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    沙門氏菌鑒定和分型方法比對(duì)研究

    2021-09-01 12:34:44李赫婧王立平楊紅蓮薛晨玉
    現(xiàn)代食品 2021年14期
    關(guān)鍵詞:初篩血清型沙門氏菌

    ◎ 李赫婧,王立平,楊紅蓮,薛晨玉,王 丹

    (北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心,北京 100094)

    沙門氏菌是食源性疾病重要的致病菌,我國(guó)每年由沙門氏菌引起的中毒事件屢居首位[1]。依據(jù)現(xiàn)有食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[2],食品中沙門氏菌的鑒定和分型多采用常規(guī)生化鑒定的方法,檢測(cè)周期長(zhǎng),操作煩瑣,費(fèi)力、耗時(shí),無法滿足食品安全突發(fā)事件應(yīng)急檢驗(yàn)的要求[3]。采用合適的鑒定和分型方法,對(duì)致病菌的快速溯源具有重要意義[4-5]。

    基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDITOF-MS)是近幾年發(fā)展起來的一種全新的用于微生物鑒定和分型的生物質(zhì)譜技術(shù),該方法基于細(xì)菌全細(xì)胞蛋白質(zhì)組指紋圖譜分析,通過與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫或者自建數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較,可以鑒定至屬、種,乃至亞種的水平,具有快速、準(zhǔn)確、通量高、成本低等優(yōu)點(diǎn),適用于微生物的高通量篩選[6-8]。傳統(tǒng)的血清學(xué)分型使用血清玻片凝集作為早期沙門氏菌分型方法,該方法直觀可靠,是大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用的分型方法。但存在耗時(shí)長(zhǎng),對(duì)實(shí)驗(yàn)人員操作經(jīng)驗(yàn)有要求,血清質(zhì)量參差不齊而導(dǎo)致結(jié)果偏差等不足之處。多位點(diǎn)序列分型(MLST)是一種基于核酸序列測(cè)定的細(xì)菌分型方法,該方法通過對(duì)多個(gè)管家基因內(nèi)部片段進(jìn)行序列測(cè)定,分析菌株的變異,配合使用EnteroBase數(shù)據(jù)庫提供的物種持家基因信息比對(duì)獲得沙門氏菌各菌株的MLST分型,從而為沙門氏菌分型提供更高的分辨力和更明確的分型方法[9-10]。

    本文采用生化鑒定和MALDI-TOF-MS對(duì)雞肉中分離的沙門氏菌進(jìn)行種屬鑒定,采用傳統(tǒng)血清學(xué)方法和MLST分子手段進(jìn)行血清型分型,比較不同的技術(shù)手段具有的優(yōu)缺點(diǎn),剖析其方法機(jī)制,為實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行沙門氏菌鑒定以及權(quán)衡每種分型技術(shù)的利弊提供參考,使實(shí)驗(yàn)室能更好地根據(jù)菌株特性、分型目的和實(shí)驗(yàn)室擁有的條件選擇合適方法進(jìn)行相關(guān)研究。

    1 材料與方法

    1.1 主要材料與試劑

    生雞肉樣品,購(gòu)自北京市市場(chǎng);BPW培養(yǎng)基、XLD培養(yǎng)基、SC培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯、SWARM瓊脂等,購(gòu)自北京陸橋培養(yǎng)基公司;沙門顯色培養(yǎng)基,購(gòu)自法國(guó)科瑪嘉公司;腸桿菌和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒,購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司;沙門氏菌診斷血清,購(gòu)自丹麥SSI公司;PCR預(yù)混液和細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒,購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;引物,由北京生工生物技術(shù)有限公司合成;IVD BTS、IVD HCCA,購(gòu)自德國(guó)布魯克公司;乙腈、乙醇、三氟乙酸、甲酸和無水乙醇,購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。

    1.2 主要儀器與設(shè)備

    Sigma 3K18離心機(jī)、電熱恒溫水浴、Bio-RAD MyCyclerTM PCR儀、Bio-RAD電 泳 儀、Bio-RAD Gel Doc XR凝膠成像分析系統(tǒng)、布魯克基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜、Nanodrop分光光度計(jì)。

    1.3 沙門氏菌初篩

    參照GB 4789.4—2016[2]方法進(jìn)行生雞肉中沙門氏菌的初篩。無菌操作稱取25 g樣品,置于盛有225 mL BPW的無菌均質(zhì)袋中,均質(zhì)1 min左右,于36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。各移取1 mL增菌液轉(zhuǎn)接種于10 mL TTB和10 mL SC內(nèi),分別于42 ℃和36 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取TTB及SC培養(yǎng)液各1環(huán),分別接種于一個(gè)BS瓊脂平板、一個(gè)XLD瓊脂平板和一個(gè)沙門氏菌顯色平板,于36 ℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)48 h、24 h和24 h,觀察菌落形態(tài),挑取可疑菌落進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

    1.4 生化鑒定

    挑取1.3中初篩可疑沙門氏菌使用腸桿菌和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒進(jìn)行生化鑒定,參照其說明書進(jìn)行操作,將各反應(yīng)管結(jié)果記錄于報(bào)告單上。計(jì)算數(shù)據(jù)得到7位數(shù)字編碼,通過APILAB PLUS鑒定軟件得到鑒定結(jié)果。

    1.5 質(zhì)譜鑒定

    使用MALDI-TOF-MS進(jìn)行質(zhì)譜鑒定,挑取1.3中初篩可疑沙門氏菌涂抹在樣品靶板上,滴加1 μL 70%甲酸,室溫干燥,再滴加1 μL HCCA基質(zhì)溶液,室溫干燥,將靶板放入儀器內(nèi),設(shè)定檢測(cè)參數(shù),進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。

    1.6 MLST分型

    挑取1.4中生化鑒定為沙門氏菌的菌落,參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行沙門氏菌基因組提取,核酸質(zhì)量使用Nanodrop分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。選取沙門氏菌7個(gè)管家基因aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA和thrA進(jìn)行MLST分型,7個(gè)基因的擴(kuò)增引物和測(cè)序引物參照SN/T 4525.1—2016合成[11]。

    PCR反應(yīng)體系(20 μL):PCR預(yù)混液(2×)10 μL,上游引物(10 μmol·L-1)和下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL,DNA模 板1 μL,超 純 水7 μL。PCR反 應(yīng) 條件:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃充分延伸5 min,最后4 ℃保存。

    將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果上傳至EnteroBase數(shù)據(jù)庫進(jìn)行MLST分型。

    1.7 血清分型

    挑取1.4中生化鑒定為沙門氏菌的菌落,以生理鹽水作為對(duì)照,參照GB 4789.4—2016[2]的方法進(jìn)行O抗原和H抗原的血清分型。依次用O因子多價(jià)血清做凝集實(shí)驗(yàn),判定O群,再進(jìn)行O復(fù)合因子血清或單因子血清的核對(duì)。確定O價(jià)抗原因子后,根據(jù)H抗原表所述H因子血清檢查其第一相和第二相的H抗原[12]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 生化鑒定結(jié)果

    經(jīng)過選擇性平板分離初篩,31個(gè)生雞肉樣品中共篩出15株可疑沙門氏菌,對(duì)其進(jìn)行API生化鑒定,結(jié)果顯示其中11株為沙門氏菌屬,生化型分為6704552和6704752兩種,具體生化鑒定結(jié)果詳見表1。

    2.2 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

    對(duì)15株可疑沙門氏菌進(jìn)行MALDI-TOF-MS鑒定,將采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入儀器中自帶微生物指紋圖譜庫進(jìn)行比對(duì),比對(duì)運(yùn)算后得到鑒定結(jié)果,查看鑒定分值,其中11株菌鑒定為沙門氏菌屬,具體質(zhì)譜鑒定結(jié)果詳見表1。

    表1 生化和質(zhì)譜鑒定結(jié)果表

    2.3 MLST分型結(jié)果

    將MLST測(cè)序結(jié)果上傳至EnteroBase數(shù)據(jù)庫(http://mlst.war-wick.ac.uk/mlst)進(jìn)行在線數(shù)據(jù)分析,11株菌共包含5個(gè)ST型,其中ST19型(5株)、ST34型(1株)和ST29型(1株)預(yù)測(cè)為鼠傷寒沙門菌,ST11型(3株)預(yù)測(cè)為腸炎沙門氏菌,ST1628型1株(EnteroBase數(shù)據(jù)庫中未對(duì)該ST型進(jìn)行血清型預(yù)測(cè))。MLST具體分型及預(yù)測(cè)血清型結(jié)果詳見表2。

    表2 MLST和血清分型結(jié)果表

    2.4 血清分型結(jié)果

    使用丹麥SSI血清對(duì)11株沙門氏菌進(jìn)行血清學(xué)分型實(shí)驗(yàn),共檢出3種血清型,分別為3株腸炎沙門氏菌、7株鼠傷寒沙門氏菌和1株里定沙門菌,具體血清學(xué)分型結(jié)果詳見表2。

    2.5 生化和質(zhì)譜鑒定結(jié)果比較與分析

    本次對(duì)15株可疑沙門氏菌進(jìn)行API生化鑒定和MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定,結(jié)果顯示兩種方法對(duì)15株菌的鑒定結(jié)果均一致。生化鑒定和MALDI-TOF-MS鑒定均能較準(zhǔn)確的鑒定到沙門氏菌屬或種的水平,但是兩者的檢測(cè)用時(shí)和檢測(cè)成本不同。相比較傳統(tǒng)生化鑒定方法,質(zhì)譜方法具有快速、成本低、結(jié)果重復(fù)性好等特點(diǎn),一次實(shí)驗(yàn)可以同時(shí)檢測(cè)96個(gè)樣品,可作為沙門氏菌高通量初篩的方法,經(jīng)初篩為陽性的目標(biāo)菌再通過生化鑒定等金標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行確證,這樣會(huì)大大提高目標(biāo)菌的發(fā)現(xiàn)率。

    2.6 血清和MLST分型結(jié)果比較與分析

    本次對(duì)11株沙門氏菌分別用血清和MLST進(jìn)行分型,結(jié)果顯示沙門菌血清型和ST型有高度的相關(guān)性,其中10株菌MLST的預(yù)測(cè)結(jié)果與血清學(xué)分型結(jié)果完全一致,ST11對(duì)應(yīng)腸炎沙門氏菌,ST19、ST34和ST29對(duì)應(yīng)鼠傷寒沙門氏菌,僅有一株菌(樣品號(hào)LHJ-7)MLST分型為ST1628,EnteroBase數(shù)據(jù)庫顯示沒有對(duì)應(yīng)的預(yù)測(cè)血清型,其血清學(xué)分型結(jié)果為里定沙門氏菌,可能由于該菌株在某一MLST基因位點(diǎn)上有突變導(dǎo)致與血清學(xué)結(jié)果偏差。以血清分型方法為參照方法,本次實(shí)驗(yàn)MLST對(duì)沙門氏菌分型的準(zhǔn)確度為90.9%(10/11)。

    血清學(xué)與MLST在沙門氏菌分型上均表現(xiàn)出較好的鑒定能力,但血清分型操作相對(duì)復(fù)雜,對(duì)實(shí)驗(yàn)人員操作經(jīng)驗(yàn)有一定要求,其檢測(cè)結(jié)果受制于試劑質(zhì)量,目前各廠商血清質(zhì)量參差不齊,部分菌株由于變異存在無法分型或交叉凝集等錯(cuò)誤結(jié)果。相比較于血清學(xué)分型,MLST分型具有操作相對(duì)簡(jiǎn)單、成本低、實(shí)驗(yàn)用時(shí)短、結(jié)果更加精準(zhǔn)的優(yōu)勢(shì)。如將MLST與血清分型聯(lián)合使用,先通過MLST對(duì)菌進(jìn)行血清型預(yù)測(cè),再有針對(duì)性的進(jìn)行血清學(xué)分型實(shí)驗(yàn),將會(huì)極大提高血清分型的效率,尤其對(duì)于一些不常見的血清型,往往需要全套的診斷血清進(jìn)行分型,如果有血清預(yù)測(cè)結(jié)果,也會(huì)降低對(duì)血清試劑的依賴,降低實(shí)驗(yàn)成本。

    3 結(jié)論

    文章對(duì)生雞肉樣品進(jìn)行沙門氏菌分離鑒定與分型,共分離出疑似沙門氏菌15株,同時(shí)采用API生化及質(zhì)譜兩種方法對(duì)沙門氏菌進(jìn)行鑒定,共鑒定出11株沙門氏菌,結(jié)果顯示生化與質(zhì)譜鑒定結(jié)果一致。分別采用血清學(xué)和MLST兩種方法對(duì)11株沙門氏菌進(jìn)行分型,結(jié)果顯示MLST共測(cè)出5種ST型,血清分型為3種。通過結(jié)果比較得出沙門菌血清型和ST型有高度的相關(guān)性,其中10株菌MLST的預(yù)測(cè)結(jié)果與血清學(xué)分型結(jié)果完全一致。

    質(zhì)譜方法具有快速、成本低、結(jié)果重復(fù)性好等特點(diǎn),文章僅使用儀器自帶數(shù)據(jù)庫對(duì)沙門氏菌進(jìn)行屬水平的鑒定,如果通過自建數(shù)據(jù)庫,可以對(duì)沙門氏菌進(jìn)行種和亞種水平的鑒定,同時(shí)還具有良好的分型能力,可以作為沙門氏菌快速鑒定的一種補(bǔ)充方法。MLST操作簡(jiǎn)單,能快速得到結(jié)果并且便于不同實(shí)驗(yàn)室結(jié)果之間的比較,已經(jīng)用于多種細(xì)菌的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)和進(jìn)化研究。隨著測(cè)序速度的加快、成本的降低以及分析軟件的發(fā)展,MLST有望成為細(xì)菌的常規(guī)分型方法。

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