硝磺草酮原藥中硝基呫噸酮雜質(zhì)的HPLC分析

王 英，薛建強，孫海建，潘朝暉（江蘇龍燈化學(xué)有限公司，江蘇昆山 215300）

硝磺草酮是先正達公司開發(fā)的三酮類除草劑，可有效防除闊葉雜草及禾本科雜草，在玉米、水稻、甘蔗等作物上廣泛應(yīng)用[1-3]。在全球除草劑排行榜中，硝磺草酮位居第三，每年原藥需求量千噸以上[4-6]，但在硝磺草酮原藥生產(chǎn)中如控制不當(dāng)，則會產(chǎn)生雜質(zhì)硝基呫噸酮[7]。硝基呫噸酮Ames實驗呈陽性，對人類健康有潛在危害。EFSA[8]將硝基呫噸酮（R287431）定為相關(guān)雜質(zhì)，規(guī)定原藥中限量最大值為2 mg/kg。

硝基呫噸酮作為相關(guān)雜質(zhì)，是硝磺草酮質(zhì)量控制的重點。目前，對硝基呫噸酮的分析研究，文獻中鮮有報道。李東等[7]報道用LC-MS/MS（GB 29382—2012）法檢測，但是眾多企業(yè)因缺少此類儀器而無法檢測。

筆者建立了測定硝磺草酮原藥中硝基呫噸酮雜質(zhì)的HPLC方法。該方法準(zhǔn)確度和精密度高，檢出限符合限量要求，是一種簡單、實用的分析方法，可滿足企業(yè)日常檢驗需求。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

SHIMADZU 20-AD高效液相色譜儀（PDA檢測器），島津（中國）有限公司；XS 205分析天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；Agilent XDB-C18不銹鋼色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），安捷倫科技（中國）有限公司；SK5200超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；有機過濾器（孔徑0.22μm）。

乙腈（色譜純）；乙酸銨（分析純）；乙酸銨水溶液（5 mmol/L）；蒸餾水；硝基呫噸酮標(biāo)樣（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0%）、硝磺草酮原藥（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），江蘇龍燈化學(xué)有限公司。

1.2 色譜條件

流動相：乙腈＋乙酸銨水溶液（體積比40∶60），過濾，超聲脫氣；流速：1.0 mL/min；柱溫：40℃；進樣體積：10μL；波長：280 nm；保留時間：硝基呫噸酮約9.6 min。

上述操作條件是典型的操作參數(shù)，可根據(jù)不同儀器特點，對給定的操作參數(shù)做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以獲得最佳分離效果。典型的硝基呫噸酮標(biāo)樣及硝磺草酮加標(biāo)圖譜分別見圖1、圖2。

1.3 測定步驟

1.3.1 溶液的配制

（1）稱取硝基呫噸酮標(biāo)樣0.005 g（精確至0.000 01 g）于50 mL容量瓶，乙腈稀釋，超聲5 min，冷卻至室溫，定容，搖勻。（儲備液1）

（2）移取儲備液1溶液1 mL于50 mL容量瓶（預(yù)先裝入約10 mL乙腈），乙腈稀釋，超聲1 min，冷卻至室溫，定容，搖勻。（儲備液2）

（3）移取儲備液2溶液1.0、1.25、1.5、3.0、5.0 mL于5個25 mL容量瓶（預(yù)先裝入約10 mL乙腈），乙腈稀釋，超聲1 min，冷卻至室溫，定容，搖勻，即L1、L2、L3、L4、L5。

（4）稱取硝磺草酮廠家2原藥2.0 g（精確至0.000 01 g）于7個25 mL容量瓶，加入15 mL乙腈，移取儲備液2溶液1.5 mL于上述7個容量瓶中，超聲5 min，冷卻至室溫，定容，搖勻，即P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7。

（5）稱取硝磺草酮廠家1原藥2.0 g（精確至0.000 01 g）于5個25 mL容量瓶，加入15 mL乙腈，移取儲備液2溶液1.5 mL于上述5個容量瓶中，超聲5 min，冷卻至室溫，定容，搖勻，即R1、R2、R3、R4、R5。

（6）稱取各廠家硝磺草酮原藥2.0 g（精確至0.000 01g）于4個25 mL容量瓶，加入15 mL乙腈，超聲5 min，冷卻至室溫，定容，搖勻，即S1、S2、S3、S4。

1.3.2 測定

按1.2的條件設(shè)定儀器參數(shù)，平衡儀器，待穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，直至相鄰2針硝基呫噸酮的面積相對變化小于30%后，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進行測定。

1.3.3 計算

試樣中硝基呫噸酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)按式（1）計算。

式中：w為試樣中硝基呫噸酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；A2為試樣溶液中硝基呫噸酮峰面積的平均值，mAU·s；m1為硝基呫噸酮標(biāo)樣的質(zhì)量，g；P為標(biāo)樣中硝基呫噸酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；A1為標(biāo)樣溶液中硝基呫噸酮峰面積的平均值，mAU·s；m2為試樣的質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱的選擇

色譜柱是樣品分離、測定的關(guān)鍵。同一分析物，使用不同的色譜柱，分離效果不同。選擇色譜柱時，要綜合考慮色譜柱填料和分析物性質(zhì)。

試驗中比較了Agilent XDB-C18柱、Agilent XDB-Phenyl柱、Waters XBridge-C18柱、Waters Atlantis-T3柱等對硝磺草酮原藥中硝基呫噸酮分離效果的影響，最終選擇性能穩(wěn)定且普遍的Agilent XDB-C18柱。該色譜柱分析硝基呫噸酮，干擾小、重現(xiàn)性好。

2.2 流動相的選擇

HPLC反相分析中，有機相一般選擇甲醇或乙腈，水相優(yōu)先使用純水。如被測物組分復(fù)雜，則需結(jié)合被測物結(jié)構(gòu)、峰形、干擾等情況對水相及流動相比例進行調(diào)節(jié)。硝基呫噸酮為硝磺草酮原藥中的雜質(zhì)，含量在ppm水平，以純水為水相時，保留時間和硝磺草酮接近，需重點考察硝磺草酮的干擾。參考國標(biāo)并試驗后，在水相中加入乙酸銨，將硝磺草酮的保留時間調(diào)至4 min，避免了硝磺草酮對硝基呫噸酮的干擾（圖2）。

2.3 波長的選擇

利用PDA數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，采集硝磺草酮加標(biāo)樣在波長190～400 nm的紫外吸收光譜曲線。經(jīng)與硝基呫噸酮標(biāo)樣紫外吸收光譜圖比對，同時考慮溶劑吸收干擾及其他組分的靈敏度、峰形、檢出限等因素，最后優(yōu)化選擇的波長為280 nm。

2.4 專屬性試驗

在1.2分析條件下，分別進乙腈、硝基呫噸酮標(biāo)樣、硝磺草酮原藥、廠家1原藥低濃度標(biāo)樣添加液，從溶劑干擾、保留時間、峰純度、圖譜疊加等方面觀察在硝基呫噸酮保留時間附近是否有干擾，無干擾則繼續(xù)，否則需調(diào)整方法，以滿足專屬性試驗。本試驗條件下，在硝基呫噸酮保留時間附近無干擾，符合專屬性要求。

2.5 線性試驗

將準(zhǔn)備好的溶液L1、L2、L3、L4，L5分別進樣，測定硝基呫噸酮的峰面積。以硝基呫噸酮標(biāo)樣的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）。結(jié)果顯示，硝基呫噸酮質(zhì)量濃度在0.000 082～0.000 410 mg/mL時，線性關(guān)系良好，線性方程為y=18 839 144.30x＋25.16，線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 6，可滿足定量分析要求。

2.6 精密度試驗

將準(zhǔn)備好的溶液P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7分別進樣，記錄硝基呫噸酮的峰面積，按1.3.3的方法計算硝基呫噸酮含量并求RSD和RSDr，結(jié)果見表1。根據(jù)SANCO 3030/99[9]（rev.5）要求，結(jié)果應(yīng)符合RSD小于RSDr。本試驗RSD值為6.11%，RSDr值為10.03%（RSDr=2（1-0.5logC）×0.67），符合要求。

表1 硝基呫噸酮精密度試驗結(jié)果

2.7 回收率試驗

將準(zhǔn)備好的溶液R1、R2、R3、R4、R5分別進樣，記錄硝基呫噸酮的峰面積，按照1.3.3的方法計算硝基呫噸酮含量并折算至實測量，計算回收率，結(jié)果見表2?；厥章试?05.96%～110.24%，平均回收率為108.20%，根據(jù)SANCO 3030/99[9]（rev.5）要求，含量小于0.1%時，回收率范圍為75%～125%，結(jié)果符合要求。

表2 硝基呫噸酮回收率試驗結(jié)果

2.8 LOD值及LOQ值試驗

對溶劑乙腈多次進樣，在硝基呫噸酮保留時間附近測量噪音，取5次平均值為基線噪音，以3倍基線噪音為最低檢出限（LOD），以3倍LOD值為最低定量限（LOQ）。硝基呫噸酮的最低檢出限（LOD）為0.51 mg/kg，最低檢出限色譜圖見圖4。

2.9 硝磺草酮原藥中硝基呫噸酮的測定

對市場上4家硝磺草酮原藥，用上述方法對其中的硝基呫噸酮雜質(zhì)進行測定，分析結(jié)果見表3。4個廠家樣品圖譜和標(biāo)樣圖譜的疊加比較見圖5。

表3 不同廠家硝基呫噸酮測定結(jié)果

從測定結(jié)果和比較圖譜可知，4個廠家的樣品因硝磺草酮原藥生產(chǎn)工藝不同，在硝基呫噸酮雜質(zhì)檢測中出現(xiàn)了4種情況。廠家1樣品中不含硝基呫噸酮且周圍沒有任何干擾峰，為合格產(chǎn)品；廠家2樣品在9.9 min有未知峰，經(jīng)加標(biāo)疊加試驗及紫外吸收圖譜比對，確認(rèn)不是硝基呫噸酮（RT為9.6 min），為合格產(chǎn)品。廠家3樣品定量結(jié)果為0.51 mg/kg，遠低于限量（2 mg/kg），為合格產(chǎn)品。廠家4樣品定量結(jié)果為9.10 mg/kg，遠超限量，為不合格產(chǎn)品。如樣品定量結(jié)果在限量±30%范圍（1.4～2.6 mg/kg），建議多次測定取平均值并比對樣品峰面積與限量濃度標(biāo)樣峰面積或用GB 29382—2012方法確認(rèn)后再做判定。

2 結(jié) 論

本方法采用普通的HPLC儀器，建立了測定硝磺草酮原藥中硝基呫噸酮雜質(zhì)的分析方法，驗證了線性、精密度、回收率、LOD值、LOQ值，結(jié)果符合要求。通過對市場上4個廠家硝磺草酮原藥中硝基呫噸酮的分析可知，本方法簡單、快速，可為眾多無LC-MS/MS企業(yè)的質(zhì)量控制提供參考。