咪達(dá)唑侖對(duì)2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響

李前輝，郭浩翔，謝小娟，張宜林

糖尿病心肌病是糖尿病的一種主要心血管并發(fā)癥，引起心力衰竭，并最終導(dǎo)致糖尿病病人死亡率增加[1]。糖尿病病人心臟對(duì)再灌注損傷敏感性和預(yù)后較非糖尿病病人更差[2]。有研究顯示，糖尿病可消除各種藥物或缺血預(yù)處理對(duì)缺血心肌的保護(hù)作用[3]。因此，了解糖尿病心肌缺血再灌注損傷發(fā)病機(jī)制及發(fā)現(xiàn)新型預(yù)防藥物極其重要。在心臟病學(xué)中，咪達(dá)唑侖可作為心臟外科手術(shù)和心肌灌注診斷和治療程序之前的麻醉前藥物，已有研究顯示，咪達(dá)唑侖對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用[4]，但咪達(dá)唑侖對(duì)2型糖尿病心肌缺血再灌注的作用尚不明確。有研究顯示，炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激增加是誘導(dǎo)糖尿病心臟再灌注損傷的主要因素[5]。本研究觀察咪達(dá)唑侖對(duì)2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的影響，以期為2型糖尿病心肌缺血再灌注損傷的預(yù)防提供基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 咪達(dá)唑侖注射液(宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)：180305)，蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(上海研瑾生物，貨號(hào)：J-SG1120-10)，肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB，CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)、心肌肌鈣蛋白I(cardiactroponin I，cTnI)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)試劑盒(上海聯(lián)碩生物科技有限公司，貨號(hào)：ml002220、ml042664、ml042326、ml042384、ml010129、ml042383、ml059476、ml037361、ml002859)，Annexin-V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京碧波生物科技有限公司生產(chǎn)，BA11100)，2，2聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉(BCA)試劑盒(上海易色醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)，貨號(hào)：BC201)，放射免疫沉淀(RIPA)裂解緩沖液(南京?？藸柹锟萍加邢薰旧a(chǎn)，貨號(hào)：SBJ-0999)，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔單克隆二抗、核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸醌氧化還原酶-1(NQO-1)、血紅素氧合酶-1(HO-1)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(GAPDH)兔來(lái)源的單克隆一抗(英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)ab6721、ab92946、ab28947、ab13243、ab9485)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取48只雄性Wistar大鼠，體重160～180 g，年齡8～9周，購(gòu)自四川夏派森醫(yī)藥科技有限公司，許可證號(hào)：SYXK(川)2017-203。將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和糖尿病組，各24只。所有大鼠在濕度為(50±10)%、溫度為(22±3)℃、14 h/10 h明暗的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由獲取食物和飲水至少1周，再用于實(shí)驗(yàn)。本研究中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物已得到批準(zhǔn)，所有程序均符合該機(jī)構(gòu)的道德標(biāo)準(zhǔn)，并按照醫(yī)院動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的指導(dǎo)進(jìn)行。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 microopticon 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；FDP-1 HRV & BRS分析系統(tǒng)購(gòu)自中國(guó)上海嘉龍教儀廠；美國(guó)碧迪流式細(xì)胞儀FACS Calibur(美國(guó)碧迪醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 通過(guò)高脂飲食和鏈脲佐菌素(strepozotocin，STZ)方法誘導(dǎo)大鼠2型糖尿病 適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，給予觀察組24只雄性Wistar大鼠高脂飲食(標(biāo)準(zhǔn)普通食物67.5%，蔗糖20%，豬油10%和蛋黃粉2.5%)和10%糖水喂養(yǎng)5周。通過(guò)每日2次腹膜內(nèi)注射30 mg/kg劑量的STZ(溶于0.1 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液，pH 4.2)治療大鼠。3 d后，從尾靜脈提取血液樣品測(cè)量血糖水平。血糖>16.7 mmol/L證實(shí)該鼠患糖尿病。對(duì)照組大鼠喂食常規(guī)飲食，并單獨(dú)注射檸檬酸鹽緩沖液。

1.2.2 分組及給藥 將24只糖尿病大鼠隨機(jī)分為糖尿病假手術(shù)組(DS組)、糖尿病心肌缺血再灌注組(DI/R組)、糖尿病心肌缺血再灌注給藥組(DI/RM組)；將對(duì)照大鼠，將24只健康Wistar雄性大鼠再隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)、心肌缺血再灌注組(I/R組)、心肌缺血再灌注給藥組(I/RM組)。缺血給藥前20 min，I/RM組和DI/RM組大鼠靜脈注射咪達(dá)唑侖0.75 mg/kg，并以1 mg/(kg·h)微注射泵維持至再灌注結(jié)束[6]。

1.2.3 心肌缺血再灌注大鼠模型 參考文獻(xiàn)[7]，除sham組和DS組外，其余大鼠腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉60 mg/kg麻醉，之后將大鼠固定于右側(cè)臥位，采用1%聚乙烯碘對(duì)胸部和腹部進(jìn)行消毒，并使用無(wú)菌洞巾覆蓋大鼠。通過(guò)微注射泵注射咪達(dá)唑侖，于左側(cè)第4肋間切開(kāi)后進(jìn)行心包切開(kāi)術(shù)，將5-0眼科縫合線置于左冠狀動(dòng)脈的前降支周圍，完全結(jié)扎冠狀動(dòng)脈以獲得局部缺血。若手術(shù)成功，則在閉塞遠(yuǎn)端的心肌出現(xiàn)淺色。缺血30 min后，通過(guò)釋放結(jié)扎線恢復(fù)血流，通過(guò)目測(cè)檢查鮮紅色血液返回確認(rèn)缺血區(qū)域的再灌注。sham組和DS組大鼠進(jìn)行相同的外科手術(shù)，但不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈的前降支。

1.2.4 FDP-1 HRV和BRS分析系統(tǒng)測(cè)定心功能 I/R手術(shù)后，麻醉大鼠，并通過(guò)右頸總動(dòng)脈向左心室插管。通過(guò)MFLab 3.01軟件包在FDP-1 HRV和BRS分析系統(tǒng)測(cè)定左室舒張末期壓(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)、左室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、心率(heart rate，HR)和冠狀動(dòng)脈流量(coronary flow，CF)，監(jiān)測(cè)心臟功能。

1.2.5 ELISA檢測(cè)血清CK-MB、LDH、cTnI、TNF-α、IL-6、IL-1β和心肌組織MDA、GSH、SOD的表達(dá)水平 收集血樣，6 h后離心；選取心臟同一部位組織，按質(zhì)量體積比為1∶9加入生理鹽水勻漿，離心后取上清液加入各反應(yīng)孔，37 ℃反應(yīng)45 min。使用洗滌液洗滌4次，再加入生物素標(biāo)記抗體，37 ℃孵育30 min；洗滌后加入HRP標(biāo)記的鏈霉親和素混合均勻，37 ℃反應(yīng)30 min，加入顯色劑避光顯色，最后加終止液終止反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果。

1.2.6 HE染色觀察心肌損傷 將心臟組織采用冰生理鹽水沖洗，4%多聚甲醛溶液固定48 h，石蠟包埋，切片。按照HE染色試劑盒染色，并在400倍顯微鏡下觀察心肌損傷情況。

1.2.7 流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶處理后收集于試管中，之后將其離心，采用磷酸鹽緩沖鹽溶液洗滌1次。根據(jù)Annexin-V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)，通過(guò)FACS分析對(duì)FITC和PI熒光進(jìn)行定量。細(xì)胞凋亡率(%)=早期細(xì)胞凋亡率+晚期細(xì)胞凋亡率。

1.2.8 蛋白印跡法檢測(cè)Nrf2、NQO-1、HO-1蛋白的表達(dá) 使用RIPA細(xì)胞裂解液從心臟組織中提取蛋白，并采用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜后封閉1 h，加入兔來(lái)源的單克隆一抗(Nrf2為1∶1 000，NQO-1為1∶500，HO-1為1∶1 000，β-actin為1∶1 000)中，4 ℃ 孵育12 h；轉(zhuǎn)移至山羊抗兔單克隆二抗液(1∶2 000)中，室溫下孵育1 h，加顯影液，于成像系統(tǒng)中曝光，使用軟件Image Pro Plus 6.0分析蛋白條帶灰度，蛋白表達(dá)水平以目標(biāo)蛋白積分吸光度與內(nèi)參蛋白β-actin積分吸光度值比值表示。

2 結(jié) 果

2.1 咪達(dá)唑侖對(duì)2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心臟功能的影響 與sham組比較，I/R組和DS組大鼠心臟LVSP、HR、CF降低(P<0.05或P<0.01)，LVEDP及血清LDH和CK-MB活性、cTnI含量升高(P<0.05或P<0.01)；與DS組和I/R組比較，DI/R組心臟LVSP、HR、CF降低(P<0.01)，LVEDP及血清LDH和CK-MB活性、cTnI含量升高(P<0.01)；與I/R組比較，I/RM組大鼠心臟LVSP、HR、CF升高(P<0.01)，LVEDP及血清LDH和CK-MB活性、cTnI含量降低(P<0.01)；與DI/R組比較，DI/RM組、I/RM組心臟LVSP、HR、CF升高(P<0.01)，LVEDP 及血清LDH和CK-MB活性、cTnI含量降低(P<0.01)。詳見(jiàn)圖1。

與sham組比較，＊P<0.05，＊＊P<0.01；與I/R組比較，#P<0.01；與DS組比較，△P<0.01；與DI/R組比較，&P<0.01。

2.2 咪達(dá)唑侖對(duì)2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷的影響 sham組心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞輪廓清晰；I/R組和DS組大鼠心肌組織存在心肌纖維斷裂，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞變性壞死；DI/R組大鼠心肌組織出現(xiàn)大量心肌纖維斷裂，細(xì)胞排列嚴(yán)重紊亂，細(xì)胞變性壞死嚴(yán)重；I/RM組和DI/RM組大鼠心肌細(xì)胞逐漸恢復(fù)整齊排列，細(xì)胞變性壞死減少。與sham組比較，I/R組和DS組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率增加(P<0.05或P<0.01)；與DS組和I/R組比較，DI/R組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率增加(P<0.01)；與I/R組比較，I/RM組心肌細(xì)胞凋亡率降低(P<0.01)；與DI/R組比較，DI/RM組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率降低(P<0.01)。詳見(jiàn)圖2。

與sham組比較，＊P<0.05，＊＊P<0.01；與I/R組比較，#P<0.01；與DS組比較，△P<0.01；與DI/R組比較，&P<0.01。

2.3 咪達(dá)唑侖對(duì)2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響 與sham組比較，I/R組和DS組大鼠心肌組織GSH含量和SOD活性降低(P<0.05或P<0.01)，MDA含量升高(P<0.05或P<0.01)；與DS組和I/R組比較，DI/R組大鼠心肌組織GSH含量和SOD活性降低(P<0.01)，MDA含量升高(P<0.01)；與I/R組比較，I/RM組心肌組織GSH含量和SOD活性升高(P<0.01)，MDA含量降低(P<0.01)；與DI/R組比較，DI/RM組大鼠心肌組織GSH含量和SOD活性升高(P<0.01)，MDA含量降低(P<0.01)。詳見(jiàn)圖3。

與sham組比較，＊P<0.05，＊＊P<0.01；與I/R組比較，#P<0.01；與DS組比較，△P<0.01；與DI/R組比較，&P<0.01。

2.4 咪達(dá)唑侖對(duì)2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠炎癥反應(yīng)的影響 與sham組比較，I/R組和DS組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量增加(P<0.05或P<0.01)；與DS組和I/R組比較，DI/R組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量增加(P<0.01)；與I/R組比較，I/RM組血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量減少(P<0.01)；與DI/R組比較，DI/RM組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β含量減少(P<0.01)。詳見(jiàn)圖4。

與sham組比較，＊P<0.05，＊＊P<0.01；與I/R組比較，#P<0.01；與DS組比較，△P<0.01；與DI/R組比較，&P<0.01。

2.5 咪達(dá)唑侖對(duì)2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心肌組織中Nrf2通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與sham組比較，I/R組和DS組大鼠心肌組織Nrf2、NQO-1和HO-1表達(dá)下調(diào)(P<0.05或P<0.01)；與DS組和I/R組比較，DI/R組大鼠Nrf2、NQO-1和HO-1表達(dá)下調(diào)(P<0.01)；與I/R組比較，I/RM組Nrf2、NQO-1和HO-1表達(dá)上調(diào)(P<0.01)；與DI/R組比較，DI/RM組大鼠Nrf2、NQO-1和HO-1表達(dá)上調(diào)(P<0.01)。詳見(jiàn)圖5。

與sham組比較，＊P<0.05，＊＊P<0.01；與I/R組比較，#P<0.01；與DS組比較，△P<0.01；與DI/R組比較，&P<0.01。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，咪達(dá)唑侖可改善2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心臟功能，可能與抑制心肌細(xì)胞凋亡，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)Nrf2通路，并減輕心肌損傷有關(guān)。尹寧等[4]研究顯示，咪達(dá)唑侖對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡較非糖尿病心肌缺血再灌注大鼠嚴(yán)重，氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)劇烈，與Xu等[8]研究結(jié)果一致。心肌缺血再灌注損傷過(guò)程中出現(xiàn)大量氧自由基、細(xì)胞內(nèi)鈣水平升高、大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、線粒體受損等病理變化促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[9]。有效抑制心肌細(xì)胞凋亡可顯著改善糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷。葛根素通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡減少糖尿病大鼠缺血/再灌注引起的心肌損傷[10]。本研究結(jié)果顯示，咪達(dá)唑侖可抑制2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡。氧化應(yīng)激引起細(xì)胞生物分子和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能改變[11]，缺血再灌注損傷引起氧化應(yīng)激反應(yīng)[12-13]，有效抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)水平可明顯改善糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷。益氣養(yǎng)陰方可保護(hù)糖尿病心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌組織，減輕組織氧化應(yīng)激水平，可能是通過(guò)激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)/Nrf2/HO-1通路實(shí)現(xiàn)的[14]。本研究結(jié)果顯示，咪達(dá)唑侖可抑制2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。心肌缺血再灌注損傷引起心肌細(xì)胞內(nèi)源性的炎癥反應(yīng)，并誘導(dǎo)釋放大量炎性因子，從而進(jìn)一步引起心肌受損[15]。芒果苷通過(guò)抑制心肌的氧化應(yīng)激、炎癥減輕糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷[16]。本研究結(jié)果表明，咪達(dá)唑侖可抑制2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)。冬凌草甲素能改善糖尿病心肌缺血再灌注損傷模型大鼠心臟功能、減少心肌損傷和細(xì)胞凋亡、降低氧化應(yīng)激和炎性因子表達(dá)[17]，咪達(dá)唑侖可改善2型糖尿病心肌缺血再灌注損傷。

Nrf2可減輕缺血-再灌注損傷，具有心臟保護(hù)作用。這種內(nèi)源性保護(hù)作用可能通過(guò)促進(jìn)HO-1等抗氧化因子表達(dá)，抑制氧自由基產(chǎn)生，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的[18]。Nrf2通路可預(yù)防糖尿病發(fā)生，并在維持葡萄糖代謝、調(diào)節(jié)胰島素分泌和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等方面發(fā)揮重要作用。有研究顯示，糖尿病病人和動(dòng)物模型中Nrf2通路是被抑制的[19]。Peake等[20]認(rèn)為Nrf2在糖尿病病人心臟中表達(dá)增加。造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異的原因可能為不同實(shí)驗(yàn)研究之間的糖尿病持續(xù)時(shí)間、動(dòng)物種類和實(shí)驗(yàn)方案不同。本研究結(jié)果顯示，2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心肌組織Nrf2通路相關(guān)蛋白表達(dá)降低，咪達(dá)唑侖可上調(diào)2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心肌組織Nrf2通路相關(guān)蛋白表達(dá)。與Xu等[8]研究結(jié)果白藜蘆醇增加2型糖尿病大鼠心肌Nrf2表達(dá)，減輕心肌缺血再灌注損傷一致。

綜上所述，咪達(dá)唑侖可減輕2型糖尿病心肌缺血再灌注大鼠心肌損傷，抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，可能與調(diào)節(jié)Nrf2通路有關(guān)。由于本研究是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，為探討具體的分子調(diào)控機(jī)制，有必要進(jìn)行進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)。