1例犬乳腺癌的病理組織學(xué)診斷

梅 晨 ， 金 華 ， 辛 良 ， 張 雪 ， 胡 偉 ， 先 宏 ， 王宏俊

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 ， 北京 海淀 100097 ； 2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院 ， 北京 海淀 100193 ； 3. 中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第七醫(yī)學(xué)中心病理科 ， 北京 海淀 100700)

犬是人類(lèi)最早訓(xùn)化的動(dòng)物，也是人類(lèi)長(zhǎng)期的好朋友，不僅分享共同的環(huán)境、生活習(xí)性和飲食活動(dòng)[1]，甚至從遺傳學(xué)上看，腫瘤發(fā)生機(jī)制都十分相近[2]。犬的癌癥疾病一般都有很短的潛伏期，且伴侶犬的生活區(qū)域十分有限，一旦發(fā)現(xiàn)異常情況，動(dòng)物主人能夠快速作出反應(yīng)。犬乳腺腫瘤的發(fā)生多是激素依賴(lài)型腫瘤，與人乳腺癌十分相似。因此，相同的生活環(huán)境、相似的生物學(xué)、組織病理學(xué)特征以及很多共同的危險(xiǎn)因素，都使得犬乳腺腫瘤病例成為研究人類(lèi)乳腺腫瘤疾病最好的動(dòng)物模型[3]。在正常犬乳腺中，不同細(xì)胞的免疫表型不同，在犬乳腺癌的發(fā)展過(guò)程中通常保留了細(xì)胞特異性分化標(biāo)志物[4-5]，利用此特點(diǎn)可以用免疫組化染色方法，通過(guò)特異性抗體來(lái)識(shí)別腫瘤細(xì)胞的組織來(lái)源，以達(dá)到提高診斷準(zhǔn)確性的目的。同時(shí)免疫組化靈敏度高，可以識(shí)別腫瘤組織中的微轉(zhuǎn)移病灶，可為腫瘤的預(yù)后判斷提供依據(jù)。對(duì)一系列的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行增殖活性的測(cè)定，可用來(lái)評(píng)估其良惡性的關(guān)系。本試驗(yàn)從動(dòng)物醫(yī)院收集1例犬乳腺腫物，擬通過(guò)乳腺腫瘤組織病理切片H.E.染色、免疫組化及腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)、免疫熒光等方法進(jìn)行腫物病理診斷，為下一步探究致病機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 腫瘤組織及染色材料 乳腺腫瘤組織來(lái)自5歲 半雌性泰迪犬，由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院提供。所需試劑：10%的福爾馬林、石蠟、甲醛、飽和碳酸鋰、伊紅、蘇木素、蒸餾水、70%酒精、75%酒精、80%酒精、85%酒精、90%酒精、95%酒精、無(wú)水乙醇、二甲苯、中性樹(shù)膠。過(guò)碘酸(HIO4·2H2O)、醋酸鈉、堿性品紅、鹽酸、偏重硫酸鈉、Schiff氏液、純酒精、蒸餾水。萊卡切片機(jī)、恒溫箱、干燥箱、濕盒、萊卡光學(xué)顯微鏡。鼠單克隆抗體ER(Invitrogen，MA1-12692)、兔多克隆抗體PR(Invitrogen，PA5-82322)、鼠單克隆抗體HER-2(Invitrogen，MA5-13105)、兔單克隆抗體P63(Invitrogen，MA3-026)、鼠單克隆抗體SMA(Invitrogen，14-9760-82)、鼠單克隆抗體CK5/6(Invitrogen，53-9003-82)、鼠單克隆抗體Ki-67(Invitrogen,14-5698-82)、鼠單克隆抗體SOX-2(Invitrogen,MA1014)、FITC熒光標(biāo)記羊抗鼠IgG(Abcam，ab6785)等，均購(gòu)自北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司。

1.2 腫瘤組織進(jìn)行病理切片觀察 將手術(shù)摘除的腫瘤組織切割成5 mm×3 mm×3 mm組織塊，立即投入10%中性福爾馬林固定，酒精梯度脫水，浸蠟包埋后備用。切片機(jī)設(shè) 3 μm的石蠟切片，進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅(Hematoxylin and eosin,H.E.)染色和免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry，IHC)染色[6-7]，顯微鏡下觀察并分析染色結(jié)果，進(jìn)行病理組織學(xué)診斷。

1.3 腫瘤組織免疫組化試驗(yàn) 選擇腫瘤組織豐富區(qū)域的切片樣本，免疫組化測(cè)定雌激素受體(Estrogen,ER)、孕激素受體(Progesterone,PR)、人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(Human epidermal growth factor-2,HER-2)、P63、細(xì)胞角蛋白 5/6(Cytokeratin 5/6，CK5/6)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)等細(xì)胞特征性標(biāo)志物的表達(dá)情況。操作步驟參照文獻(xiàn)[7]，首先對(duì)組織切片進(jìn)行脫蠟處理，并放置于3%過(guò)氧化氫條件下進(jìn)行室溫孵育10 min， 待內(nèi)源性過(guò)氧化物酶徹底滅活后，加入正常山羊血清于室溫下封閉20 min。隨后分別加入上述標(biāo)志物的單克隆抗體4 ℃過(guò)夜，抗鼠酶標(biāo)二抗37 ℃ 孵育20 min，然后行二氨基聯(lián)苯胺(3,3’-diaminobenzidine,DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明，封固后以光鏡進(jìn)行觀察。

1.4 犬乳腺癌細(xì)胞原代培養(yǎng) 將外科手術(shù)無(wú)菌摘除的乳腺腫瘤樣本迅速送往細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，在無(wú)菌超凈工作臺(tái)內(nèi)，將組織放置于一次性培養(yǎng)皿內(nèi)，使用DMEM培養(yǎng)液清洗3次，使用消毒后的鑷子和剪刀，將腫瘤組織切割成10 mm3左右的組織塊，在培養(yǎng)皿內(nèi)加入含100萬(wàn)單位/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，振蕩1 min，轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，上清轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。離心后的沉淀再次加入DMEM培養(yǎng)基及Ⅱ型 膠原酶(Sigma,V900892)，振蕩30 min，轉(zhuǎn)入15 mL 離心管中，1 000 r/min離心5 min，離心后的沉淀再次加入DMEM培養(yǎng)基，重懸、再離心。重復(fù)3次。 之后，1000 r/min離心5 min，棄上清。在離心管中加入DMEM培養(yǎng)基，將沉淀重懸后轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃ 5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，3～4 d后加入10%的胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5 犬乳腺癌細(xì)胞純化 細(xì)胞層長(zhǎng)至70%～80%后，用0.25%胰蛋白酶將細(xì)胞完全消化下來(lái)，用含10%血清的DMEM/F12終止消化，1 000 r/min離心10 min后棄上淸，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并重新接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于1 h內(nèi)將培養(yǎng)基吸出，加入到新的細(xì)胞瓶中重新培養(yǎng)。利用成纖維細(xì)胞貼壁速度明顯快于上皮細(xì)胞的特點(diǎn)，可將上皮細(xì)胞純化出來(lái)。將用差速貼壁法初步純化的細(xì)胞正常消化后制備成單細(xì)胞懸液。在細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算出細(xì)胞的濃度。用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至每100 μL 含有10個(gè)細(xì)胞，充分混勻后，均勻加入96孔板中，100 μL/孔。 每隔3 d更換1次新鮮的培養(yǎng)基，如此培養(yǎng)10～14 d可見(jiàn)到一些孔中會(huì)長(zhǎng)出細(xì)胞群落，即為純化的犬乳腺癌細(xì)胞。經(jīng)5～7 代的連續(xù)純化，細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定時(shí)進(jìn)行凍存和后續(xù)試驗(yàn)。

1.6 犬乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)曲線檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[8]所用方法，將生長(zhǎng)至第30代的細(xì)胞調(diào)整至細(xì)胞濃度為105個(gè)/mL，接種到25 cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，1 mL/瓶。 用DMEM/F12完全培養(yǎng)基補(bǔ)足終體積為5 mL/瓶，37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)9 d。每隔24 h 取3個(gè)重復(fù)的細(xì)胞瓶，胰酶消化后用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，并計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間。

1.7 犬乳腺癌細(xì)胞免疫熒光檢測(cè) 將培養(yǎng)好的細(xì)胞分為2個(gè)組，每組為 3個(gè)細(xì)胞爬片，棄掉培養(yǎng)液，用PBS洗1遍，4%多聚甲醛室溫固定10 min，分別用PBS洗3遍，1%Triton X-100 透膜 10 min，PBS 洗3遍， 用山羊血清封閉40 min。一組滴加單克隆抗體SOX-2(1∶100稀釋)，另一組滴加Ki-67單抗(1∶100稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS 洗 3 遍，兩組分別滴加FITC標(biāo)記羊抗鼠 IgG (1∶100稀釋)，室溫避光孵育1 h，PBS 洗 3 遍，DAPI染色10 min，PBS 洗 3 遍，封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1 臨床檢查與處理 經(jīng)手術(shù)鈍性剝離瘤樣物，豌豆大小硬結(jié)共3個(gè)，全部摘除。摘除的瘤樣物外周沒(méi)有包膜，堅(jiān)硬，灰白色，切角有淺粉色大理石花紋。

2.2 H.E.染色組織學(xué)觀察 常規(guī)H.E.染色觀察，如中插彩版圖1所示，中插彩版圖1A及圖1C中乳腺瘤樣物中乳腺正常結(jié)構(gòu)完全被破壞。中插彩版圖1B中腫瘤細(xì)胞向管腔內(nèi)突起生長(zhǎng)，越往管腔中心，腫瘤細(xì)胞越大，胞質(zhì)越豐富，核越大，核分裂相多見(jiàn)，有的腫瘤細(xì)胞發(fā)生顆粒變性和空泡變性。

圖1 犬腫瘤組織切片的H.E.染色Fig.1 H.E. staining of canine tumor tissue sectionsA： 犬乳腺癌； B： 犬乳腺導(dǎo)管內(nèi)癌； C： 犬乳腺癌A: Canine breast cancer; B: Canine intraductaL carcinoma; C: Canine breast cancer

2.3 免疫組化染色組織學(xué)觀察 本病例的免疫組化結(jié)果如中插彩版圖2所示，ER、PR、HER-2表達(dá)均為陰性；切片中一部分細(xì)胞P63呈陽(yáng)性表達(dá)，且在細(xì)胞胞質(zhì)中呈高表達(dá)，為棕色或深棕色。CK5/6在組織切片中廣泛表達(dá)于細(xì)胞外周，α-SMA 顯示有部分肌成纖維細(xì)胞呈深褐色，提示該癌癥屬于原位癌或者浸潤(rùn)程度不高的早期浸潤(rùn)癌。綜上所述，此腫瘤為三陰性乳腺癌，并且預(yù)后不良。

圖2 犬腫瘤組織切片的免疫組化染色Fig.2 Immunohistochemical staining of canine tumor tissue sectionsA： 腫瘤蛋白P63； B： 細(xì)胞角蛋白5/6； C：α-平滑肌肌動(dòng)蛋白； D：孕激素受體； E：雌激素受體； F：人表皮生長(zhǎng)因子受體-2A:P63; B:CK5/6; C:α-SMA; D:PR; E:ER; F:HER-2

2.4 犬乳腺癌細(xì)胞純化及細(xì)胞生長(zhǎng)曲線檢測(cè) 如圖3所示，細(xì)胞經(jīng)純化后形態(tài)單一，呈條索狀。生長(zhǎng)曲線如圖4所示，制作好標(biāo)準(zhǔn)曲線后，對(duì)細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)9 d，檢測(cè)細(xì)胞在450 nm的吸光值，并計(jì)算出活細(xì)胞數(shù)量。經(jīng)計(jì)算，細(xì)胞倍增時(shí)間為26.35 h。

圖3 純化后犬乳腺癌細(xì)胞 (200×)Fig.3 Canine mammary tumor cells after purification(200×)

圖4 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig.4 Cell growth curve

2.5 犬乳腺癌細(xì)胞免疫熒光檢測(cè) 抗原Ki-67是一種核蛋白，它與核糖體RNA轉(zhuǎn)錄有關(guān)，Ki-67抗原的失活導(dǎo)致核糖體RNA合成受到抑制。Ki-67可以作為一個(gè)細(xì)胞增殖的標(biāo)記物[8]。在病理報(bào)告中的Ki-67表達(dá)指數(shù)高低與許多腫瘤分化程度、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。陽(yáng)性率越高，腫瘤增殖越快，惡性程度越高。SOX-2是維持干細(xì)胞多向分化的重要轉(zhuǎn)錄因子，有維持細(xì)胞自我更新和增殖的能力，在胚胎發(fā)育及惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要作用。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，SOX-2的異常表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生、分化程度、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后等方面關(guān)系密切[9]。本病例腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中均高表達(dá)Ki-67及SOX-2，核質(zhì)染色清晰，立體感強(qiáng)，無(wú)特異性背景。結(jié)果如中插彩版圖5、圖6所示。提示純化后的細(xì)胞為犬乳腺癌細(xì)胞。

圖5 犬乳腺癌細(xì)胞表達(dá)Ki-67Fig.5 Expression of Ki-67 in canine mammary tumor cellsA：合并圖層； B：細(xì)胞核DAPI顯色； C：FITC熒光A:Merge; B:DAPI of nuclei; C:FITC fluorescence

圖6 犬乳腺癌細(xì)胞表達(dá)SOX-2Fig.6 Expression of SOX-2 in canine mammary tumor cellsA：合并圖層； B：細(xì)胞核DAPI顯色； C：FITC熒光A:Merge; B:DAPI of nuclei; C:FITC fluorescence

3 討論

自發(fā)性犬乳腺腫瘤是未絕育雌性犬常見(jiàn)的腫瘤，又是人類(lèi)乳腺癌極佳代替模型[10]。作為犬最常見(jiàn)的腫瘤性疾病，其發(fā)病率達(dá)母犬腫瘤性疾病的50%[11]。在犬乳腺腫瘤中大約有50%為惡性腫瘤，即乳腺癌。通常易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，因此多預(yù)后不良，對(duì)犬尤其是雌性犬的生命構(gòu)成嚴(yán)重威脅。常規(guī)的組織學(xué)診斷方法有一定的局限性，尤其是在精準(zhǔn)識(shí)別腫瘤細(xì)胞成分方面存在誤判的可能，組織學(xué)診斷為實(shí)體癌的犬乳腺腫瘤，經(jīng)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)其不止1種腫瘤細(xì)胞成分的病例多有發(fā)生[12]。因此，確切地鑒別出癌細(xì)胞特征性標(biāo)志物有助于準(zhǔn)確診斷，也有助于腫瘤的預(yù)后判斷。

由于腫瘤的發(fā)生是多基因參與的過(guò)程，還涉及遺傳與環(huán)境的相互作用，用單個(gè)癌基因標(biāo)記物進(jìn)行診斷是不現(xiàn)實(shí)的，將幾個(gè)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)可提高診斷的準(zhǔn)確性。隨著生物信息及蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，大大推動(dòng)了腫瘤標(biāo)記物測(cè)定技術(shù)的發(fā)展，蛋白組學(xué)在多種腫瘤檢測(cè)方面均有較好的靈敏性。細(xì)胞癌變之后，可出現(xiàn)正常細(xì)胞不具備的抗原、蛋白、酶和糖蛋白等物質(zhì)，這些物質(zhì)稱(chēng)為腫瘤標(biāo)記物。在本病例中，在腫瘤組織切片H.E.染色判定為乳腺癌的基礎(chǔ)上，通過(guò)使用不同腫瘤標(biāo)記物ER、PR、HER-2、CK5/6、α-SMA及P63等來(lái)檢測(cè)其在腫瘤組織中的表達(dá)情況并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，確診該病例為浸潤(rùn)程度較低的三陰性犬乳腺癌。ER、PR、HER-2、P63、CK5/6、α-SMA等均是經(jīng)驗(yàn)證的犬乳腺癌組織的主要生物學(xué)標(biāo)志物[13]。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)患犬腫瘤組織中這些標(biāo)志物等的表達(dá)情況，有助于確定腫瘤的性質(zhì)判定。雌激素和孕激素在乳腺癌的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，而它們發(fā)揮作用的基礎(chǔ)是與細(xì)胞表面的一種特殊的結(jié)構(gòu)—激素受體相結(jié)合。檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞的ER和PR，可以幫助判定該腫瘤是否對(duì)內(nèi)分泌治療敏感。HER-2是表皮生長(zhǎng)因子受體家族的一員，此家族在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，是細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及存活的重要調(diào)節(jié)者。該基因的擴(kuò)增目前已成為臨床醫(yī)學(xué)上評(píng)估乳腺癌惡性程度、乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)及預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)的重要指標(biāo)。CK5/6 主要表達(dá)在皮膚的基底細(xì)胞、棘層細(xì)胞和部分前列腺基底細(xì)胞，于其他單層腺上皮不表達(dá)。CK5/6已被證實(shí)為三陰性(ER、PR、HER-2均為陰性)乳腺癌的特征性分子標(biāo)記物。有研究表明，CK5/6的表達(dá)可以作為乳腺癌的預(yù)后標(biāo)志物[14]，陽(yáng)性為乳腺癌預(yù)后差的標(biāo)志[15]。P63是乳腺肌上皮細(xì)胞非常敏感而特異的標(biāo)志物。在乳腺良性病變中，腺泡和導(dǎo)管周?chē)梢?jiàn)連續(xù)的P63+肌上皮細(xì)胞圍繞，在乳腺癌早期浸潤(rùn)灶及浸潤(rùn)性癌中，P63染色顯示肌上皮細(xì)胞大部分消失或無(wú)肌上皮細(xì)胞。從乳腺良性病變到原位癌、早期浸潤(rùn)癌和浸潤(rùn)癌，肌上皮的消失是一個(gè)逐漸發(fā)展的過(guò)程，50%以上腫瘤的發(fā)生發(fā)展都伴有P63的突變或異常表達(dá)。因此，P63有助于乳腺良、惡性病變的診斷和鑒別診斷。Ki-67是一種在靜止期細(xì)胞中不表達(dá)的非組蛋白，只能在細(xì)胞增殖期被檢測(cè)到，反映細(xì)胞的增殖活性。在細(xì)胞層面，細(xì)胞免疫熒光結(jié)果表明，細(xì)胞Ki-67及SOX-2高表達(dá)，確定該細(xì)胞為癌細(xì)胞[16-17]。

過(guò)去幾十年間，很多研究聚焦于人或動(dòng)物腫瘤標(biāo)志物，但是至今仍沒(méi)有非常完善的檢測(cè)體系。目前被研究關(guān)注最多的乳腺腫瘤標(biāo)志物仍為Ki-67、HER-2、ER、PR、SOX-2等[18]。完美的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)滿足在血液中就可輕松檢測(cè)并只在惡性腫瘤中高表達(dá)的特性；還應(yīng)滿足在特定腫瘤中特異性表達(dá)，且能夠明確提示預(yù)后。血清中的腫瘤標(biāo)志物比組織腫瘤標(biāo)志物有以下優(yōu)勢(shì)：測(cè)量過(guò)程是非侵入性的；在臨床癥狀出現(xiàn)前能夠顯示生理及病理的動(dòng)態(tài)變化[16,19]。到目前為止，在血清及組織檢測(cè)中最具有說(shuō)服力的是miRNAs，因?yàn)槠渚哂懈咛禺愋约办`敏度。然而，目前多數(shù)研究只局限于少量樣本評(píng)估檢測(cè)，在未來(lái)的研究中需要有更多細(xì)節(jié)的標(biāo)化[20-21]。

此外，目前犬腫瘤診斷大多借鑒人類(lèi)腫瘤的判定標(biāo)準(zhǔn)，并且免疫組化試驗(yàn)完全依據(jù)人類(lèi)腫瘤蛋白標(biāo)記物的反應(yīng)性。由于存在種屬差異性，許多人類(lèi)腫瘤標(biāo)記蛋白在犬臨床診斷時(shí)沒(méi)有經(jīng)過(guò)充分驗(yàn)證，部分標(biāo)志物的抗體在犬類(lèi)病例中沒(méi)有陽(yáng)性反應(yīng)。因此，很有必要系統(tǒng)地完善犬屬動(dòng)物的腫瘤診斷方法和判定標(biāo)準(zhǔn)。