馬來亞豪豬中國亞種皮膚傷口無疤痕愈合能力的研究

李彥翯，尹 俊

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

豪豬（Hystrix）又稱箭豬，以背部長有棘刺而聞名，具有較高的觀賞價值、經(jīng)濟價值和科學研究價值。 豪豬在分類學上屬于脊椎動物門哺乳綱真獸亞綱嚙齒目豪豬科，在豪豬科內(nèi)，又可以細致劃分為3 個屬，分別為帚尾豪豬屬、豪豬屬和長尾 豪 豬 屬［1-4］。

在3 個屬的豪豬中，豪豬屬（Hystrix）的體型較為肥大，最大者體長在70 cm 以上［5-6］。豪豬屬為嚙齒目豪豬科的1 屬，通稱豪豬，共8 種，分別是開普敦豪豬（Hystrix africaeaustralis）、非洲冕豪豬（Hystrix cristata）、馬來亞豪豬（Hystrix brachyura）、粗棘印尼豪豬（Hystrix crassispinis）、冠豪豬（Hystrix indicus）、爪哇豪豬（Hystrix javanica）、巴拉望豪豬 （Hystrix pumila）、 蘇門答臘豪豬（Hystrix sumatrae）， 中國僅1 種， 即馬來亞豪豬中國亞種（Hystrix brachyura hodgsoni）。

馬來亞豪豬中國亞種（以下簡稱馬來亞豪豬）廣泛分布于我國的中原和南方地區(qū)的森林和田野地帶，一般晝伏夜出，以植物為食，是一種珍稀的陸生野生動物，因為具有很高的食用、藥用和觀賞價值，深受消費者喜愛。馬來亞豪豬整個頭部與老鼠的頭部外形相似，顴弓不外擴，但鼻腔膨大，具有頭小、眼小、四肢短粗的外形特征，口內(nèi)有20 枚齒根很淺的牙齒［7-10］。 馬來亞豪豬體表皮膚很脆弱，背部與尾部生有長而硬的棘刺，這些棘刺可以起到防御天敵的作用，遇到硬物極易脫落。

大多數(shù)動物具有一定的器官修復和組織再生的能力。皮膚是脊椎動物中面積最大的器官，擁有極強的自我修復能力， 可以通過不斷進行的新陳代謝完成修復和再生， 起到維持機體正常生命活動的作用，是機體抵御外在傷害的屏障［11-13］。 皮膚組織的修復分為兩種方式：第一種叫完全再生，也即組織的結(jié)構(gòu)和功能完全恢復到損傷前的狀態(tài)；第二種叫不完全再生， 也即傷口處不能恢復原有結(jié)構(gòu)和功能（損失的功能包括皮膚張力下降或缺失等），由纖維組織增生代替缺損組織［14］。皮膚的不完全再生過程，會導致疤痕的形成。

疤痕的產(chǎn)生主要是因為在皮膚組織修復過程中，傷口感染的部位膠原蛋白丟失過多，導致傷口變得脆弱的同時， 皮膚和筋膜不會再獲得充分的張力， 這些原因?qū)е略趥谥匦滤苄纹陂g極容易產(chǎn)生疤痕。疤痕形成后，即使愈合傷口處的張力已恢復正常，但仍缺少彈性，而傷口軟組織彈性的消失，還可能導致皮膚明顯的功能障礙［15］。在豪豬的養(yǎng)殖過程中， 經(jīng)常出現(xiàn)因打斗發(fā)生皮膚撕裂的情況，但在皮膚撕裂后，傷口能快速以無疤痕方式收縮愈合，皮膚組織張力得到明顯恢復，顯示出極特殊的傷口愈合能力，極具研究價值。

為了探索豪豬傷口愈合的過程與皮膚無疤痕修復機制，以馬來亞豪豬的耳朵為研究對象，制造了貫穿傷與撕裂傷兩種傷口， 對二者的愈合過程進行了形態(tài)學觀察。 以期通過研究豪豬無疤痕傷口愈合方式，了解皮膚無疤痕修復的機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 馬來亞豪豬中國亞種： 河南省新密市某豪豬養(yǎng)殖場，雄性豪豬3 只。

1.1.2 試劑 注射用鹽酸替來他明鹽酸唑拉西泮（Virbac S.A.）， 多聚甲醛（sigma，P6148），石蠟（Leica），二甲苯（天津市登科化學試劑有限公司），無水乙醇（天津市登科化學試劑有限公司），組織防脫載玻片（海門市神鷹實驗器材廠），蓋玻片（天津市登科化學試劑有限公司）， 伊紅（sigma，HT110116-500 mL），蘇木素（sigma，GHS116-500 mL），鹽酸（天津市化學試劑三廠），碳酸鋰（天津市化學試劑三廠），中性樹膠（國藥集團化學試劑有限公司）等。

1.1.3 試驗儀器及耗材 剪刀，手術(shù)刀，止血鉗，取樣管，記號筆，相機，冰箱，搖床，恒溫箱等。

1.2 試驗方法

1.2.1 豪豬耳朵貫穿傷口 在豪豬的一只耳朵上制造直徑1 cm 的穿孔（見圖1），以7 d 為節(jié)點進行拍照和記錄其傷口愈合狀況。

圖1 豪豬耳朵貫穿傷口

1.2.2 豪豬耳朵撕裂傷口 對豪豬另一只耳朵制造0.5 cm×1 cm 的撕裂傷口（見圖2），以7 d 為節(jié)點分別為豪豬耳朵傷口拍照， 用尺子對傷口直徑進行垂直和橫向測量，用于計算傷口表面積。創(chuàng)面愈合率計算公式：創(chuàng)面愈合率＝（原始創(chuàng)面面積－當前創(chuàng)面面積）/原始創(chuàng)面面積×100%。

圖2 豪豬耳朵撕裂傷口

1.3 傷口愈合組織切片

1.3.1 愈合組織取材 豪豬做撕裂處理的耳朵傷口愈合部位的部分區(qū)域選取大小為0.5 cm×1 cm的皮膚組織（要求此區(qū)域的皮膚完好無疤痕），用碘伏和酒精棉依次擦拭所選部位， 并對采集工具如手術(shù)刀、剪子、止血鉗、鑷子等用酒精棉擦拭消毒。將豪豬麻醉，用手術(shù)刀片割取所選部位的皮膚組織，將所取的皮膚組織放入事先配好的4%多聚甲醛溶液，4 ℃過夜處理。

1.3.2 豪豬皮膚樣本的處理 次日將經(jīng)多聚甲醛溶液過夜處理好的皮膚組織樣品取出， 用70%、80%、95%、100%酒精對皮膚進行梯度脫水， 每次需用搖床振蕩1 h，次日更換1 次無水乙醇，-20 ℃保存。

1.3.3 豪豬皮膚樣品石蠟組織切片的制作［16］

①修整組織塊： 取已經(jīng)處理好的皮膚組織樣品，用事先消毒的手術(shù)刀和鑷子修整皮膚組織，使皮膚組織上毛的方向與皮膚紋理的方向一致。

②透明： 將修整好的皮膚組織樣品放入二甲苯，使皮膚組織透明，透明過程中隨時觀察組織顏色變化，判斷組織透明程度。若首次二甲苯透明不完全，可以更換幾次二甲苯提高透明的效率，直到組織可以透過光線。

③浸蠟：取透明好的皮膚組織樣品，放入50%石蠟（熔點為58 ℃）和50%二甲苯的混合溶液過渡1.5 h；再用石蠟（熔點為58 ℃）浸浴組織1.5 h，然后換用熔點為60 ℃的石蠟對皮膚組織浸蠟1.5 h，以上步驟都在60 ℃的恒溫箱中進行。

④修塊：待浸蠟完成后，將組織和石蠟一起倒入事先準備好的模具，快速用準備好的鑷子調(diào)整好皮膚組織的毛囊方向后進行包埋， 放入4 ℃冰箱中靜置一夜，待次日石蠟完全凝固后，將包埋好的蠟塊從模具中取下， 切除邊緣多余的石蠟進行修整，制成含有皮膚組織的石蠟塊，并在石蠟底座處做好標記，以便后期制作切片用。

⑤切片： 將包埋好的皮膚組織石蠟塊用切片機切成7～9 μm 薄厚的石蠟切片，在載玻片上記錄好時間后保存于切片盒中，以便后期鏡下觀察。

1.3.4 豪豬皮膚樣品石蠟組織切片的HE 染色

1.3.4.1 試劑配制 將伊紅用蒸餾水稀釋2～3倍，配制成伊紅溶液備用。 以70%的酒精為溶劑，將濃鹽酸配制成終濃度為0.5%的鹽酸溶液作為分化液。

1.3.4.2 烘片 將石蠟切片放入烘片機 （60 ℃），待石蠟融化后取出，使溫度降至室溫。

1.3.4.3 石蠟切片的染色

（a）石蠟切片的脫蠟水化：①二甲苯（Ⅰ）脫蠟5 min→②二甲苯 （Ⅱ） 脫蠟5 min→③無水乙醇（Ⅰ）5 min→④無水乙醇（Ⅱ）5 min→⑤95%乙醇3 min→⑥80%乙醇3 min→⑦70%乙醇3 min→⑧蒸餾水3 min。

（b）蘇木素染色：將切片用蘇木素染液染色11 min，之后用自來水沖洗1 min。

（c）分化：分化液分化2 s，自來水沖洗20 s，洗掉分化液即可。

（d）返藍液返藍：用飽和碳酸鋰返藍30 s，自來水沖洗20 s，洗掉返藍液即可。

（e）伊紅染色：伊紅染色8 s，自來水沖洗3 s。

（f）脫水、透明、封片：①80%乙醇3 min→②90%乙醇3 min→③95%乙醇（Ⅰ）3 min→④95%乙醇（Ⅱ）3 min→⑤無水乙醇（Ⅰ）3 min→⑥無水乙醇 （Ⅱ）3 min→⑦二甲苯 （Ⅰ）3 min→⑧二甲苯（Ⅱ）3 min→⑨中性樹膠固封，鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 豪豬傷口愈合過程觀察分析

貫穿傷的傷口如圖3 所示，創(chuàng)緣分離，不能嚴密對合，屬于開放性創(chuàng)口，創(chuàng)面較大，常伴有感染。由于豪豬個體間差異， 其傷口再生速度會略有不同，對0～63 d 的幾個時間點的傷口愈合情況進行了觀察分析。 在傷口形成的第1 天，3 只豪豬的耳朵傷患處出現(xiàn)紅腫，炎癥反應明顯；第7 天上皮化明顯，壞死組織被清除以后，組織再生開始；第14天，因傷口較大，傷口收縮明顯，壞死組織脫落基本完成；在第21 天，大量的肉芽組織從傷口的底部或邊緣生長出來，填充傷口，愈合傷口邊緣；第35～63 天傷口處沒有明顯的開口表面積的關(guān)閉。由此可以說明經(jīng)過穿孔的耳朵， 因被破壞了軟骨結(jié)構(gòu)，耳部傷口不能完成再生，所以耳朵愈合過程迅速停止。

圖3 豪豬耳朵貫穿傷口愈合過程圖

撕裂傷的傷口（見圖4），在第0 天和第63 天之間的常規(guī)時間點進行了撕裂傷的觀察。 3 只豪豬的耳朵傷患處在第1 天傷口少量出血并產(chǎn)生血凝塊，局部血管反應的特征為初期血管收縮，炎癥反應輕微。 在24～48 h 內(nèi)傷口表面或邊緣可以相對較快地止血，但不能有效地進行愈合，創(chuàng)面表現(xiàn)為充血、漿液滲出及白細胞游出，局部紅腫；在第7 天，表皮開始生長，表面由滲出液中的纖維蛋白原、 血液及壞死脫落的物質(zhì)經(jīng)過干燥形成一層黑褐色表皮； 第14 天可見傷口處組織開始變白，新生血管、肉芽組織和結(jié)締組織形成，新的毛細血管清晰可見。 21 d 后覆蓋傷口表面的表皮結(jié)構(gòu)已基本正常， 纖維組織仍富含細胞， 膠原組織不斷增加，抗拉力強度增加，耳朵新生組織處的張力慢慢恢復，富有彈性；28 d 后，邊緣的整層皮膚及皮下組織向中心移動，于是傷口迅速縮小，第35 天至第56 天傷口處白色結(jié)締組織面積縮小， 可以觀察到新生長出來的皮膚組織的顏色由淺變深， 第63天傷口完全愈合并且無疤痕產(chǎn)生。

圖4 豪豬耳朵撕裂傷口愈合過程圖

在受傷63 d 后，3 只豪豬耳朵撕裂傷都完成了傷口愈合。從兩種傷口恢復過程可以看出，貫穿傷因破壞了豪豬的軟骨構(gòu)架，不能進行完全愈合。撕裂傷面積較大， 但由于豪豬有著極強的傷口愈合能力（見圖5），可以在63 d 內(nèi)以無疤痕的方式進行了表皮和毛囊完全再生。

圖5 豪豬耳朵傷口愈合速率

2.2 豪豬耳朵創(chuàng)面組織學分析

對豪豬完全愈合的撕裂傷創(chuàng)面進行取樣，做石蠟切片和HE 染色進行組織學分析。

將豪豬耳朵愈合組織進行石蠟切片和HE 染色處理，用顯微鏡拍照，兩個豪豬創(chuàng)傷愈合后的組織學圖片整理結(jié)果如圖6 所示：豪豬傷口愈合后，愈合后的傷口組織即為正常的組織， 可觀察到表皮層和真皮層，層次分明，排列有序。

組織學檢查表明， 完好的未經(jīng)處理的豪豬耳朵組織，毛囊（如圖6A1、A2黑色箭頭所示）、脂肪組織（如圖6A1、A2白色箭頭所示）、皮脂腺（如圖6A1、A2紅色箭頭所示）、毛細血管清晰可見，表皮完整（見圖6A1、A2）。 傷口愈合后的新組織未見疤痕組織（見圖6B1、B2），由正常的細胞組成，即脂肪組織（圖6B1、B2白色箭頭所示）、毛囊（圖6B1、B2黑色箭頭所示）、 皮脂腺 （圖6B1、B2紅色箭頭所示）、真皮和表皮等。 愈合后的耳朵組織結(jié)構(gòu)與正常未受傷的耳朵結(jié)構(gòu)相似。由此可知，豪豬耳朵無疤痕傷口愈合后能夠維持正常的生理功能及活動，實現(xiàn)了完全再生。

圖6 豪豬耳朵皮膚組織在不同時間點的病理學變化

3 討論

皮膚再生與修復，又稱傷口愈合，是指皮膚受到外力作用導致破損或缺損后的愈合， 損傷組織修復使得組織細胞再生。傷口愈合期間因傷口大，組織缺損多，創(chuàng)口邊緣分離較遠，所以易受感染。只有控制感染，清除壞死組織方能開始再生。許多動物因傷口處受傷嚴重，愈合時間較長，導致在傷口愈合前遺留明顯疤痕。 耳朵是一個結(jié)構(gòu)簡單的器官，耳朵中央由薄的彈性軟骨組成，外層有脂肪組織和肌肉層，最外層是真皮和表皮，蘊含豐富的毛囊和皮脂腺，含有較少的表皮附屬物。選擇耳朵作為研究對象更加方便進行組織學觀察。

接受外科手術(shù)或有嚴重創(chuàng)傷（特別是燒傷）的患者會出現(xiàn)疤痕，導致永久性功能喪失和毛囊等附屬物的缺失［17］，這屬于不完全再生。相比之下，完全再生意味著在損傷后幾乎完全重現(xiàn)原始組織結(jié)構(gòu)。 1953 年研究者首次描述了兔子耳孔的無疤痕閉合［18-19］和非洲刺鼠的皮膚傷口再生［20-21］過程，研究發(fā)現(xiàn)這兩個物種的皮膚均顯示出一定的撕裂性，導致的大面積傷口能夠在2 個月內(nèi)完全閉合，組織學檢查顯示再生區(qū)含有真皮、表皮、軟骨、毛囊和脂肪組織，由于同不完全再生相比，它們能夠通過修復使皮膚具有完整的原始組織結(jié)構(gòu)， 故被稱為完全再生。

盡管非洲刺鼠皮膚傷口再生的試驗取得了一些進展， 但哺乳動物毛囊的再生還遠未被充分了解， 部分限制因素是哺乳動物的毛囊再生實例仍然很少。豪豬、刺鼠和兔子等物種由于皮膚脆弱而具有撕裂傾向，導致面積較大的傷口，在傷口處的表皮和毛囊可在一定時間內(nèi)進行再生［22-23］，而豪豬的這種再生表型在其耳朵傷口愈合中充分體現(xiàn)了無疤痕再生的過程。

通過對豪豬耳朵貫穿傷口和撕裂傷口的比較， 分別對其耳朵制造0.5 cm×1 cm 的撕裂傷和1 cm×1 cm 的貫穿傷口，結(jié)果顯示貫穿傷的軟骨組織無法完全再生， 貫穿傷口的耳朵只是愈合了傷口的邊界，沒有明顯的傷口閉合，不能再生軟骨結(jié)構(gòu)，而撕裂傷口能夠在63 d 內(nèi)以無疤痕的方式完全愈合，這一過程再現(xiàn)了豪豬傷口再生的進程，豪豬耳朵撕裂傷能夠以無疤痕的方式進行表皮、皮脂腺、毛囊等修復的傷口愈合，提供了一個理想的模型系統(tǒng)，以便檢查哺乳動物的表觀形態(tài)再生。