外周血miR-34a、SIRT1水平與腦梗死后認(rèn)知功能障礙的關(guān)系

朱艷玲，孫 強(qiáng)，郝文莉，劉曉琳

腦梗死是臨床常見的心腦血管疾病，好發(fā)于高齡人群，是由于腦部血液供應(yīng)障礙、缺氧缺血引起局限性腦組織腦軟化或缺血性壞死疾病，導(dǎo)致病人頭痛、耳鳴、眩暈、半身不遂等癥狀[1-2]。有研究顯示，15%～50%的腦梗死病人并發(fā)認(rèn)知功能障礙，隨著老齡化社會的到來，腦梗死后認(rèn)知功能障礙病人不斷增加，嚴(yán)重影響病人及家庭的正常生活[3]。微小RNA(microRNA)是不具備編碼功能的小分子RNA，通過調(diào)控靶基因表達(dá)參與調(diào)控細(xì)胞功能[4]。有研究表明，沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)是miR-34a作用的靶基因之一，二者在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[5]。相關(guān)研究顯示，miR-34a參與慢性腦功能障礙疾病的發(fā)生發(fā)展，SIRT可發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，抑制大鼠腦缺血再灌注損傷[6-7]。關(guān)于二者在腦梗死后認(rèn)知功能障礙中作用的研究較少。本研究檢測腦梗死病人外周血miR-34a、SIRT1水平，探討二者與認(rèn)知功能障礙的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年9月—2019年11月我院收治的腦梗死后認(rèn)知功能障礙病人145例作為研究對象(觀察組)，同期腦梗死未發(fā)生認(rèn)知功能障礙病人145例作為對照組。收集病人一般資料，包括性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2014》[8]診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)實(shí)驗(yàn)室、影像學(xué)或磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)等檢查證實(shí)；病人及家屬知情并簽署知情同意書；本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審批，符合相關(guān)倫理學(xué)規(guī)定。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 合并心、肝、腎等重要臟器功能障礙、顱內(nèi)感染、癲癇等其他影響實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的疾病；既往有精神障礙史、認(rèn)知功能障礙史、抑郁史；理解能力差或有視覺障礙、嚴(yán)重失語、聽力障礙等不能配合完成各項(xiàng)評分測評；妊娠期、哺乳期女性；臨床資料不完善。

1.2 試劑與儀器 TRIzol試劑(貨號：QN2070-ZOG)購自北京百奧萊博科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：BPI01030)購自北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司；實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)試劑盒(貨號：DEM202-50T)購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；熒光定量PCR儀(型號：ABI 7500)購自美國Applied Biosystems公司；引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 血清miR-34a、SIRT1水平檢測 于病人入院后次日清晨抽取空腹外周靜脈血5 mL，分離血清。使用TRIzol試劑提取血清總RNA，紫外分光光度計測量RNA質(zhì)量，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，檢驗(yàn)合成cDNA質(zhì)量。采用qRT-PCR法檢測血清miR-34a、SIRT1水平，以U6、GAPDH作為內(nèi)參基因。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循環(huán)40次。miR-34a正向引物：5′-TGGCAGTGTCTTAGCT-3′，反向引物：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；SIRT1正向引物：5′-CCCAGAACATAGACACGCTGGA-3′，反向引物：5′-ATCAGCTGGGCACCTAGGACA-3′；內(nèi)參U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；內(nèi)參GAPDH正向引物：5′-GATTCCACCCATGGCAAATTC-3′，反向引物：5′-AGCATCGCCCCACTTGATT-3′。采用2-ΔΔCt法計算血清miR-34a、SIRT1相對表達(dá)量。

1.4 認(rèn)知功能評定標(biāo)準(zhǔn) 采用簡易智能精神狀態(tài)檢查量表(Simple Mental State Examination Scale，MMSE)評分、蒙特利爾認(rèn)知評估量表(Montreal Cognitive Assessment Scale，MoCA)評定病人認(rèn)知功能。MMSE評分總分為30分，27～30分為認(rèn)知功能正常，21～26分為輕度認(rèn)知功能障礙，10～20分為中度認(rèn)知功能障礙，0～9分為重度認(rèn)知功能障礙。MoCA評分總分為30分，27～30分為認(rèn)知功能正常，≤26分為認(rèn)知功能障礙。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料比較 兩組性別、年齡、BMI比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。詳見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組血清miR-34a、SIRT1表達(dá)水平比較 與對照組比較，觀察組血清miR-34a水平升高(P<0.01)，血清SIRT1水平降低(P<0.01)。詳見表2。

表2 兩組血清miR-34a、SIRT1水平比較(±s)

2.3 兩組MMSE評分、MoCA評分比較 與對照組比較，觀察組MMSE評分、MoCA評分降低(P<0.01)。詳見表3。

表3 兩組MMSE評分、MoCA評分比較(±s) 單位：分

2.4 影響腦梗死病人發(fā)生認(rèn)知功能障礙的多因素分析 將腦梗死病人是否發(fā)生認(rèn)知功能障礙作為因變量，以血清miR-34a、SIRT1水平為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，血清miR-34a水平是影響腦梗死病人發(fā)生認(rèn)知功能障礙的獨(dú)立危險因素(P<0.05)，血清SIRT1水平是影響腦梗死病人發(fā)生認(rèn)知功能障礙的保護(hù)因素(P<0.05)。詳見表4。

表4 影響腦梗死病人發(fā)生認(rèn)知功能障礙的多因素分析

2.5 腦梗死后認(rèn)知功能障礙病人血清miR-34a、SIRT1水平與MMSE評分、MoCA評分的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，腦梗死后認(rèn)知功能障礙病人血清miR-34a水平與MMSE評分、MoCA評分呈負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.427、-0.441，P<0.05)；血清SIRT1水平與MMSE評分、MoCA評分呈正相關(guān)(r值分別為0.467、0.458，P<0.05)。詳見圖1～圖4。

圖1 腦梗死后認(rèn)知功能障礙病人血清miR-34a水平與MMSE評分的相關(guān)性分析散點(diǎn)圖

圖2 腦梗死后認(rèn)知功能障礙病人血清miR-34a水平與MoCA評分的相關(guān)性分析散點(diǎn)圖

圖3 腦梗死后認(rèn)知功能障礙病人血清SIRT1水平與MMSE評分的相關(guān)性分析散點(diǎn)圖

圖4 腦梗死后認(rèn)知功能障礙病人血清SIRT1水平與MoCA評分的相關(guān)性分析散點(diǎn)圖

2.6 腦梗死后認(rèn)知功能障礙病人血清miR-34a水平與SIRT1水平的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，腦梗死后認(rèn)知功能障礙病人血清miR-34a水平與SIRT1水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.500，P<0.05)。詳見圖5。

圖5 腦梗死后認(rèn)知功能障礙病人血清miR-34a水平與SIRT1水平的相關(guān)性分析散點(diǎn)圖

3 討 論

腦梗死是一種致殘率、死亡率較高的腦血管疾病，近年來隨著生活節(jié)奏加快及個人不良生活習(xí)慣導(dǎo)致病人發(fā)病率呈上升趨勢[1]。腦梗死發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且具有突發(fā)性，易出現(xiàn)局部腦組織血液循環(huán)障礙，發(fā)生缺血缺氧性損傷及炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，造成腦部認(rèn)知功能區(qū)域組織損傷，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙發(fā)生[9]。MMSE評分、MoCA評分是臨床評定認(rèn)知功能障礙的常用方法，兩者主要用于評估已發(fā)生認(rèn)知功能障礙、病情較穩(wěn)定的病人，腦梗死認(rèn)知功能障礙早期篩查具有一定的局限性[10]。目前，腦梗死認(rèn)知功能障礙早期篩查的特異性血液生化指標(biāo)未統(tǒng)一，尋找與腦梗死認(rèn)知功能障礙發(fā)生有關(guān)的指標(biāo)，對臨床篩查疾病、預(yù)后評估具有重要意義。

miRNAs通過與靶基因非轉(zhuǎn)錄區(qū)域結(jié)合而降解或抑制mRNA表達(dá)，抑制靶基因表達(dá)，進(jìn)而參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。姚寶珍等[6]研究表明，顳葉癲癇大鼠模型海馬中miR-34a表達(dá)水平上調(diào)，可能通過激活Notch1信號通路，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡及神經(jīng)膠質(zhì)增多，進(jìn)而參與癲癇的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，腦梗死后認(rèn)知功能障礙病人血清miR-34a水平較未發(fā)生認(rèn)知功能障礙腦梗死病人顯著升高，提示miR-34a可能與腦梗死病人發(fā)生認(rèn)知功能障礙過程有關(guān)。

SIRT1是依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的第Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶，在神經(jīng)領(lǐng)域有廣泛研究，在神經(jīng)損傷模型及記憶方面具有保護(hù)神經(jīng)的作用[11]。鄧青山等[12]研究顯示，高壓氧治療通過增加SIRT1蛋白表達(dá)減輕β-淀粉樣蛋白對阿爾茨海默病小鼠的神經(jīng)毒性損傷，改善學(xué)習(xí)記憶功能，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。趙忠惠等[13]研究表明，白藜蘆醇通過促進(jìn)SIRT1表達(dá)抑制炎癥反應(yīng)，發(fā)揮對蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，腦梗死后認(rèn)知功能障礙病人血清SIRT1水平較未發(fā)生認(rèn)知功能障礙腦梗死病人顯著降低，提示腦梗死病人發(fā)生認(rèn)知功能障礙可能與SIRT1表達(dá)不足有關(guān)。

本研究多因素回歸分析結(jié)果顯示，血清miR-34a水平是影響腦梗死病人發(fā)生認(rèn)知功能障礙的獨(dú)立危險因素，血清SIRT1水平是保護(hù)因素，提示血清miR-34a水平升高、SIRT1水平降低可能增加腦梗死病人發(fā)生認(rèn)知功能障礙的概率。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，腦梗死后認(rèn)知功能障礙病人血清miR-34a水平與MMSE評分、MoCA評分均呈負(fù)相關(guān)，血清SIRT1水平與MMSE評分、MoCA評分均呈正相關(guān)，提示血清miR-34a、SIRT1水平與腦梗死后認(rèn)知功能障礙病人認(rèn)知障礙程度密切相關(guān)。劉曉虹等[14]研究顯示，miR-34a通過靶向調(diào)節(jié)SIRT1表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對高糖條件下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衰老的調(diào)控。馬璐等[15]研究表明，miR-34a水平升高后下調(diào)其靶蛋白SIRT1的表達(dá)，可能與內(nèi)皮祖細(xì)胞功能障礙發(fā)生相關(guān)。本研究進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，腦梗死后認(rèn)知功能障礙病人血清miR-34a水平與SIRT1水平呈負(fù)相關(guān)，提示miR-34a和SIRT1與腦梗死后認(rèn)知功能障礙病人發(fā)生過程關(guān)系密切，可能為靶向調(diào)節(jié)關(guān)系，仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

綜上所述，腦梗死后認(rèn)知功能障礙病人外周血miR-34a、SIRT1水平均異常表達(dá)，可能共同調(diào)控腦梗死病人認(rèn)知功能障礙發(fā)生，但二者的具體作用機(jī)制及相互關(guān)系需進(jìn)一步研究。