液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)蜂蜜中酰胺醇類藥物殘留

◎ 劉 毅，張居舟

（安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽 合肥 230051）

蜂蜜是由蜜蜂采集蜜源植物的花蜜或蜜露后，將其貯存于蜂巢內(nèi)的巢脾中，并經(jīng)充分釀造而成。成熟蜂蜜是一種具有濃郁花香味的天然甜物質(zhì)，含有葡萄糖、氨基酸、礦物質(zhì)、果糖、酶類和抗氧化物等，是對(duì)人體有益的天然食品[1]。隨著生活水平的提高，人們對(duì)蜂蜜的需求量增長(zhǎng)迅速，對(duì)其品質(zhì)和質(zhì)量的要求也越來越高，蜂蜜中獸藥殘留也逐漸得到人們關(guān)注。

酰胺醇類曾被稱為氯霉素類抗生素，是抗生素的常用成分，對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌有很強(qiáng)的殺滅作用，因其廣譜的抗菌性被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床，但該類藥物經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體后會(huì)對(duì)人體健康構(gòu)成威脅[2]。酰胺醇類藥物在蜜蜂養(yǎng)殖過程中曾被廣泛使用，而農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號(hào)已明確指出氯霉素及其鹽、酯禁用于所有食品動(dòng)物[3]。為保障消費(fèi)者安全，控制酰胺醇類物質(zhì)在蜂產(chǎn)品中的使用，有必要建立一種靈敏、高效的酰胺醇類物質(zhì)殘留檢測(cè)技術(shù)。

目前，對(duì)蜂蜜等蜂產(chǎn)品中的多種酰胺醇類物質(zhì)（包括琥珀氯霉素，棕櫚氯霉素等）的檢測(cè)方法并不多，本文建立了一種基于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4]檢測(cè)蜂蜜中酰胺醇類藥物殘留的方法。試樣經(jīng)乙酸乙酯提取濃縮后用水溶解，Oasis HLB固相萃取柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，氯霉素用內(nèi)標(biāo)法定量，氟苯尼考、甲砜霉素、琥珀氯霉素、棕櫚氯霉素用外標(biāo)法定量[5]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Waters公司）。

氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素琥珀酸鈉和氯霉素棕櫚酸酯的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，氯霉素氚代內(nèi)標(biāo)（氯霉素-D5），均購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈、乙酸乙酯（色譜純，質(zhì)譜純），德國(guó)Merck公司；HLB固相萃取柱：Oasis HLB 6 mL/200 mg，美國(guó)Waters公司。其他所用試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制。分別稱取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素琥珀酸鈉和氯霉素棕櫚酸酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)5.0 mg，各自置于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成500 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)確稱取1.0 mg的氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，置于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解定容至刻度配成100 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

（2）混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液的配制。分別準(zhǔn)確移取適量的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素琥珀酸鈉和氯霉素棕櫚酸酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用乙腈稀釋成50 μg·mL-1的氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考、氯霉素琥珀酸鈉和氯霉素棕櫚酸酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液。

（3）氯霉素氚代內(nèi)標(biāo)（氯霉素-D5）標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液的配制。準(zhǔn)確移取適量的氯霉素-D5標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用乙腈配成1 μg·mL-1內(nèi)標(biāo)中間溶液。

（4）混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制。分別準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液及內(nèi)標(biāo)中間溶液，用流動(dòng)相稀釋 成 濃 度 為0.1 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1和10.0 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2 樣品前處理

（1）提取。將蜂蜜置于不超過60 ℃的水浴中振蕩，待樣品全部融化后攪拌均勻，冷卻至室溫。稱取5 g試樣，精確到0.01 g，置于50 mL具塞離心管中，加入氯霉素氚代內(nèi)標(biāo)（氯霉素-D5）中間溶液和5 mL水，于渦旋混合器上渦旋混合1 min，使試樣完全溶解。加入15 mL乙酸乙酯，在超聲波振蕩儀上超聲振蕩10 min，取出試樣置于離心機(jī)中，以6 000 r·min-1離心5 min，準(zhǔn)確吸取上層乙酸乙酯于15 mL離心管中，經(jīng)氮?dú)獯蹈?，加? mL水溶解殘?jiān)?，待凈化?/p>

（2）凈化。HLB固相萃取柱分別用5 mL水和5 mL乙腈活化，將待凈化液轉(zhuǎn)移到固相萃取柱上，棄去流出液，待溶液完全流出后，依次用5 mL水和5 mL乙腈水溶液淋洗，棄去全部淋出液，抽至近干，用5 mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液于10 mL離心管中，氮?dú)獯蹈?，? mL流動(dòng)相定容，過0.22 μm有機(jī)相濾膜[6]，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.2.3 液相色譜和質(zhì)譜條件

（1）液相色譜條件。色譜柱：BEH C18柱，2.1×50 mm，粒徑1.7 μm；流動(dòng)相：A為含0.1%甲醇的水溶液，B為甲醇。流速：0.3 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：2 μL。液相色譜梯度洗脫程序?yàn)椋?～0.5 min，90%A；0.5～5.0 min，90%A～10%A；5.00～5.01 min，10%A～90%A；5.01～7.00 min，90%A。

（2）質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；掃描方式：負(fù)離子掃描（ESI-）；毛細(xì)管電壓：3.00 kV（ESI-）；脫溶劑氣溫度：440 ℃；脫溶劑氣流速：800 L·h-1；錐孔電壓：30 V；錐孔氣流速：150 L·h-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化質(zhì)譜條件

在負(fù)離子掃描模式下確定目標(biāo)化合物的母離子和定性、定量離子對(duì)并優(yōu)化質(zhì)譜的各參數(shù)質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化結(jié)果，見表1。

表1 6種化合物質(zhì)譜參數(shù)表

2.2 線性范圍與檢出限

將5種酰胺醇類藥物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別配制成0.1 μg·L-1、0.5 μg·L-1、1.0 μg·L-1、2.0 μg·L-1、5.0 μg·L-1和10.0 μg·L-1的溶液進(jìn)行檢測(cè)，各類藥物的檢出限為0.1 μg·kg-1，定 量 限 為1.0 μg·kg-1，線 性 范 圍 為0.1～10.0 μg·L-1，對(duì)應(yīng)化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)見表2，以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各藥物線性方程相關(guān)系數(shù)r＞0.995。酰胺醇類物質(zhì)總離子圖見圖1，各單一組分離子對(duì)圖見圖2。

圖2 各單一組分離子對(duì)圖

表2 各類藥物的工作曲線及相關(guān)系數(shù)表

圖1 酰胺醇類物質(zhì)總離子圖

2.3 回收率與精密度

選用不含本文5種酰胺醇類藥物的陰性蜂蜜樣品進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)[7]，每個(gè)濃度的加標(biāo)試驗(yàn)做6次平行。取各藥物的加標(biāo)量、相應(yīng)的回收率平均值，結(jié)果見表3。

表3 陰性蜂蜜樣品中酰胺醇類藥物的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表（n=6）

2.4 方法實(shí)際應(yīng)用

在合肥商超隨機(jī)購(gòu)買15批次蜂蜜樣品，用本文方法進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為未檢出，未發(fā)現(xiàn)酰胺醇類陽性樣品[8]。

3 結(jié)論

本研究建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蜂蜜中酰胺醇類藥物殘留量。5種酰胺醇類藥物在0.1～10.0 μg·L-1的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均大于0.995；方法檢出限為0.1 μg·kg-1。加標(biāo)水平在0.1～5.0 μg·kg-1范圍內(nèi)，蜂蜜基質(zhì)中平均回收率在86.3%～101.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD≤6.5%。該方法快速、準(zhǔn)確、靈敏，可用于測(cè)定蜂蜜中酰胺醇類藥物殘留。