10種天然產物抗茶輪斑病的生物活性

饒家瑞，雷志偉，周玉鋒

(貴州省農業(yè)科學院 茶葉研究所， 貴州 貴陽 550006)

0 引言

【研究意義】茶葉是人們喜愛的飲品，并具有一定的保健和藥用價值[1-2]。貴州種茶歷史悠久[3]，并為貴州的經濟發(fā)展做出了一定貢獻。茶葉品質是貴州茶產業(yè)發(fā)展的生命線，也是搶占國內外茶市場的核心指標。近年來，隨著茶產業(yè)的不斷發(fā)展，貴州茶樹病害加重，尤以茶輪斑病危害較重[4]，而安全綠色農藥的合理利用是防治茶樹病害和確保茶葉安全生產的重要措施[5-6]。因此，從天然產物中尋找對環(huán)境友好的抗茶輪斑病綠色農藥，對貴州茶產業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】前人對不同農作物不同病害的綠色農藥應用及合成進行了諸多研究[7-9]，姚亞麗等[7]研究顯示，中生菌素具有廣譜抑菌活性，對茶葉病害具有一定的抑制作用；YOSHIKAWA等[8]研究表明，萎銹靈對植物真菌病害有一定防治效果；WANG等[9]采用二元活性拼接法，用水楊醛和不同取代基苯丙炔構建系列化合物，并從中鑒定出化合物1a抗菌核病、蘋果樹腐爛病菌和灰葡萄孢菌的生物活性優(yōu)于對照藥物百菌清?！狙芯壳腥朦c】雖然作物生產上已應用的中生菌素、萎銹靈等高效低毒農藥比一般農藥[10-11]的用量更小，殘留更低，但隨著作物病害耐藥性的增強及其病害嚴重情況下的超量施用，已造成農藥殘留超標和環(huán)境污染問題，進而也影響貴州茶葉品質和產量的提高。目前除少數(shù)植物源天然產物農藥(如除蟲菊酯)外，多數(shù)均是對其化學結構進行修飾改性后的產物，雖具有較高的抗菌活性，但是部分農藥殘留仍是一個難題。自然界的諸多植物均具有抗菌消炎作用，從中提取的天然產物除具有殺菌作用外，還可被植物自身很好降解，同時解決農藥殘留問題。因此，從天然產物中篩選高活性農藥應用于茶葉生產意義重大。【擬解決的關鍵問題】在天然產物中，從其化學結構含有醛基[12]、酚類[13]和多羥基[14-15]基團的物質中篩選到具有較高生物抗菌活性的可能性較大。因此，選擇含有以上化學結構的10種天然產物篩選抗茶輪斑病的生物活性，并利用掃描電子顯微鏡(SEM)探尋活性最優(yōu)天然產物潛在的抗茶輪斑病活性機制，以期尋找天然產物中具有抗茶輪斑病活性的化合物，為降低茶葉農藥殘留和提高貴州茶葉品質提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 茶輪斑病菌 茶輪斑病菌是采用單孢分離法結合形態(tài)學與分子生物學鑒定方法分離鑒定所得菌株，測序結果為擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)的Pestalotiopsissydowiana病菌[16-17]，由貴州省農業(yè)科學院茶葉研究所提供。

1.1.2 藥劑 10種天然產物的名稱、結構式及來源見表1。其中，香草醛、丁香醛、愈創(chuàng)木酚和百里香酚購于上海阿拉丁試劑有限公司，吲哚購于上海九鼎化學有限公司，槲皮素、香葉木素和芹菜素購于上海麥克林有限公司，肉桂酸和L-薄荷購于上海樂研試劑有限公司。98%萎銹靈購于上海麥克林有限公司，無水乙醇購于天津市富宇精細化工有限公司，吐溫-80購于天津市大茂化學試劑廠，土豆培養(yǎng)基(PDA)購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。其他試劑均購于上海安耐吉化學試劑有限公司。通過Sarfori-us型電子天平(精度0.0010 g)完成藥品稱量。

表1 10種天然產物的名稱、結構式及來源

1.1.3 儀器 Nova NanoSEM 450掃描電子顯微鏡，超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)，電熱鼓風干燥箱(上海一恒科技有限公司)，恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)療器械廠)，高溫蒸汽滅菌鍋(上海沉匯儀器有限公司)，BHC-1300II A/B3生物潔凈安全柜，Mill-Q型超純水制備儀；20～200 μL、100～1000 μL和1～5 mL移液槍，電子天平。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 試驗共設12個處理，按天然產物相應編號分設10個處理；處理11，陽性對照(CK1)，萎銹靈農藥；處理12，空白對照(CK2)，等量二甲基亞砜(DMSO)吐溫水。3次重復，隨機排列。

1.2.2 抗茶輪斑病的生物活性初篩

1) 培養(yǎng)基的配制。稱取 800 g去皮土豆放入4.5 L清水中，熬煮后濾去土豆殘渣，加入80 g瓊脂、80 g葡萄糖、12 g磷酸二氫鉀、6.0 g硫酸鎂和40 mg維生素B1，混勻溶解后以每瓶 90 mL轉移到 250 mL錐形瓶中，封口后在 121℃條件下高壓滅菌 20 min，冷卻后得PDA培養(yǎng)基備用。馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(PDB) 參照HOU等[18]的方法配制。

2) 藥液配制。稱取各待測天然產物 10 mg分別溶解到 0.5 mL DMSO中，后轉移至含4.5 mL無菌吐溫水的15 mL離心管中，再將其加入制備好的45 mL PDA培養(yǎng)基中，混勻，得到天然產物的最終濃度為100 μg/mL。將含有各種待測天然產物的培養(yǎng)基分別平均倒入3個培養(yǎng)皿中冷卻備用。

3) 抗茶輪斑病抑制率的測定。采用菌絲生長速率法[19]測定10種天然產物對茶輪斑病的抑制率。先在提前活化好的病菌邊緣打孔制取直徑為 4.0 mm的菌餅，再用無菌接種針將菌餅接種到PDA培養(yǎng)基上，置于 28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 5 d，空白對照組菌落長到 6.0 cm左右時，采用十字交叉法用直尺測量菌落直徑，計算其抑制率。

抑制率=[(對照組凈菌落直徑-處理組凈菌落直徑)/對照組凈菌落直徑]× 100%

1.2.3 抗茶輪斑病EC50的測定 根據(jù)10種天然產物抗茶輪斑病活性的初篩結果，先將活性較好各待測天然產物配置成濃度為100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL和6.75 μg/mL的5梯度藥液，并采用菌絲生長速率法測定對應茶輪斑病菌的抑菌活性，用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑制率，并以天然產物濃度的對數(shù)為自變量(x)，相對抑制率為因變量(y)，擬合活性較好天然產物對茶輪斑病的線性回歸方程，計算各天然產物的抑制率、抑制中質量濃度(EC50)及相關系數(shù)(R)。根據(jù)EC50判斷天然產物的毒力大小，即天然產物的EC50越小，其對茶輪斑病菌的毒力越強。

1.2.4 對茶輪斑病菌細胞外壁損傷程度的觀察 用RAO等[20]稍加修改的電鏡制樣方法，采用掃描電子顯微鏡觀察篩選出的高活性天然產物作用于茶輪斑病，然后觀察病菌細胞外壁的損傷程度。

先將茶輪斑病菌接種到PDA培養(yǎng)基上，25℃暗箱培養(yǎng)7 d。用打孔器從 PDA培養(yǎng)基邊緣生長旺盛部位打孔，取菌餅接種到馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(PDB)中，25℃、180 r/min搖床暗箱培養(yǎng)7 d。取1 mL長滿菌絲的PDB培養(yǎng)基于1.5 mL離心管中離心，然后用PBS緩沖液(pH 7.2)洗滌，以獲得懸浮在PBS緩沖液中的菌絲。用200 μg/mL和500 μg/mL濃度的天然產物在DMSO中于震蕩條件下處理茶輪斑病菌絲6～8 h，用PBS沖洗菌絲3次，再用適量2.5%戊二醛在4℃固定8 h，然后依次用適量乙醇和叔丁醇處理10 min。冷凍干燥和鍍金后，樣品在Nova NanoSEM 450掃描電子顯微鏡下成像，觀察藥物作用后真菌細胞外壁的損傷程度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和DPS對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 10種天然產物對茶輪斑病菌的抑制率

由圖1看出，在100 μg/mL濃度下，茶輪斑病菌在10種天然產物藥液中均能生長。由表2可知，菌落直徑為CK2>處理6>處理8>處理10>處理7>處理1>處理9>CK1>處理2>處理5>處理3>處理4。除空白對照(CK2)外，以處理6的菌落生長最快，培養(yǎng)5 d菌落的直徑為7.0 cm；處理4最慢，為1.3 cm；菌落直徑小于陽性對照(CK1)的有處理2～處理5。10種天然產物對茶輪斑病菌的抑制率以處理4最高，為82.67%，較CK1增加48百分點；處理3其次，為65.33%，較CK1增加30.66百分點；處理5第3，為57.33%，較CK1增加22.66百分點；處理2第4，為42.67%，較CK1增加8百分點，且均極顯著高于CK1。其余6個處理的抑制率均極顯著低于CK1。說明，百里香酚、愈創(chuàng)木酚、吲哚和丁香醛4種天然產物抗茶輪斑病的活性均較好，并以百里香酚的抗菌活性最強。

表2 在100 μg/mL濃度下10種天然產物對茶輪斑病菌的抑制率

注：a為香草醛，b為丁香醛，c為愈創(chuàng)木酚，d為百里香酚，e為吲哚，f為槲皮素，g為香葉木素，h為芹菜素，i為肉桂酸，j為L-薄荷醇，CK1為陽性對照萎銹靈，CK2為空白對照。

2.2 3種活性較高天然產物對茶輪斑病的毒力強度

2.2.1 毒力回歸方程 通過擬合得到百里香酚、愈創(chuàng)木酚和吲哚3種天然產物對茶輪斑病病原菌的毒力方程 (表3)：y愈創(chuàng)木酚= 1.517 7x+ 2.335 5(R=0.981 2)，y百里香酚= 1.731 6x+2.352 8(R=0.965 0)，y吲哚= 1.934 3x+ 1.368 4(R=0.958 9)，相關系數(shù)均>0.95，表明3種天然產物藥劑濃度與抑制率間均存在良好的線性關系。

2.2.2 毒力強度 從表3可知，3種天然產物的EC50為33.79～75.42 μg/mL。其中，以百里香酚對茶輪班病的毒力強度最大，EC50為33.79 μg/mL；愈創(chuàng)木酚其次，EC50為56.97 μg/mL；吲哚第3，EC50為75.42 μg/mL。

表3 3 種天然產物對茶輪斑病病原菌的毒力回歸方程及EC50

3種天然產物的EC50用藥量依次比CK1減少197.73 μg/mL、174.55 μg/mL和156.10 μg/mL。表明，3種天然產物抗茶輪斑病的效果均較好。

2.3 百里香酚處理茶輪斑病真菌細胞外壁的損傷情況

由圖2看出，百里香酚濃度為200 μg/mL處理茶輪斑病菌，可導致其表面形態(tài)從光滑圓潤變?yōu)椴糠至验_(圖2-a)，并可見孔狀形狀 (圖2-b)；當處理濃度為500 μg/mL時，其細胞壁損壞的程度更加明顯，許多細胞破裂 (圖2-c)。表明，百里香酚引起了病菌細胞體系列生理變化，并導致其細胞受損死亡。

3 討論

茶輪斑病(Pestalotiopsistrachicarpicola)又稱為茶梢枯死病，是貴州茶樹葉部的主要病害之一[21-22]，其病原菌存在多樣性，包括山茶花擬盤多毛孢 (Pestalotiopsiscamelliae)、茶假擬盤多毛孢(Pseudopestalotiopsiscamelliae-sinensis)和新擬盤多毛孢(Neopestalotiopsisclavispora)[23-24]，該病害是致使茶葉品質和產量下降的主要原因之一。張欣等[17]探明了茶輪斑病病原菌Pestalotiopsistrachicarpicola的生物學特性，為茶輪斑病防治藥劑的篩選提供了參考。10種天然產物的化學結構中主要包含有苯環(huán)、環(huán)己烷和苯并雜環(huán)，并以苯環(huán)上連接異丙基、甲基和羥基等給電子基團的百里香酚抗茶輪斑病的生物活性最佳，EC50為33.79 μg/mL。因此，接下來的研究將以骨架結構為苯環(huán)，且取代基以供電子基為主的香芹醇和丁香酚等天然產物為目標，希望從中繼續(xù)篩選出活性更高的抗茶輪斑病天然產物，為研發(fā)結構新穎的抗茶輪斑病綠色農藥提供新的先導化合物。

4 結論

研究10種天然產物(香草醛、丁香醛、愈創(chuàng)木酚、百里香酚、吲哚、槲皮素、香葉木素、芹菜素、肉桂酸和L-薄荷)在100 μg/mL濃度下抗茶輪斑病的生物活性，結果顯示，百里香酚、愈創(chuàng)木酚和吲哚對茶輪斑病的抑制率分別為82.67%、65.33%和57.33%，比陽性對照萎銹靈(34.67%)分別增加48百分點、30.66百分點和22.66百分點，差異均達極顯著，其EC50分別為33.79 μg/mL、56.97 μg/mL和75.42 μg/mL，比陽性對照萎銹靈(231.52 μg/mL)的EC50劑量分別減少197.73 μg/mL、174.55 μg/mL和156.10 μg/mL。

通過高活性天然產物百里香酚作用于茶輪斑病后病菌細胞外壁的損傷程度觀察顯示，在200 μg/mL濃度時，百里香酚可導致茶輪班病真菌細胞壁的表面形態(tài)從光滑圓潤變?yōu)椴糠至验_；在500 μg/mL濃度時，百里香酚真菌細胞壁的受損程度明顯增加并導致其細胞死亡。因此，百里香酚可用于茶輪斑病的生物防治，其次可選擇愈創(chuàng)木酚和吲哚，也能較好地防治茶輪斑病。