犬瘟熱、犬細(xì)小病毒疫苗株與國(guó)內(nèi)流行毒株的同源性分析

李雙男 ， 張賀楠 ， 何至遠(yuǎn) ， 王振豹 ， 郝霖雨 ， 張釗偉 ， 王洪海 ， 牛建祁

(中牧實(shí)業(yè)股份有限公司 ， 北京 豐臺(tái) 100070)

犬四聯(lián)弱毒活疫苗可以預(yù)防犬瘟熱、犬細(xì)小病毒性腸炎、犬副流感、犬腺病毒(犬傳染性肝炎、犬傳染性喉氣管炎)感染癥。

犬瘟熱 (Canine distemper，CD) 是由犬瘟熱病毒 (Canine distemper virus，CDV) 引起的一種以鼬科、犬科、海豹科、部分浣熊科等為主的食肉動(dòng)物急性、烈性、高度接觸性傳染病[1-2]。犬瘟熱患病動(dòng)物的康復(fù)依賴于機(jī)體的抗體水平，對(duì)于犬瘟熱的治療目前無(wú)特效藥物，最有效的預(yù)防方法仍是接種疫苗。血凝蛋白(H)是CDV囊膜表面主要糖蛋白之一，CDV通過(guò)H蛋白吸附到細(xì)胞受體上來(lái)啟動(dòng)病毒感染過(guò)程，因此H蛋白決定了CDV的宿主特異性和組織嗜性。犬細(xì)小病毒病(Canine parvovirus disease,CPD)又稱犬傳染性腸炎或犬病毒性腸炎，是由犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus，CPV)引起的犬的一種急性、接觸性、致死性傳染病。CPV屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬，衣殼蛋白VP2在確定CPV的抗原性和宿主范圍方面起著重要作用[3-4]。

本試驗(yàn)以PCR的方法對(duì)犬瘟熱病毒H基因、犬細(xì)小病毒VP2基因進(jìn)行序列擴(kuò)增，利用生物軟件參照國(guó)內(nèi)流行毒株序列，對(duì)A廠和B廠疫苗毒株序列進(jìn)行分析，比較疫苗毒株間差異及疫苗毒與流行毒之間差異。

1 材料與方法

1.1 材料 A廠家：犬瘟熱、犬副流感、犬腺病毒與犬細(xì)小病毒病四聯(lián)活疫苗，批號(hào)：1901001；B廠家：犬瘟熱、腺病毒2型、副流感、細(xì)小病毒病四聯(lián)活疫苗，批號(hào)：320966B；DNA 提取試劑盒、RT-PCR試劑盒，均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物由北京新時(shí)代(三博遠(yuǎn)志)科技有限公司合成。

1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank上已發(fā)表的犬瘟熱病毒H基因、犬細(xì)小病毒VP2基因序列設(shè)計(jì)2對(duì)引物：P1:CDV-H-F 5′-ATGCTCTCCTACCAAGACAAGGTG-3′；P2:CDV-H-R 5′-GTCAGGGATTTGAACGGTTACATG-3′；P3:CPV-VP2-F 5′-TACAGGATCTGGGAACGGGT-3′；P4:CPV-VP2-R 5′-TGGATTCCAAGTATGGGAGGC-3′，預(yù)測(cè)CDV和CPV的PCR產(chǎn)物大小為1.7 bp。

1.3 基因組的提取及PCR/RT-PCR的檢測(cè) 取A廠和B廠的疫苗稀釋液200 μL，用DNA/RNA提取試劑盒提取DNA/RNA樣本。分別用P1和P2擴(kuò)增CDV基因片段，P3和P4擴(kuò)增CPV基因片段，PCR反應(yīng)體系：模板 DNA 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，Rmix 25 μL，Emix 1 μL,ddH2O 12 μL。CDV反應(yīng)條件:45 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 100 s,共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。CPV同上述反應(yīng)條件，無(wú)需反轉(zhuǎn)錄過(guò)程。PCR產(chǎn)物于4 ℃保存，取5 μL進(jìn)行凝膠電泳。

1.4 各疫苗毒株的序列測(cè)定與分析 PCR產(chǎn)物送北京新時(shí)代(三博遠(yuǎn)志)科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，從NCBI的數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索已發(fā)表的我國(guó)CDV與CPV流行毒株的序列，并下載保存，將2個(gè)廠家測(cè)序結(jié)果與我國(guó)流行毒株利用MEGA 6和Megnalign軟件進(jìn)行序列分析比對(duì)，繪制進(jìn)化樹(shù)，分析同源性，并對(duì)主要蛋白的突變點(diǎn)進(jìn)行差異分析。

2 結(jié)果

2.1 各基因序列的PCR擴(kuò)增 提取基因組經(jīng)PCR/RT-PCR 擴(kuò)增，測(cè)序表明，獲得CDV的PCR產(chǎn)物大小為1 763 bp，CPV的PCR產(chǎn)物大小為1 754 bp，結(jié)果與預(yù)期大小一致(圖1)。

圖1 不同廠家疫苗毒CDV的H基因與CPV的VP2基因PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of the H gene of CDV and VP2 gene of CPV from different vaccine manufacturersM：DL 2 000 plus marker； 1： A廠疫苗CDV的PCR產(chǎn)物; 2： B廠疫苗CDV的PCR產(chǎn)物; 3: A廠疫苗CPV的PCR產(chǎn)物; 4: B廠疫苗CPV的PCR產(chǎn)物M: DL 2000 plus marker; 1: PCR product of CDV vaccine from manufacturer A; 2: PCR product of CDV vaccine from manufacturer B; 3: PCR product of CPV vaccine from manufacturer A; 4: PCR product of CPV vaccine from manufacturer B

2.2 CDV疫苗H基因序列分析 A廠家和B廠家2個(gè)廠家疫苗提取的CDV疫苗毒H基因和我國(guó)已發(fā)表的部分毒株序列構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)與核苷酸序列同源性結(jié)果見(jiàn)圖2。2個(gè)廠家CDV疫苗毒株核苷酸序列同源性為92.9%，與國(guó)內(nèi)流行毒株核苷酸序列同源性均在89.6%以上，相似性高，其中B廠家的CDV毒株與國(guó)內(nèi)流行毒株的核苷酸序列同源性在92.5%～95.6%，A廠家的CDV毒株與國(guó)內(nèi)流行毒株的核苷酸序列同源性在89.6%～96.2%。

圖2 CDV疫苗毒H基因分子進(jìn)化樹(shù)與核苷酸序列同源性分析Fig.2 Molecular evolution tree and nucleotide sequence homology analysis of H gene of CDV vaccine virus

2.3 CPV疫苗VP2基因序列分析 A廠家和B廠家2個(gè)廠家疫苗的CPV疫苗毒VP2基因和我國(guó)已發(fā)表的部分毒株序列構(gòu)建分子進(jìn)化樹(shù)與核苷酸序列同源性比較結(jié)果見(jiàn)圖3。2個(gè)廠家CPV疫苗毒株核苷酸序列同源性為98.6%，與國(guó)內(nèi)流行毒株核苷酸序列同源性均在98.1%以上，相似性高，其中B廠家的CPV毒株與國(guó)內(nèi)流行毒株的核苷酸序列同源性在98.7%～99.5%，A廠家的CPV毒株與國(guó)內(nèi)流行毒株的核苷酸序列同源性在98.1%～98.6%。

圖3 CPV疫苗毒VP2基因分子進(jìn)化樹(shù)與核苷酸序列同源性分析Fig.3 Molecular evolution tree and nucleotide sequence homology analysis of VP2 gene of CPV vaccine virus

2.4 CDV與CPV疫苗毒重要結(jié)合位點(diǎn)差異分析 CDV H蛋白作為重要的膜蛋白，主要通過(guò)與宿主體內(nèi)信號(hào)淋巴細(xì)胞激活因子(SLAM受體)的結(jié)合進(jìn)行復(fù)制。研究表明，H蛋白個(gè)別氨基酸位點(diǎn)改變會(huì)影響與SLAM受體的結(jié)合能力。文獻(xiàn)報(bào)道這些位點(diǎn)集中在第525、526、529、530位和第549位等位點(diǎn)。分析發(fā)現(xiàn)，A廠家的疫苗株的這幾個(gè)位點(diǎn)氨基酸與國(guó)內(nèi)流行毒株在第530位和第549位氨基酸差異明顯。B廠家的疫苗株的這幾個(gè)位點(diǎn)氨基酸與國(guó)內(nèi)流行毒株在第530位氨基酸差異明顯。

CPV的VP2基因長(zhǎng)1 755 bp，編碼584個(gè)氨基酸，在MegAlign軟件中將由本試驗(yàn)擴(kuò)增得到的疫苗毒株VP2基因的氨基酸推導(dǎo)序列進(jìn)行差異比較后，與GenBank中我國(guó)境內(nèi)分離到的流行毒株進(jìn)行氨基酸比對(duì)分析，共發(fā)現(xiàn)了5個(gè)主要位點(diǎn)的差異，分別是第44、219、375、386位和第418位氨基酸。見(jiàn)表1。

表1 CDV與CPV疫苗毒重要結(jié)合位點(diǎn)差異分析Table 1 Difference analysis of important binding sites of CDV and CPV vaccine virus

3 討論

同源性是指在進(jìn)化過(guò)程中源于同一祖先的分支之間的關(guān)系，疫苗毒株與流行毒株的同源性越高，從某種程度上來(lái)講越能提供更高的保護(hù)力。本試驗(yàn)通過(guò)比較不同廠家疫苗毒株序列與國(guó)內(nèi)流行毒株的序列的差異，對(duì)其同源性進(jìn)行分析，A廠和B廠生產(chǎn)的犬四聯(lián)活疫苗比較，兩者犬瘟熱、犬細(xì)小毒株序列同源性均較高，分別為CDV 92.9%和CPV 98.6%，但B廠家的CDV和CPV毒株序列與國(guó)內(nèi)已發(fā)表的流行毒株相比同源性略高于A廠家。毒株關(guān)鍵蛋白的幾個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)堿基、氨基酸的變化就會(huì)影響病毒的生物學(xué)特征，決定病毒抗原特性及宿主范圍的改變。而本試驗(yàn)針對(duì)的CDV的H蛋白和CPV的VP2蛋白正是起決定作用的關(guān)鍵蛋白。CDV的H蛋白個(gè)別氨基酸位點(diǎn)改變會(huì)影響與SLAM受體的結(jié)合能力，從而影響免疫機(jī)制的工作，本試驗(yàn)選取的A廠家和B廠家2個(gè)廠家在H蛋白的關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸均有不同程度的變化，理論上來(lái)說(shuō)，免疫效果也有略微差異，而宿主的免疫機(jī)制以及身體因素也是免疫效果的重要方面。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，CPV的變異主要存在于第323、426、440位。第323位氨基酸可以影響病毒與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的結(jié)合[5]；第426位決定CPV的突變株類型，CPV-2a為天冬酰胺(N)，CPV-2b為天冬氨酸(D)。2000年，CPV-2c的出現(xiàn)則是VP2基因上第426位氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼?E)。這種新的變異株在美國(guó)、意大利、巴西、印度等地都有出現(xiàn)過(guò)。第440位氨基酸位于GH LOOP區(qū)，相關(guān)報(bào)道指出，第440位氨基酸(Thr→Ala)的高突變與抗原的不斷變異有關(guān)，進(jìn)一步表明該位點(diǎn)具有高突變性[6]。而本試驗(yàn)的2個(gè) 廠家的疫苗在幾個(gè)主要變異位點(diǎn)上均一致，可以推測(cè)，在細(xì)小病毒的防控方面2個(gè)廠家差異不大。目前CPV在全球的防控仍較嚴(yán)峻，有文獻(xiàn)報(bào)道免疫過(guò)細(xì)小病毒疫苗的犬仍有患病的風(fēng)險(xiǎn)[7-8]。

犬四聯(lián)疫苗的選擇需要考慮以下幾個(gè)因素:毒株匹配度、抗原含量、佐劑等。綜合分析，想要給予飼養(yǎng)犬只更好的保護(hù)，接種疫苗無(wú)疑是最好的選擇，但疫苗產(chǎn)品與廠家的選擇要從多方面來(lái)綜合考慮，不能單憑一個(gè)方面來(lái)下結(jié)論。