結(jié)合珠蛋白基因型預(yù)測(cè)動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血患者腦血管痙攣和臨床預(yù)后可行性分析

郭江

腦血管痙攣（cerebral vasospasm,CV）是動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血（aneurysmal subarachnoid hemorrhage,aSAH）常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，是一種特殊類(lèi)型的腦動(dòng)脈收縮。目前學(xué)界將CV定義為aSAH后腦內(nèi)大動(dòng)脈出現(xiàn)的延遲性狹窄，常常伴有受累血管遠(yuǎn)端分布區(qū)灌注減少，這種持續(xù)性血管收縮會(huì)導(dǎo)致遲發(fā)型腦梗死（delayed cerebral ischemia,DCI），是aSAH預(yù)后不良的重要原因[1]。學(xué)界提出許多假設(shè)去解釋aSAH相關(guān)性CV，其中血紅蛋白（Hb）降解產(chǎn)物刺激導(dǎo)致血管痙攣的目前認(rèn)可度最高[2,3]。結(jié)合珠蛋白（haptoglobin,Hp），又稱(chēng)觸珠蛋白，是急性期綁定游離Hb的一種酸性糖蛋白，在出血或溶血性損傷后結(jié)合并中和細(xì)胞外的游離Hb，形成Hp-Hb復(fù)合物，避免Hb的病理刺激，具有極其重要的生理意義[4]。Leclerc等[5]發(fā)現(xiàn)不同基因型的Hp與CV的發(fā)生率有明顯相關(guān)性，但該研究樣本量偏小，結(jié)果可信度較低。為進(jìn)一步探索Hp基因型與CV的相關(guān)性，本研究納入部分aSAH患者進(jìn)行對(duì)比分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年1月～2015年12月在壽光市人民醫(yī)院就診的aSAH患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～65周歲，性別不限；②經(jīng)腦數(shù)字減影血管造影（DSA）、CT血管成像（CTA）或磁共振血管成像（MRA）明確aSAH臨床診斷[6]；③aSAH首次發(fā)作，且病程不超過(guò)3 d；④入院時(shí)頭顱CT未發(fā)現(xiàn)急性腦積水或直徑超過(guò)2 cm的腦內(nèi)血腫。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往腦卒中、腦外傷、癲癇、腦腫瘤、偏頭痛等神經(jīng)疾病史；②出現(xiàn)意識(shí)模糊、譫妄等神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙；③出現(xiàn)與腦血管造影相關(guān)并發(fā)癥；④合并溶血狀態(tài)、明顯的肝腎功能不全、自身免疫性疾病、惡性腫瘤、血紅蛋白＜80 mg/L等。

1.2 檢測(cè)指標(biāo)

①血漿Hp基因型測(cè)定：抗凝血離心后去除上層血漿，生理鹽水洗滌紅細(xì)胞6次后加入蒸餾水劇烈震蕩5～6 min，高速離心即可分離出Hb溶液，取Hb溶液5μL與分離出的含Hp的上層血漿混合后37℃溫育靜置10 min即可形成Hp-Hb復(fù)合物；蛋白電泳采用EPS-300穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（上海天能科技有限公司生產(chǎn)），由于在血漿中的蛋白構(gòu)型不同，Hp-Hb復(fù)合物在電泳時(shí)可形成不同的條帶，形成的復(fù)合物有氧化特性，當(dāng)遇到四甲基聯(lián)苯胺時(shí)顯示藍(lán)色條帶：Hp1-1型：遷移速度最快，緊靠陽(yáng)極側(cè)；Hp2-2型：由數(shù)條譜帶組成，遷移速度最慢；Hp2-1型：靠近陰極側(cè)呈逐漸遞減趨勢(shì)。采用序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-SSP）進(jìn)行HP基因分型檢測(cè)。②一般情況：收集3組Hp-Hb復(fù)合物基因型患者年齡、性別、既往史等人口學(xué)資料，同時(shí)記錄動(dòng)脈瘤最大直徑（mm）、格拉斯哥昏迷量表（Glasgow coma scale，GCS）評(píng)分、aSAH的Fisher分級(jí)、治療方法。③CV分級(jí)：入院3 d內(nèi)DSA術(shù)后利用工作站自帶測(cè)量軟件，分別測(cè)量大腦前動(dòng)脈、大腦中動(dòng)脈、大腦后動(dòng)脈發(fā)生CV的情況。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為4級(jí)：無(wú)CV（直徑減少0%～10%）、輕度CV（減少11%～33%）、中度CV（減少34%～66%）、重度CV（減少67%～100%）[7]。④臨床預(yù)后：記錄并且比較入院14 d 3組患者發(fā)生遲發(fā)型腦梗死和死亡的例數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 SDS-PADE電泳檢測(cè)Hp-Hb復(fù)合物基因型

241例aSAH患者血漿Hp基因型檢測(cè)顯示，通過(guò)SDS-PAGE電泳后，經(jīng)四甲基聯(lián)苯胺時(shí)顯示藍(lán)色條帶：Hp1-1型36例（14.94%），為一條光亮的條帶，靠近陽(yáng)極；Hp2-1型128例（53.11%），數(shù)條藍(lán)色條帶，向陰極條帶逐漸變暗；Hp2-2型77例（31.95%），數(shù)條藍(lán)色條帶，靠近陰極，見(jiàn)圖1。分布比例與國(guó)內(nèi)外研究基本相同[5]。

圖1 SDS-PADE電泳檢測(cè)3組Hp-Hb復(fù)合物基因型

2.2 3組Hp-Hb復(fù)合物基因型患者一般情況比較

3組患者年齡、性別、既往史、動(dòng)脈瘤最大直徑、GCS評(píng)分、Fisher分級(jí)和治療方法組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 3組Hp-Hb復(fù)合物基因型患者一般情況比較

2.3 3組Hp-Hb復(fù)合物基因型患者CV及臨床預(yù)后比較

Hp2-2組CV總數(shù)、中度和重度CV數(shù)量均高于Hp1-1組和Hp2-1組（均P＜0.05），而輕度CV組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；共74例和36例患者發(fā)生遲發(fā)型腦梗死和死亡，分割卡方檢驗(yàn)表明Hp2-2組兩者發(fā)生率均高于Hp1-1組和Hp2-1組（均P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 3組Hp-Hb復(fù)合物基因型患者CV及臨床預(yù)后比較

將Hp1-1/Hp2-1合并為一組，Hp2-2組CV總數(shù)、中度和重度CV數(shù)量同樣高于Hp1-1/Hp2-1聯(lián)合組（均P＜0.05），而輕度CV組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；遲發(fā)型腦梗死和死亡發(fā)生率組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表3。

表3 Hp1-1/Hp2-1聯(lián)合組與Hp2-2組患者CV及臨床預(yù)后比較

3 討論

aSAH后出現(xiàn)CV的危害極大，國(guó)內(nèi)外大量研究表明早期發(fā)現(xiàn)CV高?；颊卟⒂枰苑e極干預(yù)，可以減少CV的發(fā)生，減輕遠(yuǎn)期神經(jīng)功能障礙，改善臨床預(yù)后[8]。CV已知的病理機(jī)制包括炎癥機(jī)制、內(nèi)皮因子、氧合Hb、NO、蛋白激酶、通道活性改變、血管壁結(jié)構(gòu)功能改變、白細(xì)胞介素（IL）及血管周?chē)窠?jīng)的損傷等。目前對(duì)aSAH的研究側(cè)重于CV的預(yù)測(cè)和早期干預(yù)，已有的研究發(fā)現(xiàn)aSAH患者出血量為CV的重要危險(xiǎn)因素，其他因素包括患者的年齡和既往吸煙史，年輕患者和吸煙者均較易出現(xiàn)CV，同時(shí)aSAH發(fā)生次數(shù)也可能與CV相關(guān)[9]。Froehler等[4]認(rèn)為蛛網(wǎng)膜下腔的血液和紅細(xì)胞崩解產(chǎn)物——Hb是CV發(fā)生的始動(dòng)因子，可能與游離Hb直接引起血管壁炎癥反應(yīng)、血管平滑肌氧化性損傷、產(chǎn)生自由基及細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化、NO生成減少及IL的增加有關(guān)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的學(xué)者已經(jīng)開(kāi)始注意到Hp不同基因型可能與CV的發(fā)生率和嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[5,10]，但確切的聯(lián)系還有很多因素值得探討。

Hp廣泛分布于人類(lèi)和哺乳動(dòng)物的血漿及其他體液，分子結(jié)構(gòu)類(lèi)似免疫球蛋白，是由兩條β鏈和兩條α鏈組成四聚體，Hp的多態(tài)性是α鏈的遺傳變異造成而且是人類(lèi)獨(dú)有的特征。α鏈有α 1和α2二種，分別由一對(duì)等位基因Hp1和Hp2編碼，因此有三種基本基因型：Hp1-1型為Hp1/Hp1，Hp2-1型為Hp2/Hp1，Hp2-2型為Hp2/Hp2[11]，其基因多態(tài)性與感染性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、自身免疫性疾病等炎癥性疾病的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。有研究證實(shí)，不同基因型的Hp生物學(xué)功能不同，多數(shù)研究認(rèn)為Hp1-1型在結(jié)合游離Hb的功能方面是最強(qiáng)的,Hp2-1型次之，而Hp2-2型最弱，Hb與Hp一旦結(jié)合即可迅速?gòu)难褐斜磺宄?，而游離Hb一旦被氧化，就不能再與Hp結(jié)合。另一方面，分子量大的Hp2-2-Hb復(fù)合體比分子量小的Hp1-1-Hb復(fù)合體或游離Hb更不易于通過(guò)細(xì)胞膜，因此更難被單核-巨噬系統(tǒng)清除[12]。Nonaka等[13]根據(jù)該理論對(duì)SAH患者蛛網(wǎng)膜下腔注入Hp，表現(xiàn)出一定的抗CV效果。

本研究的數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，Hp2-2型患者的CV發(fā)生率、嚴(yán)重程度和臨床預(yù)后均高于Hp1-1型和Hp2-1型，與既往研究結(jié)果相近。但也有研究認(rèn)為SAH后遲發(fā)型CV只與血漿Hp水平有關(guān)，而與Hp的基因型無(wú)明顯關(guān)聯(lián)，因?yàn)槊恳粋€(gè)Hp單體可以結(jié)合一個(gè)Hb二聚體，而血漿Hp和Hb分別1 mg/mL和12 mg/mL（即Hp的水平遠(yuǎn)低于Hb，而且血漿Hp水平較高者其腦脊液中Hp也較高），蛛網(wǎng)膜下腔中Hp不足以中和Hb時(shí)，Hp可隨腦脊液不斷進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔結(jié)合Hb，因此學(xué)者認(rèn)為Hp水平在其中發(fā)揮了一定的作用[14]，Hp與CV的確切關(guān)系仍需要大量的基礎(chǔ)和臨床研究證實(shí)。

綜上所述，Hp2-2基因型是aSAH患者發(fā)生CV的高危因素，對(duì)指導(dǎo)早期治療和預(yù)測(cè)臨床預(yù)后有重要意義。