基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討心脾同治方治療慢性心力衰竭的作用機制

史勝楠，王培利，劉建勛

慢性心力衰竭是由于心臟結(jié)構(gòu)或功能變化，導(dǎo)致心室泵血或充盈功能低下的一組復(fù)雜臨床綜合征，主要表現(xiàn)為呼吸困難、乏力、液體潴留等[1]。2017年慢性心力衰竭全球患病人數(shù)超6 430萬人[2]，死亡率居高不下，日漸成為棘手的公共衛(wèi)生問題。目前，主要以阻斷神經(jīng)內(nèi)分泌過度激活和心臟重塑的治療為主，但存在治療靶點單一、毒副作用多、病人依從性差等問題[3]。中醫(yī)學(xué)認為慢性心力衰竭病位在心，然“五臟皆致心力衰竭，非獨心也”，心脾乃母子相生關(guān)系，心之氣血陰陽虧虛，脾失運化，氣血津液運行不暢，導(dǎo)致瘀血、痰濁、水飲等瘀阻心脈而加重病程[4]。母病及子，故心之病，必涉及脾。因此，心脾同治、調(diào)補心脾氣血陰陽平衡為治療之重。

心脾同治方是研究團隊基于經(jīng)典名方當(dāng)歸補血湯研究基礎(chǔ)，結(jié)合臨床實踐總結(jié)的經(jīng)驗方，由生黃芪、當(dāng)歸、白術(shù)、丹參、黃連、紅景天組成，具有益氣活血、養(yǎng)心健脾的功效。課題組前期體內(nèi)、體外研究證實，黃芪、當(dāng)歸組方通過激活磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKt)，提高心肌梗死大鼠心肌細胞內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)mRNA表達，從而發(fā)揮促血管新生作用[5]。益氣藥可抑制心肌細胞外基質(zhì)過度沉積，減輕心室重構(gòu)，改善心肌梗死后心功能[6]。為進一步探討心脾同治方治療慢性心力衰竭的作用機制，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，利用多種相關(guān)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，從化合物-靶點-信號通路-疾病多維度進行深入分析。

1 資料與方法

1.1 心脾同治方相關(guān)信息的整理和收集 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺(TCMSP)數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)獲取心脾同治方六味中藥的化學(xué)成分，將口服生物利用度(OB)和類藥性(drug-likeness，DL)作為篩選閾值，設(shè)定OB≥30%，DL>0.18。同時匯集化學(xué)成分對應(yīng)的有效靶點，并錄入UniProt數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)進行校正、轉(zhuǎn)化和刪重，最終獲取心脾同治方活性成分的基因靶點。

由于TCMSP數(shù)據(jù)庫未收錄紅景天，因此在TCMID數(shù)據(jù)庫(https://bigd.big.ac.cn/databasecommons/database/id/437)中檢索紅景天的化學(xué)成分，并將該成分返回TCMSP數(shù)據(jù)庫，檢索OB和DL值，對未檢索到的成分，通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得該成分的二維結(jié)構(gòu)或SMILE號，并進一步在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)預(yù)測紅景天成分靶點。

1.2 慢性心力衰竭相關(guān)靶點數(shù)據(jù)構(gòu)建 基于人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards，https://www.genecards.org/)和美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=)遴選慢性心力衰竭的靶點，利用Venny2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)對比分析藥物、疾病的潛在靶點，篩選出交集靶點。

1.3 心脾同治方與慢性心力衰竭的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將交集靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)構(gòu)建蛋白互作(PPI)圖，并導(dǎo)入Cystoscape 3.6.0軟件中，構(gòu)建“化合物-靶標-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，通過Network Analyzer工具進行拓撲分析，探討心脾同治方活性成分的“多靶標-多通路-多層次”的治療作用。

1.4 生物信息學(xué)基因本體(GO)分析及信號通路富集分析 將藥物疾病共有靶點進行GO分析及京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析，引用Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)，收集P<0.01，Min Overlap為3且MinEnrichment>1.5 的項目進行篩選，綜合預(yù)測心脾同治方治療慢性心力衰竭關(guān)鍵靶點的生物學(xué)特性及調(diào)控通路。

2 結(jié) 果

2.1 心脾同治方活性成分篩選 經(jīng)過檢索篩選并去重，獲得化學(xué)成分白術(shù)4個、丹參58個、當(dāng)歸2個、紅景天6個、黃連11個、黃芪20個(雖然黃芪皂苷類不符合ADME篩選標準，已有大量文獻證實黃芪皂苷對治療慢性心力衰竭有明顯的療效[7]，因此將該類成分納入研究)，由于篩選的活性成分較多，故選取部分活性成分，詳見表1。該方成分作用的所有靶點經(jīng)去重后共499個，使用Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，詳見圖1。Network Analyzer工具進行拓撲分析，得知網(wǎng)絡(luò)中有601個節(jié)點、2 099個邊，節(jié)點度值大小表示重要程度，排名居前10位的化合物及其靶點詳見圖2。其中化合物包括檞皮素、3-辛醇、花色苷、桃金娘烯醇、黃芪皂苷Ⅳ、山柰酚、木樨草素、黃芪皂苷Ⅲ、黃芪皂苷Ⅰ、黃芪皂苷Ⅱ；對應(yīng)靶點包括PTGS2、SCN5A、PTGS1、ADRB2、CHRM1、RXRA、ADRA1A、NICOA2、AR、ACHE。

圖1 心脾同治方化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 節(jié)點度值居前10位的化合物及靶點

表1 心脾同治方的主要活性成分

2.2 慢性心力衰竭相關(guān)靶點數(shù)據(jù)構(gòu)建 以“chronic heart failure”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫和NCBI基因數(shù)據(jù)庫中檢索。由于GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索到的基因數(shù)量龐大，將relevance值[8]通過中位數(shù)篩選3次，共獲得1 234個相關(guān)基因。NCBI基因數(shù)據(jù)庫得到761個基因，合并去重后得到1 560個慢性心力衰竭相關(guān)基因。將藥物與疾病的靶點輸入韋恩圖制作軟件Venny 2.1，得到254個交集靶點，作為心脾同治方作用于慢性心力衰竭的預(yù)測靶點進行通路富集分析。詳見圖3。

圖3 中藥復(fù)方與慢性心力衰竭靶點韋恩圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓撲分析 將交集靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫，設(shè)置研究物種為“Homo sapiens”，最低相互作用評分設(shè)置為“highest confidence(0.900)”，隱藏網(wǎng)絡(luò)中的單一節(jié)點，其余參數(shù)保持默認設(shè)置，進行PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，詳見圖4。圖中共涉及254個節(jié)點、1 309條邊，平均節(jié)點度值為10.3，聚類系數(shù)為0.491。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscape 3.6.0軟件中，構(gòu)建心脾同治方化合物-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，詳見圖5。Network Analyzer進行拓撲分析，以自由度(degree)、介數(shù)中心性(betweenness centrality)、平均最短路徑長度(average shortest path length)、接近中心性(closeness)作為參考標準，通過degree排序，選取分值大于平均分的基因作為關(guān)鍵靶點，共34個，主要包括信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1)、絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶1(Akt1)、c-JUN氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JUN)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)、Janus激酶2(Janus kinase 2，JAK2)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)等，將這些靶點作為心脾同治方治療慢性心力衰竭的關(guān)鍵靶點。選取居前20個關(guān)鍵靶點，詳見圖6。

圖4 中藥-慢性心力衰竭共有靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 中藥化合物-靶點-慢性心力衰竭網(wǎng)絡(luò)圖

圖6 中藥-疾病關(guān)鍵靶點(degree值，居前20位)

2.4 生物信息學(xué)GO分析 將共有靶點導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫進行GO富集分析，共富集到7 137條生物過程(biological process，BP)、1 072項分子功能(molecular function，MF)、605項細胞組成(cellular component，CC)。BP主要涉及血液循環(huán)、循環(huán)系統(tǒng)、MAPK級聯(lián)調(diào)節(jié)、多肽應(yīng)答、細胞對氮化合物的應(yīng)答、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、脂多糖應(yīng)答等方面。CC主要涉及膜筏、溶酶體、囊泡腔、受體復(fù)合物等，主要集中在細胞膜和蛋白復(fù)合物上。MF主要包括蛋白激酶活性、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、細胞因子受體、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白質(zhì)二聚體活性等方面，根據(jù)每個項目P值及基因數(shù)繪制條形圖，詳見圖7。

圖7 GO富集分析柱狀圖

2.5 KEGG通路富集分析 將共有靶點導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫進行KEGG通路富集分析，總共富集到280條信號通路。相關(guān)通路涉及糖基化終末產(chǎn)物(AGE)及其受體(RAGE)信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、PI3K/Akt信號通路、白細胞介素-17(IL-17)信號通路、低氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)信號通路、輔助性T細胞17(Th17)分化、TNF信號通路、細胞凋亡等。根據(jù)每條項目P值及基因數(shù)量繪制氣泡圖，詳見圖8。

圖8 KEGG富集分析氣泡圖

3 討 論

慢性心力衰竭的發(fā)病機制與交感神經(jīng)系統(tǒng)、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、炎性因子過度激活有關(guān)，脾胃受自主神經(jīng)的影響，二者均通過不同遞質(zhì)產(chǎn)生不同的病理變化，同時慢性心力衰竭常合并胃腸瘀血導(dǎo)致脾胃功能紊亂，可見心脾關(guān)系密切[9]。心脾同治方中黃芪補益心脾之氣，助心氣推動血液運行，助脾氣化生氣血之源，為君藥；當(dāng)歸、丹參養(yǎng)血活血，紅景天益氣活血化瘀，《本草綱目》記載：“紅景天，本經(jīng)上品，祛邪惡氣，補諸不足”，三藥為臣；黃連入中焦，清熱燥濕，祛腸胃之瘀滯，為佐藥。白術(shù)苦溫入脾經(jīng)，燥濕健脾，加強益氣助運之力，同時引諸藥入脾經(jīng)，為使藥。

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對心脾同治方成分、靶點與疾病的生物信息學(xué)進行綜合分析。心脾同治方化合物靶點網(wǎng)絡(luò)中，具有高度中心性的關(guān)鍵化合物分子主要來源于黃芪、紅景天、丹參，這3味藥物廣泛用于心血管領(lǐng)域。其中槲皮素、3-辛醇、花色苷、山柰酚均具有較強的抗炎活性[10]。課題組研究發(fā)現(xiàn)，檞皮素、山柰酚可抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB和Akt磷酸化而減少心臟成纖維細胞TNF-α、IL-6及IL-1β炎性因子分泌[11-12]。檞皮素可降低冠心病病人IL-10、TNF-α表達[13]，通過多重信號通路抑制氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)介導(dǎo)的內(nèi)皮損傷，發(fā)揮抗動脈粥樣硬化的作用[14]。木樨草素通過抑制促凝蛋白酶活性、纖維蛋白原與凝血酶之間的相互作用，發(fā)揮抗血栓功能[15]。桃金娘烯醇可激活超氧化物歧化酶等內(nèi)源性抗氧化酶活性，維持促凋亡和抗凋亡途徑(Bax和Bcl-2)平衡，以此減少缺血再灌注后的心肌損傷[16]。黃芪皂苷Ⅳ具有保護心肌缺血、調(diào)節(jié)肌漿網(wǎng)Ca2+泵、促進血管生成、改善能量代謝、抑制心肌肥厚和纖維化、減少心肌細胞凋亡的作用[17]。化合物靶點自由度較高的前列環(huán)素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)是花生四烯酸合成前列環(huán)素類(PGs)和血栓素A2(TXA2)的關(guān)鍵酶，參與動脈硬化的病理過程，其過度表達導(dǎo)致血管壁炎癥反應(yīng)，刺激血管平滑肌細胞增殖和遷移[18]。

SCN5A基因編碼Na_v1.5的α亞基，該通道主要控制內(nèi)向鈉電流，并在調(diào)節(jié)心臟電生理功能方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，SCN5A表達減少導(dǎo)致小鼠心肌中晚期Na+電流增加，活性氧不斷累積，造成心肌細胞結(jié)構(gòu)紊亂，線粒體損傷和纖維化[19]。MAPK1、MAPK3、MAPK14屬于MAPK家族[20]，通過細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)、p38蛋白激酶、JNK等多條通路調(diào)控細胞凋亡、能量代謝、神經(jīng)內(nèi)分泌因子釋放，從而控制炎癥反應(yīng)，改善心力衰竭[21-22]。由此可見，心脾同治方在抑制炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用。

通過對交集靶點分析發(fā)現(xiàn)，STAT3自由度相對較高，即STAT3在心脾同治方治療慢性心力衰竭過程中具有重要的生物學(xué)意義。作為諸多細胞內(nèi)信號通路的關(guān)鍵蛋白，STAT3參與心肌細胞凋亡、心肌能量代謝、心室重構(gòu)、炎癥反應(yīng)等病理生理改變[23-24]。關(guān)鍵靶點中的炎性因子TNF-α、IL-6與心力衰竭嚴重程度密切相關(guān)，可降低左室射血分數(shù)，直接損傷心肌纖維，導(dǎo)致心肌收縮功能減退[25]，同時促炎因子激活STAT3發(fā)揮作用。

KEGG富集通路主要包括流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、PI3K/Akt通路、炎性因子相關(guān)信號通路、HIF-1信號通路、細胞凋亡等。FSS是血流與血管壁摩擦產(chǎn)生的平行于血管壁的切線應(yīng)力[26]。有研究顯示，低FSS誘導(dǎo)內(nèi)皮功能紊亂，促使動脈粥樣硬化的發(fā)生及斑塊形成，同時升高一氧化氮合酶3活性和VEGFA表達[27]。細胞凋亡是由基因調(diào)控的細胞程序性死亡，有助于維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，過度的心肌細胞凋亡導(dǎo)致心肌收縮單位進行性丟失，造成心功能不全[28]。Th17細胞是以分泌IL-17為特征的輔助性淋巴細胞亞群，產(chǎn)生IL-17、IL-6、TNF-α，這些炎性因子激活導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)，反之誘導(dǎo)心肌細胞凋亡程序的啟動，加重心力衰竭進程[29]。PI3K/Akt作為重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其激活作用于下游的TNF-α/核轉(zhuǎn)錄因子-κB、IL-6/STAT3、Bcl-2/p53等多個靶點，抑制炎癥反應(yīng)，清除氧自由基，調(diào)控線粒體能量生成，維持心肌細胞凋亡機制的動態(tài)平衡，進而維持正常心功能[30-31]。缺血性心臟病、心力衰竭的病理生理發(fā)展過程中，HIF-1作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)血管生成、血管重塑、維持葡萄糖代謝和氧化還原穩(wěn)態(tài)，發(fā)揮重要的保護作用[32]。

綜上所述，心脾同治方通過PI3K、Akt1、MAPK、STAT3、IL-6、TNF-α、VEGFA等關(guān)鍵靶點，調(diào)控PI3K/Akt通路、HIF-1信號等通路抑制炎癥反應(yīng)，改善心室重構(gòu)，減少心肌細胞凋亡，提高心肌能量代謝，為心脾同治方治療慢性心力衰竭的進一步研究提供了依據(jù)。