卵巢子宮內膜異位癥病灶組織黏附相關基因與通路分析

倪喆鑫 畢艷麗 孫帥 程雯 俞超芹

子宮內膜異位癥是一種雌激素依賴性疾病，其特征是子宮內膜基質細胞與腺細胞在子宮被覆粘膜及子宮肌層以外部位種植生長，影響著10～15%的育齡婦女[1]?；颊咴馐苤煌潭鹊挠绊?，如痛經、月經紊亂、不孕等，也會造成不良妊娠結局的發(fā)生[2-3]。卵巢子宮內膜異位癥由于內膜組織在卵巢部位種植生長導致，通常以囊腫形式存在并對卵巢功能存在不利影響[4]。雖然該病的病理診斷已經明確，但發(fā)病機制仍存在爭議，可能與遺傳、表觀遺傳、環(huán)境因素和免疫功能紊亂等多種因素有關[5]。

在該病眾多發(fā)病機制學說中，經血逆流學說最為廣泛接受。隨著月經血逆流，內膜組織碎片會沿著子宮-輸卵管-腹腔方向前進，在特定部位特定條件下種植生長[6]。在這一過程中，組織細胞間的黏附作用極為重要。為此，本研究擬從Gene Expression Omnibus數據庫(GEO)中挖掘卵巢內異癥病灶組織差異表達基因，聚焦黏附相關差異基因，從基因差異角度出發(fā)，探討經血逆流學說中內膜組織黏附種植的可行性與現實性。

資料與方法

1.基因芯片的選取以及差異基因的篩選：研究利用美國國立生物技術信息中心(National Biotechnology Information Center, NCBI)的Gene Expression Omnibus (GEO)數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)進行基因數據的搜索與篩選。選擇檢索式為((ovary endometriosis) OR (ovarian endometriosis)) AND "Homo sapiens"[porgn:__txid9606]，搜索限定條件為Expression profiling by array，tissue。搜索時間為2019年10月8日。利用GEO的R語言分析工具GEO2R進行分析，利用變化倍數(fold changes，FC)判定基因差異大小，取logFC絕對值>2，多次試驗調整后的P(adj.P)<0.05的基因，得到兩組相關差異基因與數據。利用value distribution軟件計算所選樣本的值數據分布，以顯示值數據是否在樣本中居中，從而適合交叉比較。

2.差異基因生物學功能及KEGG通路分析：將得到的差異基因去重，并刪除無對應Gene symbol的基因片段后，利用功能注釋生物信息學芯片分析技術(Functional Annotation Bioinformatics Microarray Analysis，DAVID)(https://david.ncifcrf.gov/)對所有差異基因進行ID轉換。利用Functional Annotation Tool對所有差異基因進行GO(gene ontology)生物學過程富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析，找出最顯著富集的功能注釋?；蚋患潭扔肊ASE評分(修正Fisher精確檢驗P值)表示，范圍從0到1。修正Fisher精確檢驗P值等于0表示完全富集。通常P值≤0.05，在注釋類別中被認為是非常豐富的。

3.黏附相關基因篩選與通路圖制作：在GO生物學過程富集以及KEGG通路富集分析的基礎上篩選出黏附相關基因，利用文氏圖在線工具(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)篩選出兩部分共同基因。利用GEO2R分析這些基因在每個樣本中的表達情況，然后用在線KEGG 數據庫(http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)找出密切相關的通路。

結 果

1.差異基因篩選：共檢索到12篇相關文獻，通過PubMed數據庫逐一閱讀后，最終納入研究涉及GEO平臺為GPL571，實驗組為GSE25628，卵巢異位內異癥病灶組織樣本7個(設為OEM組)，正常內膜組織樣本6個(設為CON組)。所選樣本值數據在樣本中居中，適合交叉比較(圖1)。經篩選后，在OEM樣本中符合logFC絕對值>2，adj.P<0.05的上調基因有247個，下調基因有321個。

圖1 所選樣本值數據分布圖Figure 1 Data distribution of selected sample values

2.差異基因生物學過程及通路富集分析：運用在線生物學信息注釋數據庫DAVID，對上述差異基因進行GO生物學過程富集分析，其中細胞粘附、血管生成、炎癥反應等35個生物學過程顯著富集(表1)。對上述差異基因進行KEGG信號通路富集注釋，共得到13條有顯著富集的KEGG通路，主要包括血管平滑肌收縮、局灶性粘連和細胞粘附分子等(表2)。

表1 差異表達基因生物學過程富集分析結果Table 1 Results of Gene Ontology analysis on differentially expressed genes

表2 差異表達基因相關KEGG通路分析結果Table 2 Results of KEGG pathway analysis on differentially expressed genes

3.細胞黏附相關基因及KEGG通路：GO生物學過程富集分析發(fā)現細胞黏附(cell adhesion)涉及差異基因數目最多(7.7%)，而在KEGG通路富集分析中局灶性粘連(Focal adhesion)相關基因最多(3.0%)。將兩部分相關基因羅列分析，利用文氏圖在線工具篩選發(fā)現THBS1、VWF、THBS2等8個基因(排除名稱轉換過程中相同基因)在兩種黏附相關分析過程中均涉及。通過GEO2R在線分析發(fā)現，卵巢內異癥病灶組織中THBS1、VWF、THBS2、COMP、COL5A1、COL6A2和ITGA7顯著上調，而ITGB8顯著下調(圖2)。在此基礎上，對這8個基因進一步用KEGG 數據庫工具明確相關通路情況，發(fā)現與細胞外基質受體相互作用(ECM-receptor interaction)、局灶性粘連(Focal adhesion)和PI3K-Akt 信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)這3條通路密切相關。

圖2 黏附相關基因在各樣本中表達情況Figure 2 Expression degree of adhesion genes in each sample

討 論

本研究通過現有數據挖掘發(fā)現，卵巢內異癥病灶組織中表達差異顯著的基因較多(568個)。利用GO生物學過程富集分析篩選顯著差異生物學過程35個；利用KEGG通路富集分析篩選出顯著差異通路13條。在此基礎上，進一步綜合兩種分析結果，篩選出黏附密切相關基因8個，分別為THBS1、THBS2、VWF、COMP、COL5A1、COL6A2、ITGA7和ITGB8。

THBS1別名TSP、THBS、TSP1、TSP-1，其編碼的蛋白質是一種粘附性糖蛋白，可通過CD36-和CD47-介導的一氧化氮(NO)信號抑制以及調節(jié)血管內皮細胞生長因子(VEGF)[7]的活性和生物利用度，直接抑制血管生成。THBS2與THBS1共有80%的蛋白質序列，但THBS2是一種控制內皮細胞凋亡增殖平衡的基質細胞蛋白，與腫瘤血管生成有關[8]。THBS2通過直接影響內皮細胞的遷移、增殖、存活和凋亡以及拮抗VEGF活性來抑制血管生成[9]。在內膜組織成功黏附特定部位后，需要新生血管來維持。在這一過程中，血管生成這一生物過程尤為重要。本研究中卵巢內異癥病灶已具備豐富的血管提供營養(yǎng)支持，而THBS1和THBS2上調可認為是機體抑制病灶血管生成的自我調節(jié)過程。在內異癥診斷方面，監(jiān)測THBS1和THBS2編碼蛋白水平增高程度也許能夠成為一種判斷內異癥病情程度的有效輔助手段。

VWF別名VWD、F8VWF，能夠編碼一種參與止血的糖蛋白，在血小板與血管損傷部位的粘附和血液中各種蛋白質的轉運中發(fā)揮作用[10]，更是正常血管生成的關鍵調節(jié)因子[11]卵巢內異癥病灶存在周期性出血的疾病特征，伴隨著局部病灶血管的破壞與再生。VWF上調提示病灶內血管生成活動活躍，VWF在促進卵巢內異癥發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。

COMP別名MED、EDM1、EPD1、TSP5、PSACH、THBS5，編碼的蛋白是一種非膠原細胞外基質蛋白，屬于基質金屬蛋白酶的一種，可降解細胞外基質的成分[12]，有研究顯示結腸癌組織中COMP的表達水平明顯高于癌旁正常組織，并通過激活PI3K/Akt/mTOR/p70S6K通路部分促進結腸癌細胞增殖[13]。本次研究發(fā)現，卵巢內異癥病灶中COMP顯著上調，這可能與COMP編碼蛋白加大對內膜基質細胞外基質破壞作用，促進內異灶生長密切相關。此外，COMP編碼的蛋白很可能通過激活異位基質細胞PI3K/Akt通路，從而促進該種細胞增殖。

V型膠原蛋白的α1鏈是由COL5A1編碼[14]。V型膠原蛋白占到總膠原含量的1%到5%之間，能夠影響膠原原纖維形成和直徑[15]，從而影響非軟骨結締組織的構成[16]。COL6A2編碼VI型膠原的三個α鏈中的一個，而VI型膠原是一種在大多數結締組織中發(fā)現的珠狀纖維膠原，可與多種細胞膜和細胞外基質蛋白相互作用[17]。這兩種基因在病灶中都顯示上調，并可能在逆流的內膜組織碎片中也存在上調，促進了組織碎片的局部黏附，在構成和維持病灶起了很大作用。

整合素是由α鏈和β鏈組成的異二聚體膜蛋白，介導廣泛的細胞-細胞和細胞-基質相互作用，從而在細胞遷移、形態(tài)發(fā)育、分化和轉移中發(fā)揮作用[18]。ITGA7編碼的蛋白質屬于整合素α鏈家族而ITGB8編碼的蛋白質是整合素β鏈家族的一員。在研究中發(fā)現，雖然ITGA7與ITGB8同屬于整合素相關基因，卻在卵巢內異癥病灶組織中成相反的變化。鑒于研究的是已經形成并穩(wěn)固的內異灶，推測在一定程度上ITGA7可能與病灶形成后的維持相關，而ITGB8可能與病灶早期的黏附相關。

由于目前卵巢內異癥組織與正常內膜組織的基因芯片數據較少，本次研究納入的數據有限，并受限于該基因芯片的完成時間較早，可能存在諸多不足。但本次研究在一定程度上表明，上述8個黏附相關基因在內異癥形成和發(fā)展過程中起著重要作用。本次研究只討論了黏附相關基因，而上文提示有顯著性差異基因多達幾百個，涉及生理生化的方方面面，這需要在下一步研究中繼續(xù)挖掘與分析。但值得注意的是，本研究從生物信息學角度探究了隨經血逆流內膜組織黏附種植發(fā)展成為卵巢內異癥的可能性，為經血逆流學說提供了基因角度證據，對內異癥的臨床和基礎研究具有一定積極意義。