葡萄籽原花青素低聚體治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的機(jī)制研究

薛麗媛，王 青，丁智斌，苗 強(qiáng)，李彥青，宋麗娟，3，李艷花，尉杰忠，5，王穎莉，馬存根，3，

多發(fā)性硬化癥是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥性脫髓鞘疾病，影響全世界200多萬(wàn)人，主要病理特征包括炎癥、脫髓鞘、軸突丟失和膠質(zhì)細(xì)胞增殖等[1]。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是研究多發(fā)性硬化癥的經(jīng)典動(dòng)物模型，具有相似的多發(fā)性硬化癥特征[2]。目前治療多發(fā)性硬化癥的藥物主要是激素和免疫抑制劑，副作用多，價(jià)格昂貴[3]。因此，研究致力于從天然化合物中尋找活性成分，探索新型治療藥物[4]。

原花青素(procyanidins，PC)是從植物的皮、殼和種子中提取獲得的一類具有代表性的黃烷醇類化合物，低毒性、高效率和生物利用度高的特點(diǎn)[5]。PC是由兒茶素或表兒茶素聚合而成，根據(jù)聚合程度不同分為原花青素低聚物(procyanidolic oligomers，OPC，二聚體到四聚體)和原花青素高聚體(procyanidolic polymers，PPC，五聚體以上的聚合物)[6]。葡萄籽含有豐富的PC，具有抗氧化、抗炎、抗癌、神經(jīng)保護(hù)等作用[7]。有研究顯示，PC對(duì)阿爾茨海默病和多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病顯示出良好的臨床療效[8-11]。然而，PC治療多發(fā)性硬化癥的相關(guān)研究較少。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從多層次，如靶點(diǎn)和途徑，系統(tǒng)闡明藥物的作用機(jī)制[12]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與實(shí)驗(yàn)結(jié)合的方法分析葡萄籽原花青素低聚體(grape seed oligomeric procyanidins，GPC)治療EAE小鼠的作用機(jī)制，為GPC在多發(fā)性硬化癥治療中的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 有效成分的篩選和GPC目標(biāo)的預(yù)測(cè) 使用PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索參考文獻(xiàn)，并收集GPC中具有神經(jīng)保護(hù)作用的活性化合物。之后從PharmMapper(http://www.lilabecust.cn/pharmmapper/)和STITCH(http://stitch.embl.de/)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得目標(biāo)靶點(diǎn)。來(lái)自PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)的靶點(diǎn)通過(guò)分?jǐn)?shù)>0.9進(jìn)行篩選，通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org/)對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。利用Cytoscape 3.6.1軟件繪制“藥物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.1.2 獲取多發(fā)性硬化癥的相關(guān)靶基因 利用人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneCards，https://www.genecards.org/)和人類孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)(OMIM，https://omim.org/)，通過(guò)檢索“multiple sclerosis”檢索多發(fā)性硬化癥的相關(guān)靶基因。通過(guò)相關(guān)性評(píng)分>6.705對(duì)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中的靶基因進(jìn)行篩選。

1.1.3 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和拓?fù)浞治?利用Cytoscape拓?fù)浞治龉δ芊治龅鞍踪|(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)中靶基因的平均自由度和最大自由度的拓?fù)鋮?shù)。利用Excel函數(shù)功能獲取藥物與疾病靶點(diǎn)的交集，得到GPC對(duì)多發(fā)性硬化癥的治療靶點(diǎn)，并在微生物信息平臺(tái)(https://www.bioinformatics.com.cn)繪制韋恩圖。將目的基因引入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)中，以收集靶基因之間的功能關(guān)系。將所得數(shù)據(jù)引入Cytoscape 3.6.1軟件中，建立靶基因間的PPI網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 3.6.1繪制“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape拓?fù)浞治龉δ芊治鯬PI網(wǎng)絡(luò)中靶基因的平均自由度和最大自由度的拓?fù)鋮?shù)。

1.1.4 核心靶點(diǎn)的生物學(xué)功能和途徑富集分析 將1.1.3中獲得的核心目標(biāo)以“GeneSymbol”的格式導(dǎo)入DAVID6.8 (http://david.nifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因本體(GO)分析和京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。篩選出重要的生物學(xué)功能和核心通路(P<0.05，count≥7)，繪制氣泡圖。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和EAE模型的建立 10～12周齡的C57BL/6雌性小鼠(12只)，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)室溫為25 ℃，無(wú)致病菌。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。將MOG35-55多肽(myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55，上海強(qiáng)耀生物科技有限公司)每只小鼠200 μg溶解于生理鹽水，結(jié)核桿菌H37R(美國(guó) DIFCO公司)每只小鼠400 μg完全溶解于弗氏佐劑(美國(guó) Sigma公司)。每只小鼠注射抗原乳劑，誘導(dǎo)腰骶背膨大區(qū)的EAE。免疫時(shí)間記錄為免疫后第0天。每只小鼠在第0天和第2天腹腔注射300 ng百日咳毒素(PTX，美國(guó) ListLabs公司)。至少兩名研究員隔日對(duì)動(dòng)物進(jìn)行1次雙盲臨床評(píng)分評(píng)定。

1.3 GPC管理及臨床評(píng)分 將12只小鼠分為EAE對(duì)照組和GPC治療組，各6只。GPC購(gòu)自天津尖峰天然產(chǎn)品研發(fā)有限公司。從免疫后第3天至第28天，GPC治療組小鼠采用GPC灌胃[50 mg/(kg·d)][13-14]，對(duì)照組小鼠以生理鹽水灌胃。

采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的5分法，從第0天起定期觀察并評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)小鼠癥狀。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)任何臨床癥狀計(jì)0分；步態(tài)蹣跚或尾部張力喪失計(jì)1分；后肢和尾部部分癱瘓計(jì)2分(共濟(jì)失調(diào))；單側(cè)后肢和尾部全癱瘓計(jì)3分；雙后肢和尾部全癱瘓計(jì)4分；瀕死或死亡計(jì)5分。兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)之間的癥狀測(cè)量為±0.5分。

1.4 樣本收集和分析 免疫后第28天，每只小鼠以100～150 μL戊巴比妥鈉(10 g/L)在無(wú)菌條件下腹腔注射麻醉。之后將兩組各3只小鼠心內(nèi)灌注生理鹽水，磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH=7.4)中加入4%多聚甲醛灌注，固定分離出小鼠脊髓組織后，采用15%、25%、30%的蔗糖溶液浸泡24 h，快速提取和脫水，包埋組織于液氮中快速冰凍。使用冰凍切片機(jī)(CM1850，德國(guó)Leica)獲得脊髓(10 μm)冠狀切片，并在4℃環(huán)境中保存，用于蘇木精-伊紅(hematoxylin/eosin，HE)、固藍(lán)(luxol fast blue，LFB)和免疫熒光染色。其余小鼠僅在心臟灌注生理鹽水取出脊髓，進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)和蛋白質(zhì)印跡法(Western Blotting)檢測(cè)。

1.4.1 組織學(xué)染色 采用HE和LFB染色檢測(cè)脊髓病理變化。HE染色：將玻片浸泡在蘇木精溶液中2 min，水中浸泡1 min，之后在伊紅溶液中浸泡10 min。之后在1%鹽酸乙醇中分化10 s。LFB染色：玻片在56 ℃條件下浸入固藍(lán)溶液中16 h，在95%乙醇和蒸餾水中去除過(guò)量的染液，在碳酸鋰溶液中分化15 s。采用蒸餾水和80%乙醇洗滌后，以梯度乙醇脫水，最后使用中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡(DM4000B，德國(guó)Leica公司)下成像一組匹配的連續(xù)切片(每只小鼠3片)。采用Image Pro Plus 6.0測(cè)量脊髓HE染色浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)量和LFB染色的累積光密度(>20個(gè)單核細(xì)胞/片)。

1.4.2 免疫熒光染色 將脊髓冰凍切片采用1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)在室溫下封閉30 min；兩組切片分別加入1%BSA配制的一抗髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)1∶500，4 ℃孵育過(guò)夜；次日PBST漂洗切片3次，之后加入相應(yīng)的二抗，在室溫下孵育1 h；PBST漂洗切片3次，孵育DAPI 5 min；甘油封片，并在熒光顯微鏡下以盲法觀察玻片；使用Image Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行光密度值測(cè)定。

1.4.3 ELISA檢測(cè) 根據(jù)說(shuō)明書步驟，采用ELISA試劑盒測(cè)定脊髓上清液中氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)指標(biāo)水平，包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)、活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)、γ-干擾素(interferon-γ，INF-γ)、白細(xì)胞介素17(interleukin-17，IL-17)、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)。讀取OD值(450 nm)，結(jié)果以pg/mL表示。

1.4.4 Western Blotting檢測(cè) 在免疫后第28天，采用生理鹽水灌胃小鼠，使用微量組織勻漿器(美國(guó) KimbleKontes)對(duì)脊髓進(jìn)行勻漿，使用蛋白質(zhì)提取試劑盒(美國(guó) Sigma)，輔以蛋白酶抑制劑。勻漿在4 ℃環(huán)境中以13 000 r/min離心20 min，收集上清液。采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。配SDS-PAGE膠，上樣等量蛋白質(zhì)(30μg)轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上(Imobilon-P，美國(guó) Millipore)。使用5%脫脂奶粉封閉，在4 ℃與一抗兔抗MBP抗體、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)抗體、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-related kinase，ERK)抗體、c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)抗體、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)抗體、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(p-ERK)抗體、磷酸化c-Jun氨基端激酶(p-JNK)抗體、β-actin抗體(1∶1 000，美國(guó)Bioworld)孵育過(guò)夜。次日洗膜后，與相應(yīng)二抗在室溫下?lián)u床孵育2 h。應(yīng)用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)法對(duì)波段進(jìn)行可視化。

2 結(jié) 果

2.1 GPC主要活性化合物和靶點(diǎn) 通過(guò)文獻(xiàn)檢索篩選出7種有效成分[15-21]，詳見(jiàn)表1。在PharmMapper和STITCH數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)了78個(gè)藥物靶點(diǎn)，在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。使用Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，詳見(jiàn)圖1。網(wǎng)絡(luò)由85個(gè)節(jié)點(diǎn)和215條邊組成。

圖1 “化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

2.2 疾病靶基因的預(yù)測(cè)和網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 分別在GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索“multiple sclerosis”，收集1 701個(gè)多發(fā)性硬化癥相關(guān)靶點(diǎn)(刪除重復(fù)項(xiàng))。將藥物的靶蛋白和疾病的靶基因取交集，獲得共同靶點(diǎn)，利用微生物信息平臺(tái)繪制Venny圖，詳見(jiàn)圖2A。使用STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape 3.6.1構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，詳見(jiàn)圖2B。網(wǎng)絡(luò)(隱藏1個(gè)斷開的節(jié)點(diǎn))由41個(gè)節(jié)點(diǎn)和260條邊組成。度值表示網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的重要性順序，度值越大，靶點(diǎn)越重要。平均度值為12.4，AKT1的度值最大(為32)。節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)，邊表示靶點(diǎn)間的交互關(guān)系。從網(wǎng)絡(luò)可以看出，AKT1、CASP3、MAPK1、EGFR、PTGS2、MAPK3、MAPK14、MAPK8是GPC治療多發(fā)性硬化癥的核心靶點(diǎn)。使用Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，每條邊表示目標(biāo)與化合物或疾病之間的關(guān)系，詳見(jiàn)圖2C。網(wǎng)絡(luò)由50個(gè)節(jié)點(diǎn)和165條邊組成。

2.3 富集分析 GO屬于基因功能分類系統(tǒng)，有3個(gè)分支，包括生物過(guò)程(biological process，BP)、細(xì)胞成分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)。通過(guò)對(duì)靶標(biāo)的富集分析，GO生物學(xué)功能表明GPC治療EAE小鼠的藥效機(jī)制涉及27項(xiàng)(P<0，count≥7)，包括10個(gè)生物學(xué)過(guò)程(肽酰絲氨酸磷酸化、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、基因表達(dá)的正調(diào)控、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)磷酸化、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)、凋亡過(guò)程、轉(zhuǎn)錄和DNA模板)、10個(gè)細(xì)胞化合物(胞外空間、胞漿、核質(zhì)、線粒體、細(xì)胞質(zhì)、胞外區(qū)、核、胞外體、質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi))和7個(gè)分子功能(酶結(jié)合，蛋白質(zhì)結(jié)合、激酶活性、絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、ATP結(jié)合、蛋白激酶活性和鋅離子結(jié)合)，詳見(jiàn)圖3。本研究篩選出32條信號(hào)通路(P<0.05，count≥7)，與腫瘤(如腫瘤壞死因子信號(hào)通路)、炎癥(如MAPK信號(hào)通路)、病毒感染(如乙肝)等有關(guān)，詳見(jiàn)圖4。

2.4 GPC減輕EAE小鼠臨床癥狀和中樞炎癥，保護(hù)髓鞘 免疫第11天，小鼠出現(xiàn)相關(guān)癥狀。與EAE對(duì)照組比較，GPC治療組小鼠臨床評(píng)分較低，詳見(jiàn)圖5。HE染色顯示，與EAE對(duì)照組比較，GPC治療組小鼠炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少(P<0.05)，詳見(jiàn)圖6A。LFB染色顯示，與EAE對(duì)照組比較，GPC治療組脫髓鞘減少(P<0.01)，詳見(jiàn)圖6B。免疫熒光染色顯示：GPC治療組MBP平均熒光強(qiáng)度高于EAE對(duì)照組(P<0.05)，詳見(jiàn)圖6C。Western Blotting顯示：GPC治療組MBP相對(duì)蛋白表達(dá)量高于EAE對(duì)照組(P<0.05)，詳見(jiàn)圖6D。

圖5 兩組小鼠每日臨床評(píng)分變化

與EAE對(duì)照組比較，＊P<0.05，＊＊P<0.01。

2.5 GPC對(duì)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)指標(biāo)的作用 GPC具有較好的抗氧化應(yīng)激和抗炎作用。與EAE對(duì)照組比較，GPC治療組MDA(P<0.01)、RNS(P<0.01)、ROS(P<0.001)表達(dá)降低；GPC治療組INF-γ(P<0.05)、IL-17(P<0.01)、IL-1β(P<0.01)、IL-6(P<0.001)和TNF-α(P<0.01)表達(dá)受到抑制。詳見(jiàn)圖7。

與EAE對(duì)照組比較，＊P<0.05，△P<0.01，#P<0.001。

2.6 GPC抑制炎癥信號(hào)通路 為驗(yàn)證GPC在EAE小鼠中的抗炎機(jī)制，根據(jù)KEGG富集分析結(jié)果，驗(yàn)證GPC對(duì)MAPK和PI3K/Akt信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。Western Blotting檢測(cè)Akt、JNK和ERK及磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)GPC能抑制Akt、JNK和ERK磷酸化。詳見(jiàn)圖8。

與EAE對(duì)照組比較，＊P<0.05。

3 討 論

目前，多發(fā)性硬化癥發(fā)病機(jī)制尚不明確，炎癥反應(yīng)是發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)關(guān)鍵過(guò)程[22]。多發(fā)性硬化癥的治療主要包括抗炎和免疫調(diào)節(jié)，相關(guān)西藥治療靶點(diǎn)單一，不良反應(yīng)多[23]。中藥多靶點(diǎn)特征可能優(yōu)于單靶點(diǎn)藥物[24]，但由于其多化合物和多目標(biāo)協(xié)同效應(yīng)，具有復(fù)雜性和挑戰(zhàn)性。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過(guò)收集生物活性化合物，預(yù)測(cè)藥物靶點(diǎn)，區(qū)分疾病相關(guān)基因的優(yōu)先級(jí)，進(jìn)一步建立“藥物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，以整體的思維方式和較強(qiáng)的預(yù)測(cè)能力為中醫(yī)藥現(xiàn)代化和新藥開發(fā)提供理論依據(jù)[25]。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析GPC治療多發(fā)性硬化癥的潛在機(jī)制。

首先，分析出7種GPC活性化合物作用于42個(gè)靶點(diǎn)治療多發(fā)性硬化癥，表明GPC治療多發(fā)性硬化癥是多個(gè)化合物和多個(gè)靶點(diǎn)協(xié)同作用的結(jié)果。從PPI網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)AKT1、MAPK1、MAPK3等具有較高度值的靶點(diǎn)，表明這些靶點(diǎn)可能是GPC治療多發(fā)性硬化癥的核心靶點(diǎn)。GO富集分析表明，GPC治療多發(fā)性硬化癥是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、調(diào)控轉(zhuǎn)錄、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白磷酸化和凋亡過(guò)程實(shí)現(xiàn)的。KEGG通路富集了32條與氧化應(yīng)激、炎癥、腫瘤、病毒感染等多種生物學(xué)過(guò)程相關(guān)的途徑。在KEGG通路的富集結(jié)果中，通過(guò)P值和count值篩選后，觀察到MAPK和PI3K/Akt信號(hào)通路是兩個(gè)重要的靶通路，這兩種途徑與細(xì)胞增殖、應(yīng)激、炎癥和凋亡有關(guān)[26-27]，與多發(fā)性硬化癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。相關(guān)研究顯示，這兩種途徑的異常激活與EAE模型中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和脫髓鞘程度密切相關(guān)[28-29]。GPC是一種良好的抗炎物質(zhì)和抗氧化劑，可抑制這兩種途徑，表明可能對(duì)多發(fā)性硬化癥具有潛在的治療作用。

基于上述發(fā)現(xiàn)，本研究探討GPC對(duì)EAE的治療作用及其對(duì)上述兩種信號(hào)通路的影響。結(jié)果顯示，GPC通過(guò)下調(diào)AKT、JNK和ERK的磷酸化，改善EAE小鼠臨床癥狀，減少中樞炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和脫髓鞘，抑制相關(guān)氧化應(yīng)激指標(biāo)和炎性因子表達(dá)，這些與MAPK和PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。MAPK信號(hào)通路包括p38MAPK、JNK和ERK。有研究顯示，所有MAPK激酶在EAE動(dòng)物模型的脊髓中被激活，p-ERK和p-JNK更明顯[30]。Akt是PI3K/Akt信號(hào)通路的重要下游分子[31]。在D-半乳糖誘導(dǎo)的阿爾茨海默病大鼠中，海馬突觸密度和p-Akt水平降低，外部干預(yù)后，上述動(dòng)物模型臨床癥狀改善，病變相應(yīng)的蛋白質(zhì)磷酸化水平下調(diào)[32-33]，與本研究結(jié)果一致。

血液和腦組織之間存在血腦屏障，由毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜和星形膠質(zhì)細(xì)胞突起的腳板組成[34]，可維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，保護(hù)神經(jīng)組織免受毒素和病原體侵害[35]。藥物能否通過(guò)血腦屏障是治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的關(guān)鍵。然而，關(guān)于GPC藥代動(dòng)力學(xué)的研究較少，對(duì)其穿透血腦屏障的能力有不同的評(píng)價(jià)。來(lái)自TCMSP和Swiss Targe Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，大多數(shù)PC難以穿透血腦屏障，相關(guān)研究顯示，PC能有效緩解中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的癥狀[8-9，36]。認(rèn)為與疾病引起的血腦屏障損害有關(guān)，已證實(shí)EAE小鼠和多發(fā)性硬化癥病人均存在血腦屏障破壞[37]。因此，本研究探討GPC對(duì)EAE的治療作用，結(jié)果證明GPC治療有效。由于EAE和多發(fā)性硬化癥的具體發(fā)病機(jī)制不同，而EAE是人為誘導(dǎo)外周免疫引起的中樞性炎癥損傷，GPC靶點(diǎn)是在中心還是周圍有待進(jìn)一步研究。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法對(duì)GPC的活性成分、靶點(diǎn)和通路進(jìn)行分析和驗(yàn)證。結(jié)果表明，GPC治療多發(fā)性硬化癥通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)和多通路的協(xié)同作用發(fā)揮療效。結(jié)果證實(shí)，GPC的治療作用是通過(guò)MAPK信號(hào)通路和PI3K/Akt信號(hào)通路抑制炎性因子的表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用。