豬多病原混合感染的實(shí)驗(yàn)室診斷

崔曉純 ， 魏婧潔 ， 張啟龍 , 張永紅 ， 胡 格， 楊佐君

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 北京 昌平 102206 ; 2.北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 , 北京 大興 102629)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的頭號(hào)豬病，自1995年底于我國(guó)華北地區(qū)暴發(fā)以來，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，現(xiàn)已成為豬場(chǎng)“常在性”疫病。豬瘟(Classical swine fever，CSF)俗稱“爛腸瘟”，是由黃病毒科豬瘟病毒屬的豬瘟病毒引起的一種急性、發(fā)熱、接觸性傳染病，近年來的防控效果總體較好[1-4]。2017年，我國(guó)PRRS的發(fā)生情況總體平穩(wěn)，但仍不穩(wěn)定，有數(shù)據(jù)表明，我國(guó)豬場(chǎng)疫苗免疫或豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染仍然十分普遍，該病依舊是嚴(yán)重影響?zhàn)B豬生產(chǎn)的首要疫病 ； CSF在臨床上則以散發(fā)病例和非典型豬瘟為主，在散養(yǎng)、中小型豬場(chǎng)多見[2]。

北京市平谷區(qū)某養(yǎng)殖戶所養(yǎng)的保育豬，于2017年11月左右開始發(fā)病，2018年年初養(yǎng)殖戶決定對(duì)所養(yǎng)仔豬進(jìn)行診治。本試驗(yàn)通過常規(guī)PCR、熒光定量PCR檢測(cè)、細(xì)菌分離培養(yǎng)及鑒定、藥敏試驗(yàn)，結(jié)合流行病學(xué)、臨診癥狀及病理變化等方法，對(duì)病豬進(jìn)行了診斷。據(jù)所送檢的發(fā)病豬的確診結(jié)果，對(duì)該養(yǎng)殖戶提出針對(duì)性防治措施以減少損失。

1 材料與方法

1.1 背景資料及發(fā)病情況 北京市平谷區(qū)某養(yǎng)殖戶所養(yǎng)的保育豬2017年9月共產(chǎn)仔豬60多頭，截止到2018年1月8日，只存活10多頭，死亡率約83%。在保育階段的后期(60 d左右)，仔豬體重15～20 kg時(shí)表現(xiàn)出臨床癥狀。發(fā)病豬臨床表現(xiàn)為消瘦，關(guān)節(jié)腫大，皮膚發(fā)紅、潰爛，有的皮膚有黑痂，咳喘，打噴嚏，流鼻液，腹瀉，步態(tài)不穩(wěn)，昏睡等。曾用中草藥治療，但用藥后未見好轉(zhuǎn)。養(yǎng)殖戶每年2次給母豬免疫碩騰公司生產(chǎn)的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟二聯(lián)活疫苗和豬偽狂犬病活疫苗，仔豬在出生20多天后免疫豬偽狂犬病活疫苗。

1.2 病理剖檢與病料采集 對(duì)送檢的1頭發(fā)病保育豬進(jìn)行病理剖檢，剖檢過程中采集病變明顯的肝臟、脾臟、肺臟、腸系膜淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)等組織并記錄病理變化。

1.3 主要試劑 TGuide S32磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司;豬瘟病毒核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針法)、豬繁殖與呼吸綜合征(藍(lán)耳病)病毒變異株核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針法)，均購自廣州達(dá)安基因生物科技有限公司；VITEK革蘭陰性菌鑒定卡(GN)，購自生物梅里埃公司；PCR Master Mix，購自Promega 公司；100 bp DNA Ladder (Dye Plus)，購自TaKaRa公司；PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；藥敏紙片，購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.4 病毒病原學(xué)檢測(cè)

1.4.1 病料總RNA的提取 將脾臟、肺臟、淋巴結(jié)等組織剪碎，與生理鹽水按1 kg/L的比例放入離心管，加入幾顆研磨鋼珠后放入全自動(dòng)樣品快速研磨儀，70 Hz，60 s，研磨5～6次后，12 000 r/min離心1 min， 取上清后按照TGuide S32磁珠法病毒DNA/RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4.2 CSFV和HP-PRRSV的熒光定量RT-PCR檢測(cè) 參照豬瘟病毒核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針法)和豬繁殖與呼吸綜合征(藍(lán)耳病)病毒變異株核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針法)的說明書進(jìn)行PCR試劑準(zhǔn)備和加樣，將熒光PCR儀按說明書設(shè)定好程序后對(duì)上述2種病毒進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè)。

1.5 細(xì)菌分離培養(yǎng)、鑒定及藥敏試驗(yàn)

1.5.1 細(xì)菌分離和培養(yǎng) 無菌取病豬病變明顯的肝臟、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、肺臟等組織，接種于TSA培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后選擇有菌落生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，挑取菌落于TSA培養(yǎng)基進(jìn)行劃線分離，37 ℃培養(yǎng)，24 h后觀察結(jié)果。再挑取單菌落，在三糖鐵培養(yǎng)基中穿刺劃線培養(yǎng)，在麥康凱培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基上進(jìn)行鑒別培養(yǎng)，條件均為37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.5.2 細(xì)菌染色鏡檢 挑取TSA培養(yǎng)基上的單菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢。

1.5.3 生化鑒定 根據(jù)革蘭染色鏡檢結(jié)果，選擇VITEK革蘭陰性菌鑒定卡(GN)，按照全自動(dòng)微生物鑒定與藥敏分析儀操作規(guī)程在濁度管內(nèi)制出濁度為0.5～0.63的菌液后上機(jī)進(jìn)行生化鑒定。

1.5.4 PCR鑒定 分別無菌挑取3個(gè)、5個(gè)菌落，分別加到含有200 μL ddH2O的離心管內(nèi)，煮沸10 min后立即放入冰水混合物中，冰水浴3 min，12 000 r/min離心2 min，以上清液作為PCR反應(yīng)的模板DNA混合液。沙門菌屬的特異性PCR引物序列：上游：5′-CGATCCGAAGACCCTCAA-3′，下游：5′-CAAT-AACGCATTCAAACCT-3′，擴(kuò)增片段大小為463 bp[5]。PCR反應(yīng)體系參照安輝等[6]的方法。待反應(yīng)結(jié)束后，于2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，使用凝膠成像儀觀察是否有目的條帶。

1.5.5 紙片法藥物敏感試驗(yàn) 用棉簽取1個(gè)菌落，用“十”字形劃線法于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板表面劃均勻。將β-內(nèi)酰胺類的阿莫西林，頭孢類的頭孢噻肟，氨基糖苷類的慶大霉素、鏈霉素和新霉素，四環(huán)素類的四環(huán)素，喹諾酮類的環(huán)丙沙星和氧氟沙星，共8種藥物的藥敏片分別貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，用無菌鑷子壓紙片使其與培養(yǎng)基表面貼牢。紙片與紙片中心距離大于24 mm。貼上紙片15 min內(nèi)將平板倒放于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 病理剖檢 送檢病豬生前消瘦、腹瀉、精神沉郁、站立不穩(wěn)。剖檢結(jié)果可見肝臟表面連成片狀的出血點(diǎn)，腸系膜淋巴結(jié)腫大，心包積液，心臟表面有淡黃色膠胨樣物質(zhì)，肺肉質(zhì)變，小腸黏膜潰瘍，盲腸黏膜潰瘍，如中插彩版圖1～7。

圖1 肝臟剖檢結(jié)果Fig.1 Results of liver autopsy

圖3 心包剖檢結(jié)果Fig.3 Results of pericardial autopsy

圖5 肺剖檢結(jié)果Fig.5 Results of lung autopsy

圖2 腸系膜剖檢結(jié)果Fig.2 Results of mesenteric autopsy

圖4 心臟剖檢結(jié)果Fig.4 Results of cardiac autopsy

圖6 小腸黏膜剖檢結(jié)果Fig.6 Results of small intestinal mucosal autopsy

圖7 盲腸黏膜剖檢結(jié)果Fig.7 Results of cecal mucosal autopsy

2.2 病毒檢測(cè) 使用豬瘟病毒核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針法)和豬繁殖與呼吸綜合征(藍(lán)耳病)病毒變異株核酸檢測(cè)試劑盒對(duì)組織樣品進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，陽性對(duì)照和組織樣品均有擴(kuò)增，而陰性對(duì)照沒有擴(kuò)增，見圖8。

圖8 HP-PRRSV和CSFV熒光定量PCR結(jié)果Fig.8 Fluorescence quantitative PCR results of HP-PRRSV and CSFVA: CSFV陽性樣品①； B: CSFV陽性樣品②； C: CSFV陽性對(duì)照； D: CSFV陰性對(duì)照； E: HP-PRRSV陽性對(duì)照； F: HP-PRRSV陽性樣品①； G: HP-PRRSV陽性樣品②; H: CSFV陰性對(duì)照A: CSFV positive sample ①; B: CSFV positive sample ②; C: CSFV positive control; D: CSFV negative control; E: HP-PRRSV positive control; F: HP-PRRSV positive sample ①; G: HP-PRRSV positive sample ②; H: CSFV negative control

2.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)及鑒定

2.3.1 細(xì)菌分離和培養(yǎng) 肝臟和腸系膜淋巴結(jié)組織所接種的TSA培養(yǎng)基上，形成了相似的菌落；其他組織接種的培養(yǎng)基上沒有菌落生長(zhǎng)。TSA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為細(xì)小的圓形、表面光滑、乳白色、邊緣整齊、濕潤(rùn)的菌落。分別挑取來自肝臟和腸系膜淋巴結(jié)組織的菌落，穿刺劃線接種于三糖鐵培養(yǎng)基，并在麥康凱培養(yǎng)基和SS培養(yǎng)基上進(jìn)行鑒別培養(yǎng)。2個(gè)組織來源的菌落，在各個(gè)培養(yǎng)基中培養(yǎng)結(jié)果表現(xiàn)一致，均為三糖鐵培養(yǎng)基斜面為紅色(產(chǎn)堿)、底層為黃色(產(chǎn)酸)、培養(yǎng)基部分變黑(產(chǎn)硫化氫)、不產(chǎn)氣；麥康凱培養(yǎng)基上形成細(xì)小的圓形、表面光滑、透明、邊緣整齊、濕潤(rùn)的菌落；在SS培養(yǎng)基上形成細(xì)小的圓形、表面光滑、透明、邊緣整齊、濕潤(rùn)且中心為黑色的菌落。

2.3.2 細(xì)菌染色鏡檢 分別挑取TSA培養(yǎng)基上來源于肝臟和腸系膜淋巴結(jié)組織的單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色并鏡檢，均見革蘭染色陰性、中等大小的直桿狀細(xì)菌，如中插彩版圖9。

圖9 沙門菌革蘭染色結(jié)果 (100×)Fig.9 Gram staining results of Salmonella (100×)

2.3.3 生化試驗(yàn) 來自肝臟和腸系膜淋巴結(jié)的分離純化菌落，經(jīng)全自動(dòng)微生物鑒定與藥敏分析儀鑒定，均為沙門菌，可信度為99%。

2.3.4 PCR鑒定 PCR擴(kuò)增出約463 bp的特異性條帶，結(jié)果條帶與目的條帶片段大小一致，見圖10。

圖10 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.10 Results of agarose gel electrophoresis of PCR productsM: 100 bp DNA lander； A、B:分離菌株； C:陰性對(duì)照M: 100 bp DNA lander; A、B: Isolated bacterial strain; C: Negative control

2.3.5 藥物敏感試驗(yàn) 該菌對(duì)阿莫西林、慶大霉素、氧氟沙星敏感；對(duì)頭孢噻肟、鏈霉素、新霉素、環(huán)丙沙星中度敏感；對(duì)四環(huán)素耐藥。

3 討論

根據(jù)發(fā)病豬呼吸困難等臨床癥狀，肺肉樣變、肝臟表面出血點(diǎn)、腸黏膜潰瘍等病理剖檢表現(xiàn)和熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，確定病豬存在HP-PRRSV、CSFV 感染[7]；分離到的細(xì)菌可在麥康凱、SS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，確定感染細(xì)菌為腸道菌；根據(jù)其培養(yǎng)特性、形態(tài)及染色特性、生化鑒定以及PCR鑒定結(jié)果，確定分離得到的細(xì)菌為沙門菌[8]，且對(duì)氧氟沙星、慶大霉素、阿奇霉素敏感。由此確診病豬為HP-PRRSV、CSFV 和沙門菌混合感染所致。

PRRSV和CSFV 感染豬后均可損壞其免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致免疫抑制，2種病毒的共感染具有明顯的協(xié)同致病作用。HP-PRRSV 的出現(xiàn)及其與CSFV的共感染常伴隨其他病原微生物的混合感染或/和繼發(fā)感染，明顯提高了豬群的發(fā)病率和死亡率，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的威脅[9]。PRRS和CSF 都是豬易感的病毒性傳染病，2種疾病混合感染大大提高了檢測(cè)難度，且臨床中2種疾病引起的臨床表現(xiàn)極其相似，確診需借助實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，PCR 檢測(cè)方法具有敏感性高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，是目前疾病診斷最簡(jiǎn)單、最準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)方法，在基層動(dòng)物疾病檢測(cè)中得到了廣泛應(yīng)用[10]。鑒于此，本試驗(yàn)采用PCR 方法結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)法對(duì)病例進(jìn)行了確診，為豬場(chǎng)后期及時(shí)采取預(yù)防和治療措施提供了保障。對(duì)于PRRSV和CSFV的防控都以疫苗免疫為主，在疫苗接種時(shí)要注意免疫途徑和免疫劑量，防止發(fā)生免疫失敗。同時(shí)在臨床治療時(shí)應(yīng)選用敏感抗生素控制細(xì)菌的繼發(fā)感染。

無論是規(guī)模化養(yǎng)豬場(chǎng)，還是農(nóng)村小規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)和散養(yǎng)戶，對(duì)于疫病的防控均要貫徹“預(yù)防為主”的方針，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，搞好環(huán)境衛(wèi)生。堅(jiān)持自繁自養(yǎng)和全進(jìn)全出的原則；同時(shí)保證豬群充足的營(yíng)養(yǎng)，減少應(yīng)激；豬舍保持良好的通風(fēng)和適宜的溫度、濕度；定期消毒，交替使用消毒藥，防止耐藥菌株的產(chǎn)生。只有這樣才能最大限度地減少各類疫病的發(fā)生，最大限度地減少經(jīng)濟(jì)損失[11]。