FGFR2基因異常甲基化在鎳暴露與非綜合征唇腭裂關聯(lián)中的作用

潘亞權 倪文麗 楊文蕾 靳蕾 李智文 任愛國 王琳琳

中國唇腭裂的發(fā)病率約為1.4/1 000[1]。以是否伴有其它先天畸形為標準，唇腭裂可分為綜合征唇腭裂和非綜合征唇腭裂，其中不伴有其它先天畸形的非綜合征唇腭裂約占70%[2]。非綜合征唇腭裂的病因復雜，普遍被認為受遺傳和環(huán)境等多種因素影響。環(huán)境因素如吸煙、飲酒、葉酸缺乏等[3]，與非綜合征唇腭裂發(fā)生風險增加有關。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，胎兒臍帶鎘、鉛、鎳濃度與唇腭裂發(fā)生風險增加存在顯著的劑量反應關系[4]，提示環(huán)境金屬暴露與唇腭裂發(fā)生存在聯(lián)系，但其致畸機制尚不清楚。

鎳廣泛存在于水、土壤和空氣等環(huán)境中，是一種潛在的免疫調節(jié)劑和免疫毒性劑[5]，有生殖毒性和發(fā)育毒性，會導致不育、流產(chǎn)和出生缺陷等[6]。環(huán)境顆粒物中的金屬鎳暴露與DNA甲基化改變有關[7]。已有研究發(fā)現(xiàn)，多種出生缺陷，包括唇腭裂、神經(jīng)管缺陷、先天性心臟病等與DNA甲基化異常相關[8-10]。外部環(huán)境對DNA甲基化的影響會影響哺乳動物的發(fā)育，造成胎兒對疾病的易感性[11]。FGFR2是成纖維細胞生長因子的受體，其介導的FGF信號通路受損可能導致了3～5%的非綜合征唇腭裂的發(fā)生[12]。本研究旨在探討FGFR2基因在母體孕期鎳暴露與胎兒非綜合征唇腭裂發(fā)生風險的關聯(lián)中發(fā)揮的作用。

對象和方法

一、研究對象

1.研究人群來自于本項目組于2002年開始在山西省的平定、昔陽、太谷、澤州和壽陽縣進行的以人群為基礎的重大體表出生缺陷監(jiān)測系統(tǒng)。病例納入條件：產(chǎn)前終止妊娠或分娩時診斷為非綜合征唇腭裂并采集有臍帶血標本的患兒。對照納入條件：匹配胎兒性別和母親孕周，并采集有臍帶血標本的無出生缺陷健康胎兒或新生兒。排除標準：病例或對照母親的調查問卷缺失；病例或對照母親患有慢性疾病，嚴重的妊娠并發(fā)癥或最近一個月內服用過敏感藥物。本項目已通過北京大學生物醫(yī)學倫理委員會的倫理審查。所有納入對象均已簽署書面知情同意書。

2.調查問卷和生物樣本：由經(jīng)過統(tǒng)一培訓的調查員使用結構式問卷調查表，對病例和對照組胎兒母親進行面對面問卷調查。調查完畢的紙質問卷由專人負責運回項目組，采用Epidata 3.0軟件，雙人錄入并專人核對。產(chǎn)科醫(yī)生在孕婦終止妊娠或分娩時收集臍帶組織和臍帶血標本。項目組人員定期前往現(xiàn)場把標本轉運回實驗室，運送過程使用干冰保持低溫條件，運達后將臍帶組織置于-30 ℃冰箱保存，將臍帶血置于-80 ℃冰箱保存。

二、研究方法

1.研究設計：本研究采用兩階段病例對照研究設計，在第一階段，選取10例非綜合征唇腭裂病例和10例性別(一致)、孕周(±2周)相匹配的無先天畸形對照，通過甲基化芯片平臺(Illumina 850K)，檢測臍帶血細胞全基因組甲基化水平。在USCS網(wǎng)站(https://genome.ucsc.edu/index.html)查找FGFR2基因甲基化島位置信息，在PubMed-Gene數(shù)據(jù)庫查找FGFR2甲基化島片段序列，通過引物設計網(wǎng)站(http://www.epidesigner.com/)，在線設計PCR引物。正向引物為:5′-aggaagagag TGGAAGTTTTGTTTTTGTTATTTTT-3′;反向引物為:5′-cagtaatacgactcactatagggagaaggct CAACAATACCA CCCCTAACCAT-3′。

在第二階段，擴大人群，共納入24例非綜合征唇腭裂病例和57例無先天畸形對照，取臍帶血，通過Sequenom MassARRAY時間飛行質譜陣列基因分析平臺，分析驗證FGFR2基因甲基化島的平均甲基化水平，探討其DNA甲基化在鎳暴露與非綜合征唇腭裂關聯(lián)中的作用。

2.實驗檢測：

本課題組前期已通過電感耦合等離子體質譜，完成臍帶鎳濃度的測定[4]。

(1)DNA甲基化檢測流程：基因組DNA亞硫酸氫鹽轉化，WGA方式擴增、片段化，芯片雜交、洗脫、延伸、成像，數(shù)據(jù)分析。

(2)Sequenom MassARRAY質譜分析：DNA重亞硫酸鹽處理，甲基化特異性PCR，蝦堿性磷酸酶SAP反應，堿基特異性酶切反應，脫鹽，上機檢測，數(shù)據(jù)分析。

3.統(tǒng)計學分析：根據(jù)所有研究對象鎳濃度的中位值，將鎳濃度轉換為二分類變量，即低暴露組和高暴露組。高低暴露組間和病例對照組間的人口學特征差異分析，正態(tài)分布的連續(xù)變量采用t檢驗，偏態(tài)分布的連續(xù)變量采用非參數(shù)檢驗；分類變量采用Pearson卡方檢驗或Fisher精確檢驗。

使用Mann-Whitney U檢驗分析不同病例對照組間甲基化水平的差異；使用非條件Logistic回歸模型調整母親孕期葉酸補充、主動或被動吸煙和飲酒等因素，分析甲基化水平與非綜合征唇腭裂發(fā)生的關聯(lián)。根據(jù)鎳濃度和目的基因甲基化水平的分布類型，采用Pearson相關或Spearman相關分析方法，分析臍帶鎳濃度與目的基因甲基化水平的關系；并進一步使用線性回歸模型調整母親孕期葉酸補充、主動或被動吸煙和飲酒等因素。

統(tǒng)計分析均采用雙側檢驗，以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。使用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。

結 果

1.甲基化芯片結果：階段一共納入10例非綜合征唇腭裂病例和10例孕周、性別相匹配的無出生缺陷的對照。病例對照組間孕周和性別差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

FGFR2基因有2個位于基因體區(qū)的位點的甲基化值在病例組和對照組間差異有統(tǒng)計學意義，且病例組的甲基化值高于對照組的甲基化值0.05以上(P<0.05)；這兩個位點的甲基化值在鎳高暴露組和低暴露組間的差異也有顯著性(P<0.05)，見表1。

表1 FGFR2基因甲基化差異位點Table 1 Methylation difference of FGFR2

2. Sequenom MassARRAY質譜結果：階段二納入24例非綜合征唇腭裂病例和57例無先天畸形對照。表2顯示了病例組和對照組母親的基本情況。病例組和對照組母親的分娩年齡、BMI、教育水平、產(chǎn)次、葉酸補充、吸煙、飲酒、孕周、胎兒性別差異均無顯著性(P>0.05)。

表2 第二階段病例對照母親和胎兒的基本特征Table 2 Characteristics of mothers andinfants of cases and controls in stage 2

表3顯示了高暴露組和低暴露組母親的基本情況。高暴露組和低暴露組母親的分娩年齡、BMI、教育水平、產(chǎn)次、葉酸補充、吸煙、飲酒、孕周、胎兒性別差異均無顯著性(P>0.05)。

表3 第二階段鎳高低暴露組間母親和胎兒的基本特征Table 3 Characteristics of mothers and infants of high exposure group and low exposure group in stage 2

對照組甲基化水平的中位數(shù)及其四分位數(shù)間距為3.36%(2.86%,3.81%)，病例組甲基化水平的中位數(shù)及其四分位數(shù)間距為3.80%(3.23%,4.53%)，對照和病例組甲基化水平的差異有統(tǒng)計學意義(P=0.015)。調整了母親孕期葉酸補充、主動或被動吸煙和飲酒，非條件Logistic回歸模型結果顯示，F(xiàn)GFR2的甲基化水平升高與非綜合征唇腭裂發(fā)生風險增加有關(P=0.037)，OR(95%CI)為1.89(1.04,3.32)。

臍帶組織鎳濃度和FGFR2基因甲基化水平的分布類型均為非正態(tài)分布，采用Spearman相關法分析臍帶鎳濃度與FGFR2基因甲基化水平的相關性，結果顯示，鎳濃度與FGFR2基因的甲基化水平之間存在相關關系(rs=0.229,P=0.040)。使用多重線性回歸模型，調整母親孕期葉酸補充、主動或被動吸煙和飲酒，分析鎳暴露水平對FGFR2基因甲基化水平的影響。結果顯示，臍帶組織鎳暴露水平對FGFR2基因甲基化水平的影響不顯著(P=0.073)。

討 論

本研究采用兩階段的病例對照研究設計。在階段一，發(fā)現(xiàn)胎兒臍帶鎳的高暴露水平可導致FGFR2基因的高甲基化，且FGFR2的高甲基化水平與非綜合征唇腭裂的發(fā)病風險增加有關。在第二階段，擴大人群，納入24例非綜合征唇腭裂病例和57例無先天畸形對照，發(fā)現(xiàn)胎兒FGFR2基因的高甲基化可能會增加非綜合征唇腭裂的發(fā)生風險，未發(fā)現(xiàn)鎳暴露水平對FGFR2甲基化水平存在顯著影響。

一項全基因組表觀遺傳學關聯(lián)分析的研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境顆粒物中的金屬鎳暴露與DNA甲基化改變相關[7]。鎳(Ⅱ)離子可以取代TET雙加氧酶的輔因子鐵(Ⅱ)，抑制TET基因介導的5-甲基胞嘧啶的氧化活性，抑制DNA去甲基化，從而導致基因高甲基化[13]。本研究的結果顯示胎兒臍帶鎳的高暴露水平與FGFR2基因甲基化水平的升高相關，但在調整了葉酸補充、吸煙和飲酒因素后，未見兩者相關聯(lián)，可能是樣本量不足導致研究結果不穩(wěn)定。

已有研究發(fā)現(xiàn)CDH1，LINE-1和IRF6基因的DNA甲基化與非綜合征唇腭裂的關聯(lián)性[14-15]。一項人群研究在184例非綜合征唇腭裂的全血樣本中對12個基因(FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGF2、FGF3、FGF4、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF18和NUDT6)進行了測序和關聯(lián)分析，并用蛋白質結構分析預測氨基酸功能的變異，指出FGF信號通路受損可能導致了3～5%的非綜合征唇腭裂的發(fā)生[12]。本研究驗證了FGFR2基因甲基化水平的改變與非綜合征唇腭裂發(fā)病風險增加有關。成纖維細胞生長因子信號通路涉及顱面發(fā)育多個方面，包括唇和腭的形成，其在調節(jié)神經(jīng)嵴的誘導和遷移、骨骼形成和上皮-間質交互方面的作用尤為重要[16-17]。FGFR2是成纖維細胞生長因子的受體。FGFR2介導的FGF信號通路在小鼠腭部發(fā)育的多個階段，如再定向、水平生長等方面起著重要作用[18]。研究表明，早期腭發(fā)育是通過上皮-間質相互作用完成的，F(xiàn)GF10和FGFR2協(xié)調的上皮-間質相互作用的破壞會導致腭裂[19]。

本研究采用兩階段的研究設計，先通過全基因組表觀遺傳分析發(fā)現(xiàn)FGFR2基因的異常甲基化，后擴大樣本量進行驗證，階段二在一定程度上支持了階段一的結果，且在各階段設有嚴格的質量控制措施，研究結論可信。當然，考慮到DNA甲基化的組織特異性，本研究DNA甲基化檢測的樣本來自于胎兒臍帶血，而非其唇腭組織，存在一定的局限性。不過也有研究發(fā)現(xiàn)血樣本DNA甲基化水平可在一定程度上代表唇部組織樣本的DNA甲基化水平[20]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，胎兒FGFR2基因甲基化水平的升高與非綜合征唇腭裂發(fā)生風險增加存在關聯(lián)。雖不能得出臍帶鎳濃度與FGFR2基因甲基化水平相關的結論，但也為環(huán)境金屬污染與非綜合征唇腭裂的病因學探索提供了思路。當然，本研究的結論需要在不同的人群或更大的樣本中進一步分析驗證。