有 統(tǒng)計學(xué) 意義（

F

=30.167，

P

＜0.05）。與對照 組（233.258±25.148）個 相 比，NC組 遷 移 細(xì) 胞 數(shù)（252.321±26.241）個無明顯變化（

P

＞0.05），pcDNALZTS1-2組（120.145±14.210）個 降 低（

P

＜0.05）。見圖2。

2.5 過表達(dá)LZTS1對PANC

-

1細(xì)胞侵襲的影響

Transwell法實(shí)驗檢測過表達(dá)LZTS1對PANC-1細(xì)胞侵襲的影響，結(jié)果顯示，三組侵襲細(xì)胞數(shù)比較差異有 統(tǒng)計學(xué) 意義（

F

=35.735，

P

＜0.05）。與對照 組（117.258±12.152）個 相 比，NC組 侵 襲 細(xì) 胞 數(shù)（121.362±12.025）個無明顯變化（

P

＞0.05），pcDNALZTS1-2組（56.369±6.432）個 降 低（

P

＜0.05）。見圖2。

圖2 過表達(dá)亮氨酸拉鏈假定腫瘤抑制基因1（LZTS1）對人胰腺癌PANC-1細(xì)胞遷移和侵襲的影響（結(jié)晶紫染色×200）

3 討論

胰腺癌是一種嚴(yán)重危害人類身體健康的惡性腫瘤，給病人、社會帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。近年來，隨著生物領(lǐng)域的不斷發(fā)展，胰腺癌的臨床治療具有了顯著的發(fā)展，探究新的基因標(biāo)志物有助于腫瘤演進(jìn)機(jī)制的闡釋，還可以為胰腺癌的早期診斷、分子靶向治療提供潛在位點(diǎn)。LZTS1是近年來發(fā)現(xiàn)的新型抑癌基因，在正常組織中表達(dá)，但在多種腫瘤組織中表達(dá)量顯著降低，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。與鄰近正常結(jié)腸組織相比，LZTS1在結(jié)腸癌中表達(dá)量降低，且其表達(dá)量與病人的預(yù)后生存率相關(guān)；過表達(dá)LZTS1抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，敲低LZTS1促進(jìn)細(xì)胞的增殖，在結(jié)直腸癌的腫瘤生長過程中發(fā)揮抑制作用，可作為結(jié)直腸癌病人的潛在預(yù)后指標(biāo)。免疫組化檢測LZTS1在乳腺癌組織中的表達(dá)量，結(jié)果顯示，LZTS1表達(dá)量較對照顯著下降，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，表明LZTS1可能參與乳腺癌轉(zhuǎn)移過程。另外，LZTS1在甲狀腺癌、肝癌、乳腺癌等表達(dá)量均異常，提示LZTS1在多種腫瘤生長過程中發(fā)揮重要的作用。

當(dāng)機(jī)體發(fā)生病理變化時，組織中的細(xì)胞增殖與凋亡動態(tài)平衡被打破，從而影響機(jī)體的組織功能，誘導(dǎo)疾病的產(chǎn)生。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，細(xì)胞侵襲、遷移能力的提高可促進(jìn)腫瘤組織的進(jìn)一步轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響病人的預(yù)后，提高復(fù)發(fā)率。為探究LZTS1在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用，本實(shí)驗通過在胰腺癌PANC-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)入過表達(dá)LZTS1的質(zhì)粒pcDNA 3.0 LZTS1-1或pcDNA 3.0 LZTS1-2（攜帶不同的寡核苷酸序列），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pcDNA 3.0 LZTS1-2質(zhì)粒較pcDNA 3.0 LZTS1-1質(zhì)粒具有較好的促進(jìn)LZTS1表達(dá)的效果，因此后續(xù)實(shí)驗選取pcDNA 3.0 LZTS1-2質(zhì)粒作為實(shí)驗對象。MTT法和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗觀察過表達(dá)LZTS1表達(dá)量對細(xì)胞增殖、凋亡的影響，結(jié)果顯示，過表達(dá)LZTS1顯著抑制胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡；進(jìn)一步通過Transwell檢測發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)LZTS1顯著抑制胰腺癌PANC-1細(xì)胞侵襲、遷移，表明LZTS1通過抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移等惡性生物學(xué)特性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而阻礙胰腺癌的發(fā)生發(fā)展，與結(jié)直腸癌、乳腺癌等結(jié)果相似，均發(fā)揮抑癌作用。研究發(fā)現(xiàn)，LZTS1可通過調(diào)控Akt-mTOR、PI3K/Akt等信號通路抑制腫瘤細(xì)胞增殖，進(jìn) 一 步 提 示LZTS1在胰腺癌中也可能通過調(diào)控細(xì)胞增殖相關(guān)的信號通路，從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，但其具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。

綜上所述，過表達(dá)LZTS1顯著抑制胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力，促進(jìn)其凋亡，在胰腺癌腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抑制作用，為胰腺癌的臨床治療提供潛在的基因標(biāo)志物，但本研究只在細(xì)胞水平研究了LZTS1的腫瘤抑制作用，未來會深入研究LZTS1發(fā)揮腫瘤抑制作用的具體分子機(jī)制以及與相關(guān)信號通路的作用，并在多株胰腺癌細(xì)胞以及動物模型中開展LZTS1的相關(guān)研究。