桑葉中1-脫氧野尻霉素研究進展

謝克英 婁芳慧 孫瑞琳 錢志偉

關(guān)鍵詞：桑葉;1-脫氧野尻霉素;生產(chǎn)工藝;研究進展

桑樹屬于桑科植物桑屬，桑葉性寒、味甘苦，具有疏風散熱、潤肺祛燥、清肝明目的功效，古醫(yī)藥著作《神農(nóng)本草經(jīng)》稱其為神仙葉?，F(xiàn)代醫(yī)學表明，桑葉中含有豐富的營養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，桑葉作為中藥材已被國家藥典正式收錄，是衛(wèi)生部批準的藥、食兩用寶貴資源[1]?，F(xiàn)有研究報道從桑葉中提取的生物堿，尤其是多羥基生物堿1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，1-DNJ） 具有良好的降血糖、降血脂和抗氧化等作用[2]。

一、1-DNJ的來源

日本Yoshiaki等人在1976年首次從桑根皮中分離提純得到1-DNJ[3]。桑樹各個器官均含有1-DNJ，但其含量因品種、栽培區(qū)域以及樹體藥用部位不同存在差異。對桑葉來說，葉位、發(fā)育階段、采收時間和季節(jié)這些因素都對1-DNJ 含量有影響。1-DNJ 來源于植物和微生物[4]，除桑樹外，野跖草、風信子、沙參屬植物也含有1-DNJ及其類似物，但其含量均低于桑樹;微生物發(fā)酵產(chǎn)生的1-DNJ含量更低，在0.01mg/mL左右。

二、1-DNJ的藥理學功能

1-DNJ的結(jié)構(gòu)與α-1，4-葡萄糖近似，在機體內(nèi)與葡萄糖競爭酶上的催化位點。1-DNJ不僅能夠調(diào)節(jié)餐后血糖水平異常升高，亦可改善糖尿病常見并發(fā)癥。降低食物中碳水化合物分解速率，抑制餐后血糖升高，減少葡萄糖攝入的關(guān)鍵是抑制α-葡萄糖苷酶活性[5]。1-DNJ可以促進B細胞分泌胰島素，從而起到降血糖的效果。糖尿病小鼠的血糖、血甘油三酯水平在1-DNJ作用下顯著降低，提高小鼠肝臟的葡萄糖代謝酶活力和蛋白質(zhì)表達水平，從而提高動物的脂聯(lián)素水平，激活β-氧化系統(tǒng)，抑制肝臟脂質(zhì)積累。利用糖尿病小鼠開展的降糖機理研究表明，1-DNJ可以降低腸道對葡萄糖吸收，調(diào)節(jié)參與糖轉(zhuǎn)運、糖酵解及糖異生代謝過程的酶，有利于肝內(nèi)葡萄糖代謝，血糖濃度得以降低。李有貴等[6]研究表明桑葉輔助降血脂活性，桑葉總生物堿對高脂飼料造模的SD大鼠的血清總膽固醇降低達35.3%，高密度脂蛋白膽固醇提升達27.53%，降血脂活性明顯。王輝等[7]研究的20個品種桑葉浸提液均具有抗病毒活性，不同病毒的活性抑制具有一定的選擇性，推測桑葉1-DNJ為病毒抑制的主要活性成分。陳玉華[6]對1-DNJ抗腫瘤活性研究試驗表明，1-DNJ能夠抑制人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤的生長，1-DNJ能調(diào)節(jié)胰腺癌SW1990細胞的生長周期。

三、1-DNJ的提取與純化

（一） 1-DNJ的提取

關(guān)于桑葉中1-DNJ的提取，已有的報道中多是采用水提取法、有機溶劑提取法和酸提取法。1-DNJ存在于細胞內(nèi)，且溶于水。1-DNJ提取時需要先破壞細胞壁等細胞結(jié)構(gòu)，因此微波、超聲等輔助手段有利于1-DNJ的提取。

微波輔助萃取是微波萃取與傳統(tǒng)溶劑萃取相結(jié)合，通過偶極子在材料或溶劑中誘導分子運動，導致樣品升溫，利用加熱使植物細胞蒸發(fā)失去水分;蒸汽產(chǎn)生膨脹，最終使細胞破裂并釋放其活性成分的一種新的萃取技術(shù)。與傳統(tǒng)萃取技術(shù)相比，該工藝具有萃取溫度低、萃取次數(shù)少、無熱慣性（易于控制）、效率高、溶劑用量少、操作成本低、工作空間小等優(yōu)點。胡瑞君等[9]利用微波輔助萃取的方法提取桑葉中1-DNJ。此法1-DNJ的提取受微波處理時間、功率、固液比和提取次數(shù)這些因素的影響，優(yōu)化后的最佳提取工藝1-DNJ的提取率為0.024%，其中微波處理時間為1.5min，功率為406W，固液比為1∶40，提取次數(shù)為2次。

超聲輔助萃取是一種利用聲波在樣本組織附近產(chǎn)生空化氣泡，并通過空化氣泡破壞細胞壁和產(chǎn)生空穴，從而增加質(zhì)量傳遞且釋放細胞內(nèi)容物，以達到在更短的時間內(nèi)從不同基質(zhì)中提取分析物的有效方法[10]。王璐等[11]采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲細胞破碎機輔助低共熔溶劑提取桑葉1-DNJ，研究結(jié)果表明，氯化膽堿甘油和水組成低共熔溶劑提取效果最好，優(yōu)化條件后1-DNJ的提取量為1.445mg/g，其中，氯化膽堿與甘油比例為1∶3.4，含水量40%，超聲時間32min，重復3次。

超臨界流體萃取是一種廣泛應(yīng)用于食品原料、補充劑和植物藥劑等天然固體物質(zhì)提取的方法，因其具有更高的安全性、更短的提取時間和更高的選擇性而在提取生物堿等化合物上越來越受歡迎。

（二） 1-DNJ的純化

1-DNJ的純化，主要利用不同生物堿及其他次生代謝物分子量不同、吸附能力不同、鍵結(jié)合力不同，設(shè)計不同的層析柱或色譜柱進行1-DNJ的純化。大孔樹脂，特別是常用的吸附型和離子交換型，分別對應(yīng)于非特異性物理吸附和離子交換的機理，在分離和純化天然產(chǎn)物中應(yīng)用較多[12]。祝上賓等[13]利用吸附樹脂分離純化桑葉中1-DNJ，并通過亞臨界水法提取桑葉中的1-DNJ，對比了離子交換型樹脂、吸附型樹脂以及兩種樹脂聯(lián)用純化提取液中DNJ的效果。試驗結(jié)果顯示，吸附型樹脂所得1-DNJ含量較原提取液提高2.9 倍，陽離子樹脂所得1-DNJ 含量較原提取液提高3.8倍，聯(lián)合使用兩種樹脂，所得1-DNJ含量較原提取液提高11.5倍。

從工藝復雜性來看，大孔樹脂吸附法、硅膠柱層析法、高效液相色譜法的操作均十分復雜，涉及多個步驟，因此，其耗費的時間相對也比較長，處理量較大。大孔樹脂吸附法與高速逆流色譜法使用的有機溶劑繁多，有些對人體健康和環(huán)境安全影響較大，故在食品與藥物產(chǎn)品的加工方面應(yīng)慎重使用。

原有的萃取技術(shù)大多需要使用揮發(fā)性有機溶劑，容易污染環(huán)境，近年來出現(xiàn)的濁點萃取法恰好解決了這些問題。金屬螯合物、生物大分子等在分離與純化及環(huán)境樣品的前處理應(yīng)用該法均已取得良好效果。液液分離過程中改變實驗參數(shù)引發(fā)相分離，以濁點現(xiàn)象和中性表面活性劑膠束水溶液的溶解性作為分離基礎(chǔ)，疏水性物質(zhì)和親水性物質(zhì)得到分離[14]。Na Guo等[15]建立了濁點萃取富集桑葉樣品中5種目標化合物（脫氧野尻霉素、綠原酸、蘆丁、異槲皮苷和黃芪甲素） 的方法，最佳條件下，5個目標化合物優(yōu)于常規(guī)溶劑提取。

離子液體具有低毒、低揮發(fā)性、環(huán)境友好，還具有可設(shè)計等特性，離子液體應(yīng)用在固相微量萃取、含水兩相萃取、液相微量萃取、分散相液液微量萃取、液液萃取等分離技術(shù)中以及核酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、農(nóng)藥殘留、芳香族有機物、金屬離子等的萃取、檢測方面。國外已有大量報道，利用離子液體法及離子液體聯(lián)用微波、超聲波、酶、雙水相等方法提取黃酮、生物堿、多酚、萜類等天然產(chǎn)物。

四、1-DNJ的檢測

1-DNJ屬于哌啶型生物堿，這類生物堿不含苯環(huán)、雙鍵及羰基等發(fā)色團，紫外波長范圍內(nèi)光吸收低，無法用紫外檢測器檢測。除此之外，哌啶生物堿結(jié)構(gòu)中含有多個羥基，分子極性較大，光度檢測方法定性定量較困難。紫外分光光度法所用儀器相對簡單，但由于受發(fā)色基團及其他有色物質(zhì)干擾等問題存在檢測靈敏度低的缺點。楊海霞等[16]采用分光光度法測定1-DNJ含量，在線性范圍內(nèi)先建立標準曲線，獲得線性方程，獲得較為精確的定量結(jié)果。龍玲等[17]利用銅離子作為掩蔽劑，1-DNJ與二硫化碳反應(yīng)，有機溶劑萃取反應(yīng)產(chǎn)物，440nm下測量產(chǎn)物吸光度，檢測枯草芽孢桿菌變異菌株中1-DNJ 含量，探討了這一方法的準確度、精密度、靈敏度以及產(chǎn)物的穩(wěn)定性，找到了一種快速檢測細菌發(fā)酵液中1-DNJ含量的方法。

色譜方法可以分離各種生物堿及其他有機物成分，根據(jù)衍生物化學特性配以不同的檢測器對1-DNJ 進行檢測，如，液相色譜法、離子色譜法和氣相色譜法等。液相色譜一般用到柱前衍生的方法，衍生物與1-DNJ結(jié)合，形成發(fā)色團，熒光物質(zhì)比紫外檢測物質(zhì)檢測限更低。液相色譜還可以串聯(lián)質(zhì)譜，所測結(jié)果精確度更高[18]。氣相色譜法具有分析時間短的優(yōu)點，將1-DNJ衍生化成較低沸點的酯，穩(wěn)定性得到提高，適用于大批量樣品的定量分析[19]。高林森等[20]通過高效液相色譜——二極管陣列檢測器法檢測桑葉中的1-DNJ，在pH8.5 的硼酸鹽緩沖液中用芴甲氧羰酰氯為衍生劑，采用酸提取方法，衍生物在紫外區(qū)有吸收峰，265nm有最大吸收波長，流動相為乙腈和水，C18色譜柱進行分離。試驗結(jié)果證明，1-DNJ 得到分離，檢出限、線性相關(guān)系數(shù)、樣品加標回收率、相對標準偏差等結(jié)果非常理想。李名潔等[21]通過固相萃取——高效液相色譜法測定不同地域及季節(jié)桑葉中1-DNJ含量，檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器，流動相為乙腈和醋酸銨水溶液，采用等度洗脫，試驗結(jié)果證明：線性關(guān)系、平均回收率、相對標準偏差等結(jié)果好，方法簡便、準確、重現(xiàn)性好。

噴霧質(zhì)譜法可以快速、直接對樣品中成分進行半定量分析，具有簡單、高效的優(yōu)點，在快速篩選中具有良好的應(yīng)用前景。Ning Zhang等[22]采用葉面噴霧質(zhì)譜法確定了桑樹不同部位1-DNJ的相對含量，探討了1-DNJ在桑樹中的分布規(guī)律，該方法對利用桑樹生產(chǎn)功能性或藥用食品和藥物開發(fā)具有一定的指導意義和參考價值。

研究展望

桑樹是1-DNJ含量相對較高的物種之一，但對桑樹中1-DNJ的開發(fā)研究才剛起步，在提取、純化生產(chǎn)工藝研究等方面還需要深入進行。近年來，超臨界流體萃取技術(shù)和離子液體純化技術(shù)在其他藥用植物方面應(yīng)用頗為廣泛，采用這些新技術(shù)提取和純化桑葉生物堿值得研究。1-DNJ在降血糖、降血脂、抗病毒、抗腫瘤等方面具有很高的藥用價值，更多的學者開始關(guān)注桑樹的開發(fā)利用。充分發(fā)揮桑樹的藥用價值，對桑樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展和人類健康具有十分重要的意義。