“花魔芋”頂芽組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究

李曉亮 楊進(jìn)成 馬文彬 張鐘 鄧成忠 張玉榮 左麗娟 胡新洲 廖凱 段永華

摘要 [目的]通過器官發(fā)生直接途徑再生植株的方式，研究建立完善的“花魔芋”組織培養(yǎng)快繁技術(shù)體系。[方法]以“花魔芋”球莖的頂芽為外植體，研究不同的滅菌方法、培養(yǎng)基、繼代周期等因素對(duì)“花魔芋”組織培養(yǎng)的影響。[結(jié)果]適合“花魔芋”頂芽滅菌的方法是0.20% HgCl 2滅菌10～15 min;適合初代培養(yǎng)的培養(yǎng)基是MS+6-BA 1.0～3.0 mg/L+NAA 0.2～0.5 mg/L;適合增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基是MS+6-BA 1.0～2.0 mg/L+NAA 0.1～0.2 mg/L;適合生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基是1/2MS + NAA（或IBA） 0.1～0.2 mg/L+活性炭0.1%。[結(jié)論]得出了一套完善的“花魔芋”組織培養(yǎng)快繁技術(shù)體系，能育出有較高素質(zhì)的“花魔芋”種苗，可以推廣應(yīng)用于“花魔芋”的工廠化育苗，同時(shí)也為其他品種的魔芋組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究提供參考。

關(guān)鍵詞 花魔芋;球莖;頂芽;組織培養(yǎng);快速繁殖;培養(yǎng)基

中圖分類號(hào) S 632.3? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）16-0123-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.16.033?? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on Rapid Propagation Technology in Tissue Culture of Apical Buds from ?Amorphophallus konjac

LI Xiao-liang，YANG Jin-cheng，MA Wen-bin et al （Yuxi Academy of Agricultural Sciences，Yuxi，Yunnan 653100）

Abstract [Objective] To study and further establish a perfect technology system of rapid propagation in tissue culture of ?Amorphophallus konjac， by means of direct organogenesis and plant regeneration.[Method] Apical buds sprouting from the corms of ?Amorphophallus konjac ?were used as explants，and effects of different sterilization method，medium and subculture cycle on tissue culture of ?Amorphophallus konjac ?were studied.[Result]The results showed that the suitable explants sterilization method was treatment 10-15? min by 0.20% HgCl 2，suitable primary culture medium was MS+6-BA1.0-3.0mg/L+NAA0.2-0.5mg/L，suitable proliferation medium was MS+6-BA 1.0-2.0 mg/L+NAA 0.1-0.2 mg/L，and suitable rooting medium was 1/2MS+NAA（or IBA） 0.1-0.2mg/L+activated carbon 0.1%.[Conclusion]The technology system was acquired in this study，which can produce high quality seedling，promote and apply in the factory seedling production of ?Amorphophallus konjac， and also provide important reference for study on tissue culture technology of other varieties in ?Amorphophallus konjac.

Key words ?Amorphophallus konjac; Corm;Apical bud;Tissue culture;Rapid propagation;Medium

魔芋，又名磨芋或蒟蒻，是天南星科（Araceae）魔芋屬 （Amorphophallus ?Blume）的總稱，栽培學(xué)上歸屬于薯芋類作物。魔芋屬于多年生宿根草本植物，在我國(guó)有2 000余年的栽培歷史。魔芋是一種具有較高價(jià)值的經(jīng)濟(jì)作物，含有豐富的具有獨(dú)特理化特性的葡甘聚糖，對(duì)高血脂、高膽固醇、糖尿病、肥胖病、便秘癥等具有防治作用，在食品及食品添加劑上有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，是化妝品、紡織業(yè)印花糊料、建筑業(yè)涂料、食用膜、地膜中的綠色無污染原料，在鉆探中作護(hù)壁劑、壓裂劑等效果更佳，具有廣闊的開發(fā)前景[1]。正因如此，魔芋在各地被廣泛種植。

魔芋的常規(guī)繁殖主要是采用塊莖進(jìn)行無性繁殖，但存在著用種量大、繁殖系數(shù)低、生產(chǎn)成本高、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、種性易退化等問題，制約著魔芋產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1-2]。為解決這些問題，目前最有效的技術(shù)措施是植物組織培養(yǎng)技術(shù)。

花魔芋 （Amorphophallus konjac） 是魔芋屬的代表種[1]，是我國(guó)分布最廣、栽培最多的魔芋種類[3]。目前，國(guó)內(nèi)已有較多關(guān)于“花魔芋”的組織培養(yǎng)技術(shù)研究報(bào)道[4-12]，但這些報(bào)道的絕大部分是通過器官發(fā)生間接途徑再生植株的方式[4-10]，而這種方式因經(jīng)愈傷組織成苗會(huì)出現(xiàn)遺傳不穩(wěn)定的現(xiàn)象，表現(xiàn)為生長(zhǎng)習(xí)性、熟性、發(fā)育特性和抗性發(fā)生變異[13]，雖有少許關(guān)于“花魔芋”通過器官發(fā)生直接途徑再生植株的研究報(bào)道[11-12]，但其存在試驗(yàn)處理較少、研究?jī)?nèi)容簡(jiǎn)單、不涉及種苗素質(zhì)等，技術(shù)體系尚不成熟[2]。鑒于此，筆者開展“花魔芋”的組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究，旨在建立一套完善且能高效繁育優(yōu)質(zhì)種苗的“花魔芋”組織培養(yǎng)快繁技術(shù)體系，從而促進(jìn)魔芋產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 采用“花魔芋”球莖的頂芽為供試材料。選擇經(jīng)通風(fēng)陰干后的生長(zhǎng)健壯、無病蟲害、作生產(chǎn)用種（單個(gè)重量70.34～162.63 g）、高1.4～1.6 cm頂芽的“花魔芋”球莖。

1.2 外植體滅菌 從魔芋球莖上端凹陷處的頂芽基部切取頂芽，沿頂芽基部四周切除根部分，剝離頂芽的一層鱗片葉苞。先用流水沖洗頂芽0.5 min，然后用洗潔精水溶液浸泡頂芽2.5 min，再流水沖洗頂芽0.5 min，最后在超凈工作臺(tái)上先用75%乙醇浸泡消毒頂芽30 s后，進(jìn)行頂芽滅菌處理。

1.3 培養(yǎng)方法 初代培養(yǎng)：將滅菌好的頂芽接種入不同初代培養(yǎng)基中培養(yǎng)30～50 d。增殖培養(yǎng)：??? 將培養(yǎng)出的新芽接種入不同增殖培養(yǎng)基中30～40 d。生根培養(yǎng)：將個(gè)體形態(tài)良好、生長(zhǎng)健壯的單個(gè)芽接種入不同生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)25～30 d。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)室的溫度、相對(duì)濕度分別控制在（25±2） ℃、30%～40%，光照強(qiáng)度2 000～3 000 lx，光照時(shí)間12 h/d。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 細(xì)菌污染率（%）=細(xì)菌污染的瓶數(shù)/接種瓶的總數(shù)×100;死亡率（%）=死亡的瓶數(shù)/接種瓶的總數(shù)×100;增殖系數(shù)=新生的芽個(gè)數(shù)/接種的芽個(gè)數(shù);褐變率（%）=褐變的瓶數(shù)/接種瓶的總數(shù)×100;生根率（%）=生根的植株數(shù)/植株總數(shù)×100。采用Excel 2003和SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體滅菌? 由表1可知，不同滅菌方法對(duì)“花魔芋”頂芽滅菌效果的差異明顯：用0.20% HgCl 2滅菌魔芋頂芽，隨著滅菌時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)菌污染率逐漸降低，而死亡率卻逐漸增加。當(dāng)滅菌時(shí)間為10～15 min時(shí)，細(xì)菌污染率為16.25%～17.81%，死亡率為1.25%～6.19%，分別高于或低于滅菌時(shí)間為20～25 min時(shí)的值（ P <0.05）。綜合權(quán)衡考慮滅菌時(shí)間對(duì)“花魔芋”頂芽的細(xì)菌污染率和死亡率的影響，得出適合“花魔芋”頂芽滅菌方法為0.20% HgCl 2滅菌10～15 min。

2.2 初代培養(yǎng) “花魔芋”頂芽接種入6種處理的初代培養(yǎng)基后，培養(yǎng)的過程中僅有12.45%的頂芽保持綠色狀態(tài)，其余絕大部分都褐化，但均能誘導(dǎo)腋芽的分化。6種處理的培養(yǎng)基誘導(dǎo)頂芽分化出腋芽的量為2.33～4.00個(gè)，處理間的腋芽分化量差異不顯著 （P >0.05），各處理間的腋芽形態(tài)較好、健壯（表2）。因此，適合“花魔芋”頂芽初代培養(yǎng)的培養(yǎng)基是MS+6-BA 1.0～3.0 mg/L+NAA 0.2～0.5 mg/L。

2.3 增殖培養(yǎng)

由表3可知，不同培養(yǎng)基對(duì)“花魔芋”增殖培養(yǎng)的影響差異明顯，6種處理的培養(yǎng)基均能促進(jìn)“花魔芋”芽的增殖發(fā)生，增殖系數(shù)為2.73～4.17，且芽（芽叢）的生長(zhǎng)勢(shì)較好、健壯;在同一濃度的6-BA條件下，隨著NAA濃度的增加，“花魔芋”芽的增殖系數(shù)增大（ P <0.05）。因此，適合“花魔芋”增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0～2.0 mg/L+NAA 0.10～0.20 mg/L。

從圖1可見，“花魔芋”的芽在繼代增殖培養(yǎng)過程中，會(huì)發(fā)生褐變，隨著繼代周期的增加，褐變率呈現(xiàn)出逐漸降低直至為0的趨勢(shì)，在第1～3代，褐變現(xiàn)象嚴(yán)重，褐變率為40.38%～92.83%，第6代起，褐變率為0。

2.4 生根培養(yǎng) 由表4可知，“花魔芋”的芽接種入9種處理的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所有植株均能生根，說明“花魔芋”較易生根;各處理間的株高（3.43～3.77 cm）、生根量（4.13～5.00條）、根長(zhǎng)（2.90～3.53 cm）差異不顯著 （P >0.05）;有些處理間的根粗差異 （P <0.05），培養(yǎng)基中NAA或（和）IBA濃度高的處理對(duì)應(yīng)的根粗明顯大于濃度低的根粗;處理間根的發(fā)生情況差異明顯，隨著NAA或（和）IBA濃度的逐漸升高，植株基部由無愈傷組逐漸增加到較多的愈傷組織，當(dāng)NAA或IBA濃度為0.1～0.2 mg/L時(shí)，根從植株基部發(fā)出，根系發(fā)育良好，植株基部無愈傷組織;各處理間的植株生長(zhǎng)勢(shì)無差異，植株的生長(zhǎng)勢(shì)均較好、健壯。因此，綜合分析不同處理對(duì)“花魔芋”生根培養(yǎng)的影響，得出適合“花魔芋”生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基為1/2MS + NAA（或IBA）0.1～0.2? mg/L+活性炭0.1%。

3 結(jié)論與討論

（1）該研究篩選出了適合“花魔芋”頂芽滅菌的方法，細(xì)菌污染率較低，僅16.25%～17.81%，說明“花魔芋”頂芽較易滅菌，這與楊芩等[14]的研究結(jié)果一致。

王玲等[10]研究指出，1.0 mg/L 6-BA和NAA配合使用，當(dāng)NAA濃度為0.5～1.0 mg/L 時(shí)，“花魔芋”頂芽生長(zhǎng)點(diǎn)的愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)80%左右。謝慶華等[11]研究表明，1.0 mg/L 6-BA和NAA配合使用，NAA濃度為0.1 mg/L時(shí)，能較好地誘導(dǎo)“花魔芋”的主芽生長(zhǎng)及側(cè)芽的分化。胡悅等[12]研究發(fā)現(xiàn)，2.4 mg/L 6-BA和NAA配合使用，NAA濃度為0.1 mg/L時(shí)，能較好地誘導(dǎo)“花魔芋”頂芽的腋芽分化。在該研究中，1.0～3.0 mg/L 6-BA和NAA配合使用，當(dāng)NAA濃度為0.2～0.5? mg/L時(shí)，能很好地誘導(dǎo)“花魔芋”頂芽的腋芽分化。由此說明，在配合1.0～3.0 mg/L 6-BA使用時(shí)，NAA的濃度大小是決定“花魔芋”頂芽分化的關(guān)鍵性因子，其較高濃度（>0.5? mg/L）時(shí)分化成愈傷組織，而低濃度（<0.5? mg/L）時(shí)則分化成芽。

謝慶華等[11]研究沒有單獨(dú)涉及“花魔芋”芽的增殖培養(yǎng)。胡悅等[12]的研究中，“花魔芋”芽的增殖是使用初代培養(yǎng)基MS+6-BA 2.4 mg/L+NAA 0.1 mg/L，增殖系數(shù)為3.58。該研究基于“花魔芋”芽在增殖培養(yǎng)中的生長(zhǎng)勢(shì)，篩選出6-BA、NAA濃度范圍更寬的增殖培養(yǎng)基，增殖系數(shù)為3.47～4.17。

（2）

褐變現(xiàn)象是魔芋初代培養(yǎng)中的重要問題[13，15]。該研究表明，褐變現(xiàn)象不僅發(fā)生在“花魔芋”的初代培養(yǎng)中（褐變率占87.55%），也明顯存在于繼代增殖培養(yǎng)中，特別是第1～3代，在第6代后褐變現(xiàn)象才消失。這說明褐變現(xiàn)象在“花魔芋”組織培養(yǎng)中發(fā)生比較嚴(yán)重。同時(shí)，從其可獲得啟示，在“花魔芋”繼代增殖培養(yǎng)過程中，可通過調(diào)配激素濃度降低芽的增殖、增加繼代周期以降低褐化的技術(shù)手段，從而獲得無褐化、高質(zhì)量的芽，這對(duì)于“花魔芋”的組織培養(yǎng)工廠化育苗具有重要的指導(dǎo)意義。

（3）

魔芋苗在MS+NAA 0～0.5 mg/L生根培養(yǎng)基上都能生根，但有一定差異[15]。陳國(guó)愛[6]研究表明，“花魔芋”不定芽在1/2MS+NAA 1.0 mg/L培養(yǎng)基上的生根率為80.0%。魯紅學(xué)等[8]研究指出，“花魔芋”芽在MS+NAA 0.5 mg/L和1/2MS+NAA 0.5 mg/L上的生根率均在78%以上。郭政宏等[9]研究指出，“花魔芋”不定芽在MS+NAA 0.5 mg/L上的生根率可達(dá)94%。在上述生根培養(yǎng)的研究報(bào)道中，未涉及魔芋種苗素質(zhì)和生根特點(diǎn)。而在該研究中，9種生根培養(yǎng)基均能促使“花魔芋”芽的生根率達(dá)100%，說明“花魔芋”較易生根，這與秦廷豪等[7]的觀點(diǎn)一致。另一方面，盡管“花魔芋”生根容易，但根發(fā)生卻有較大差異，因此，基于生根培養(yǎng)中“花魔芋”的株高、生根量、根長(zhǎng)、根粗、根的發(fā)生、植株生長(zhǎng)勢(shì)6個(gè)“種苗素質(zhì)”指標(biāo)篩選出了能育出優(yōu)質(zhì)種苗適合“花魔芋”生根培養(yǎng)基。

（4）

該研究通過器官發(fā)生直接途徑再生植株的方式，研究建立了“花魔芋”組織培養(yǎng)快繁技術(shù)體系，能繁育出優(yōu)質(zhì)的“花魔芋”種苗，可以推廣應(yīng)用于“花魔芋”的工廠化育苗，同時(shí)也為其他品種的魔芋組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究提供參考。

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