基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)-分子對(duì)接探討保元湯調(diào)控線粒體功能治療冠心病的作用機(jī)制

劉啟予，樊懿萱，王彤歆，王安璐，徐 浩

冠心病是全球疾病負(fù)擔(dān)的重要組成部分，也是中老年人死亡的主要原因[1]，其發(fā)病機(jī)制主要為動(dòng)脈粥樣硬化形成導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈管腔變窄甚至阻塞，引起心肌缺血、缺氧甚至梗死。由于線粒體在細(xì)胞氧化還原平衡及能量穩(wěn)態(tài)中的核心作用，目前研究認(rèn)為線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常與冠心病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。觀察冠心病病人心肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，線粒體DNA(mtDNA)完整性破壞，其編碼的呼吸復(fù)合物活性降低，電子傳遞鏈(ETC)紊亂，氧化磷酸化(OXPHOS)代謝異常，造成三磷酸腺苷(ATP)生成減少，活性氧生成增加[2]。一方面引起心臟供能不足，另一方面導(dǎo)致氧化應(yīng)激、促進(jìn)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡、血管內(nèi)皮損傷等，影響動(dòng)脈粥樣硬化形成[3-4]。保元湯始載于明代魏直《博愛心鑒》，后經(jīng)張景岳等醫(yī)家發(fā)揮，其組方包括人參、黃芪、甘草、肉桂四味藥物，是治療冠心病等心血管疾病的常用方劑之一?！氨Ｔ撸Ｊ卮嗽?dú)庵^也”，元?dú)庹?，人生立命之基也。張錫純指出“是大氣者，原以元?dú)鉃楦尽?，元?dú)庾悖髿?即宗氣)得以充養(yǎng)，貫注于心脈之中，發(fā)揮行血?dú)庵σ灾委煿谛牟　，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，保元湯通過抗細(xì)胞凋亡、抗氧化應(yīng)激、改善血管內(nèi)皮舒張功能、增加冠狀動(dòng)脈血流量等發(fā)揮心肌保護(hù)作用[5-6]。富集保元湯對(duì)應(yīng)的小鼠心肌保護(hù)靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，多數(shù)靶蛋白均定位于線粒體，由此推測(cè)保元湯發(fā)揮心肌保護(hù)的核心機(jī)制可能是調(diào)節(jié)線粒體功能[7]。針對(duì)保元湯多靶點(diǎn)、多途徑綜合調(diào)節(jié)的作用特點(diǎn)，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及分子對(duì)接技術(shù)，預(yù)測(cè)保元湯治療冠心病的有效成分、潛在靶點(diǎn)及信號(hào)通路，探討保元湯如何通過調(diào)控線粒體功能改善冠心病。

1 資料與方法

1.1 中藥的活性成分及相應(yīng)靶點(diǎn)篩選 運(yùn)用北京蛋白質(zhì)組研究中心開發(fā)的在線生物信息學(xué)分析工具BATMAN-TCM平臺(tái)(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm)分別檢索“人參”“黃芪”“甘草”“肉桂”的有效成分及對(duì)應(yīng)的潛在靶點(diǎn)，設(shè)置檢索參數(shù)為Score cutoff≥48、P<0.05進(jìn)行篩選。

1.2 疾病靶標(biāo)獲取 在人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards，https://www.genecards.org/)、人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM，https://omim.org/)中以 “coronary heart disease”為檢索詞進(jìn)行檢索，將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫所得結(jié)果合并去重，最終得到冠心病的相關(guān)靶標(biāo)。

1.3 “有效成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將疾病靶標(biāo)與藥物靶點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)，篩選兩者交集基因，獲得保元湯治療冠心病的作用靶點(diǎn)。運(yùn)用Excel表格將作用靶點(diǎn)與藥物成分進(jìn)行映射，并將其對(duì)應(yīng)關(guān)系整合至Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“中藥成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，?jì)算自由度(degree)預(yù)測(cè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及聚類分析 運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)分析作用靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)，設(shè)定物種為“Homo sapiens”，互作評(píng)分為“medium confidence(0.400)”，去除無相互作用的靶蛋白，其余參數(shù)保持默認(rèn)值。導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行聚類分析，運(yùn)用MCODE插件識(shí)別功能模塊，設(shè)定參數(shù)degree≥2，K-Core≥2進(jìn)行篩選。該插件可測(cè)定大型蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)系密集區(qū)域，從而預(yù)測(cè)可能表達(dá)的分子復(fù)合物，使后續(xù)功能注釋具有針對(duì)性和準(zhǔn)確性[8]。

1.5 基因本體(GO)分析和基于京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析 利用R 3.6.2軟件對(duì)上述聚類結(jié)果分別進(jìn)行富集分析，運(yùn)用Cluster Profiler軟件包進(jìn)行GO功能注釋和KEGG富集分析，設(shè)定參數(shù)為P≤0.05，Q≤0.05，并進(jìn)行可視化。

1.6 分子對(duì)接 選擇degree≥30的化合物及靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，在中醫(yī)系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(tái)(TCMSP)、Drugbank平臺(tái)中搜索化合物結(jié)構(gòu)，保存為mol2文件。陽性對(duì)照藥物選擇曲美他嗪(trimetazidine，TMZ)，在Drugbank平臺(tái)中得到曲美他嗪的mol2文件。該藥可提高冠心病病人心肌細(xì)胞對(duì)糖的利用能力，使細(xì)胞合成ATP增多，能量供應(yīng)增強(qiáng)[9]。將關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入PDB網(wǎng)站(http://www.rcsb.org/)，通過放射度(R值)篩選得到對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白，保存蛋白結(jié)構(gòu)為pdb文件。將mol2及pdb文件導(dǎo)入CB-Dock在線對(duì)接平臺(tái)(http://cao.labshare.cn/cb-dock/)進(jìn)行分析并可視化，其對(duì)接結(jié)果主要參考Vina分?jǐn)?shù)(Vina score)與空腔大小。

2 結(jié) 果

2.1 保元湯治療冠心病的活性成分及作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 運(yùn)用BATMAN-TCM平臺(tái)進(jìn)行檢索，共篩選出保元湯活性成分195個(gè)及相應(yīng)潛在靶點(diǎn)717個(gè)。在GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫中共提取冠心病相關(guān)靶標(biāo)4 010個(gè)。將藥物潛在靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶標(biāo)取交集，共預(yù)測(cè)341個(gè)保元湯治療冠心病的作用靶點(diǎn)，對(duì)應(yīng)有效藥物成分190個(gè)，其中作用于靶點(diǎn)數(shù)量超過30個(gè)的有效成分共11個(gè)。詳見表1。

表1 保元湯治療冠心病的主要有效成分

2.2 藥物成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件對(duì)保元湯作用于冠心病的有效成分與靶點(diǎn)間的互作關(guān)系進(jìn)行可視化及拓?fù)浞治觥Ｓ行С煞?作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中，共包括531個(gè)節(jié)點(diǎn)(190個(gè)成分節(jié)點(diǎn)，341個(gè)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn))、1 524條邊。詳見圖1。對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，圖中節(jié)點(diǎn)大小反映度值大小，節(jié)點(diǎn)度值越大表示其在治療中可能越關(guān)鍵。故篩選出核心基因(degree值≥16)共23個(gè)。詳見表2。

圖1 有效成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表2 核心基因序列

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及聚類分析 將獲得的341個(gè)作用靶點(diǎn)全部導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中，得到靶蛋白之間PPI。為識(shí)別該復(fù)雜蛋白互作圖中的主要功能模塊，將PPI導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中進(jìn)一步聚類分析，運(yùn)用MCODE算法共識(shí)別子簇14個(gè)并進(jìn)行可視化，其中K-Core≥4的子簇共6個(gè)，其互作網(wǎng)絡(luò)及相關(guān)靶點(diǎn)詳見表3、圖2。

圖2 關(guān)鍵子簇的靶點(diǎn)互作圖

表3 PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵子簇

2.4 GO生物過程及KEGG通路富集分析 運(yùn)用R 3.6.2軟件對(duì)上述6個(gè)子簇進(jìn)行GO及KEGG富集分析。結(jié)果顯示：子簇1主要參與的生物過程(biological process，BP)為G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、偶聯(lián)環(huán)核苷酸第二信使、腺苷酸環(huán)化酶調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、腺苷酸環(huán)化酶抑制G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路等，涉及的信號(hào)通路為神經(jīng)活性配體與受體間的相互作用、cGMP-PKG信號(hào)通路、cAMP信號(hào)通路；子簇2主要參與的BP為血管收縮、血管直徑負(fù)性調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)血管直徑，涉及的信號(hào)通路為神經(jīng)活性配體與受體間的相互作用、鈣信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等；子簇3主要參與的BP為活性氧代謝過程、腺苷酸環(huán)化酶激活G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、對(duì)脂多糖的反應(yīng)，涉及的信號(hào)通路為流體切應(yīng)力和動(dòng)脈粥樣硬化、前列腺癌、人類T細(xì)胞白血病病毒1感染等；子簇4主要參與的BP為心肌收縮力、離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控、心臟傳導(dǎo)，涉及的信號(hào)通路為長(zhǎng)壽調(diào)節(jié)通路、肥厚型心肌病、胰高血糖素信號(hào)通路等；子簇5主要參與的BP為心臟傳導(dǎo)、膜電位調(diào)節(jié)、參與收縮的心肌細(xì)胞動(dòng)作電位等，涉及的信號(hào)通路為嘌呤代謝、腎素分泌、酪氨酸代謝等；子簇6主要參與的BP為核苷磷酸分解代謝過程、嘌呤核苷酸分解過程、含嘌呤的化合物分解代謝過程等，涉及的信號(hào)通路為嘌呤代謝、煙酸和煙酰胺代謝、嘧啶代謝等。詳見表4。

表4 關(guān)鍵子簇GO及KEGG富集結(jié)果

2.5 分子對(duì)接驗(yàn)證 最終選擇5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)NR3C1、ATP1A1、AR、ESR1、PGR與上述保元湯主要有效成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。所有化合物與靶點(diǎn)均具有一定的對(duì)接能力。Vina分?jǐn)?shù)總體接近或低于曲美他嗪，且腔體大小基本與曲美他嗪接近，說明保元湯藥物成分與靶點(diǎn)結(jié)合能力較好，詳見表5、表6?；衔锱cPGR和AR的結(jié)合力較好。結(jié)合能居前7位的成分與靶點(diǎn)進(jìn)行可視化分析，選擇配體小分子模式為“Spacefill”，受體蛋白模式為“Cartoon”，可見靶點(diǎn)蛋白與活性成分對(duì)接結(jié)構(gòu)。詳見圖3～圖9。

表5 化合物和曲美他嗪與靶點(diǎn)對(duì)接的Vina分?jǐn)?shù)

表6 化合物和曲美他嗪與靶點(diǎn)對(duì)接的腔體大小

圖3 Compound 10與NR3C1對(duì)接結(jié)果

圖4 Compound 10與ATP1A1對(duì)接結(jié)果

圖5 Compound 10與AR對(duì)接結(jié)果

圖6 Compound 10與ESR對(duì)接結(jié)果

圖7 Compound 10與PGR對(duì)接結(jié)果

圖8 Compound 6與PGR對(duì)接結(jié)果

圖9 Compound 1與PGR對(duì)接結(jié)果

3 討 論

冠心病屬中醫(yī)學(xué)“胸痹”范疇，其病機(jī)多以本虛標(biāo)實(shí)為主，本虛多以氣虛為主，標(biāo)實(shí)多以血瘀為主[10]。保元湯可補(bǔ)虛培元，氣旺則血行，運(yùn)用以補(bǔ)為通之法治療胸痹。由于保元湯在臨床應(yīng)用及實(shí)驗(yàn)研究中表現(xiàn)出的良好治療作用，目前對(duì)相關(guān)機(jī)制的研究也越來越多。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接方法進(jìn)一步探討保元湯治療冠心病的作用機(jī)制，GO及KEGG富集分析結(jié)果顯示保元湯通過調(diào)控多條通路，作用于線粒體三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化過程，影響細(xì)胞代謝(如能量代謝、活性氧代謝、嘌呤代謝)、細(xì)胞凋亡等過程，從而發(fā)揮保護(hù)心肌的作用。

有氧過程中線粒體通過OXPHOS產(chǎn)生約95%心臟所需的ATP[11]，缺氧期間線粒體功能損傷導(dǎo)致能量代謝改變。保元湯治療冠心病的主要成分包括三磷酸腺苷、腺苷、各類脂肪酸等，主要參與能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。包裹在脂質(zhì)體中的外源性ATP可有效減輕缺血性心肌損傷[12-13]。腺苷不僅參與調(diào)節(jié)能量代謝，并且具有自己的信號(hào)傳導(dǎo)功能[14]。外源性腺苷可協(xié)助恢復(fù)心肌缺血期間存活細(xì)胞的ATP水平；腺苷與其腺苷受體結(jié)合可改善心肌能量的供需平衡，提高O2的利用率，抑制炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，減少活性氧合成，恢復(fù)鈣穩(wěn)態(tài)，降低氧化應(yīng)激，預(yù)防并減少血管內(nèi)皮損傷，抑制血小板聚集等[15]。十三酸、十五烷酸、棕櫚酸、棕櫚油酸均屬于脂肪酸類，脂肪酸和葡萄糖是心肌所需供能的主要底物，底物的利用失衡均引起心臟收縮功能受損[16]。其中棕櫚油酸屬于單鏈不飽和脂肪酸類，通過降低肝脂肪變性，提高膽固醇流出能力等調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，下調(diào)促炎因子白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子α表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，從而延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[17]。

通過GO及KEGG富集分析結(jié)果顯示，得到不同子簇主要調(diào)控cAMP信號(hào)通路、cGMP-PKG信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路等，參與能量代謝、氧化應(yīng)激、嘌呤代謝、細(xì)胞凋亡等生物過程。子簇1主要調(diào)控G蛋白偶聯(lián)受體及其介導(dǎo)的cAMP、cGMP-PKG信號(hào)通路。G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)是最大的信號(hào)膜受體家族，可調(diào)節(jié)心血管、內(nèi)分泌等方面的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。G蛋白可激活質(zhì)膜上的腺苷酸環(huán)化酶(sAC)，將ATP轉(zhuǎn)化為cAMP。子簇1中ADORA1、DRD2、HTR1A、MTNR1A、ADRA2A、CHRM2、MTNR1B、HTR1B等基因均通過G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，下調(diào)sAC活性，減少cAMP信號(hào)通路傳導(dǎo)。cAMP信號(hào)通路中主要的效應(yīng)子為蛋白激酶(PKA)，可使ETC中復(fù)合物磷酸化，造成OXPHOS異常；通過調(diào)節(jié)線粒體基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，調(diào)控線粒體的生物發(fā)生，最終影響能量代謝[18]。sAC激活及PKA磷酸化均促進(jìn)Bax向線粒體移位，誘導(dǎo)細(xì)胞色素C釋放，Caspase-9裂解，引起細(xì)胞凋亡[19]。cGMP-PKG信號(hào)通路在內(nèi)源性心臟保護(hù)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，抑制線粒體Ca2+超載，降低復(fù)氧過程中Ca2+峰值和Ca2+振蕩，抑制膜通透性改變，限制細(xì)胞凋亡，同時(shí)減少心肌過度收縮[20]；減少內(nèi)皮性一氧化氮合酶(eNOS)解偶聯(lián)，抑制氧化應(yīng)激[21]。腺苷可激活cGMP-PKG信號(hào)通路，增加一氧化氮生成，抑制線粒體通透性過渡孔(mPTP)開放，從而達(dá)到調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)的目的[22]。

子簇2主要參與血管內(nèi)皮調(diào)節(jié)及鈣信號(hào)傳導(dǎo)的生物過程。Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是線粒體調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝的關(guān)鍵因素。線粒體Ca2+攝取可影響胞漿Ca2+瞬變、Ca2+振蕩的形成，進(jìn)而調(diào)節(jié)心肌收縮功能[23]。線粒體Ca2+可調(diào)控丙酮酸脫氫酶復(fù)合物(MDH)等三羧酸循環(huán)相關(guān)酶及線粒體ATP合酶的活性，同時(shí)引起胞漿NADH增加，刺激電子傳遞鏈傳導(dǎo)，增加能量生成[24-26]。若鈣穩(wěn)態(tài)失衡，線粒體內(nèi)膜上鈣離子單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MCU)表達(dá)增加，線粒體Ca2+超載，導(dǎo)致ETC失調(diào)，電子泄漏增加，同時(shí)谷胱甘肽還原酶等抗氧化劑活性抑制，最終活性氧生成過多，引起氧化應(yīng)激[27]；導(dǎo)致mPTP開放，Ca2+外流，造成膜電位和ATP產(chǎn)生破壞，同時(shí)細(xì)胞色素C等線粒體相關(guān)凋亡蛋白釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[28]。

子簇3主要參與活性氧的代謝過程。90%的活性氧均由ETC產(chǎn)生[29]。正常情況下，電子傳遞形成ATP的過程中，僅有不到0.1%的質(zhì)子泄漏，與強(qiáng)氧化劑氧分子結(jié)合形成超氧化物，同時(shí)還原型輔酶Ⅱ及其氧化形式(NADPH/NADP+)和谷胱氨肽及其氧化型(GSH/GSSG)等及時(shí)清除活性氧，維持體內(nèi)氧化還原水平[30]。線粒體中mtDNA編碼異常，復(fù)合物Ⅰ、Ⅲ結(jié)構(gòu)及功能異常，膜電位降低，Ca2+超載及mPTP開放等情況均引起ETC紊亂，OXPHOS異常，氧化還原失衡，活性氧生成增多，從而誘發(fā)氧化應(yīng)激，進(jìn)一步造成低密度脂蛋白氧化增加、巨噬細(xì)胞極化、內(nèi)皮功能障礙，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成[31]。

子簇4、子簇5主要參與調(diào)節(jié)心肌收縮力、信號(hào)傳導(dǎo)等生物過程，神經(jīng)細(xì)胞興奮后產(chǎn)生的動(dòng)作電位傳遞到心肌細(xì)胞，經(jīng)過興奮-收縮耦聯(lián)，細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，肌漿網(wǎng)終池釋放大量Ca2+，最終使肌絲滑行，心肌發(fā)生收縮。子簇5、子簇6同時(shí)參與嘌呤代謝、氨基酸代謝等過程。腺嘌呤和鳥嘌呤主要參與細(xì)胞DNA和RNA合成，氧化后生成次黃嘌呤和黃嘌呤，經(jīng)過黃嘌呤氧化酶再氧化生成尿酸。缺血/缺氧可介導(dǎo)此過程中生成大量氧自由基和過氧化氫，降低一氧化氮生物利用度，引起氧化應(yīng)激[32]。

分子對(duì)接結(jié)果顯示，主要化合物與相關(guān)靶標(biāo)對(duì)接良好。PGR作為雌激素受體，可能與冠心病的性別差異相關(guān)[33]；AR參與ATP酶結(jié)合，調(diào)節(jié)能量代謝；NR3C1甲基化狀態(tài)對(duì)急性冠脈綜合征預(yù)后可能產(chǎn)生不良影響[34]；ATP1A1可催化ATP水解，為細(xì)胞提供能量；ESR1是冠心病的候選基因[35]。其中化合物三磷酸腺苷、α-三羥基糞甾烷酸與PGR和AR的結(jié)合力較好，與陽性對(duì)照藥曲美他嗪相比，對(duì)接效果更佳。相關(guān)研究顯示，曲美他嗪可降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕炎癥反應(yīng)，提高冠心病病人心肌能量代謝和心臟功能等[36-37]。本研究結(jié)果顯示，保元湯對(duì)線粒體功能有一定調(diào)控功能，也對(duì)冠心病病人具有較好的心肌能量供應(yīng)和保護(hù)作用，與相關(guān)研究結(jié)果[7]一致。

本研究綜合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法，預(yù)測(cè)保元湯治療冠心病的活性成分、作用靶點(diǎn)、信號(hào)通路。根據(jù)得到的結(jié)果初步發(fā)現(xiàn)保元湯通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路方式調(diào)控線粒體三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化過程，進(jìn)而調(diào)節(jié)能量代謝、活性氧代謝、細(xì)胞凋亡等發(fā)揮保護(hù)心肌的作用，為進(jìn)一步明確冠心病發(fā)病機(jī)制和治療原則提供新思路。