木蘭花堿對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠的治療作用及其機(jī)制*

徐志紅，陳磊垚，許立，徐德榮

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)部，南京 210014；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210046)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是炎癥性腸病 (inflammatory bowel disease，IBD) 的一種，其特點(diǎn)是腹部疼痛，并伴有帶血腹瀉、疲勞、直腸出血和體質(zhì)量下降[1]。環(huán)境因素和遺傳因素是導(dǎo)致UC的兩大要素，二者相互作用可導(dǎo)致腸道發(fā)生免疫反應(yīng)和炎癥[2]。異常激活的核因子κB (nuclear factor-κB，NF-κB)促進(jìn)促炎癥細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，呈炎癥反應(yīng)放大現(xiàn)象，決定UC的發(fā)生與發(fā)展[3]。在IBD患者中，結(jié)腸上皮細(xì)胞和黏膜巨噬細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了NF-κB活化[4]。根據(jù)NF-κB表達(dá)水平可判斷UC的嚴(yán)重程度和藥物干預(yù)效果[5]。激活Nod樣受體家族含pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3 (NOD-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3)導(dǎo)致caspase-1活化[6-7]、成熟白細(xì)胞介素(IL)-1β釋放[8]，通過激活淋巴細(xì)胞、促進(jìn)白細(xì)胞在損傷或感染部位的滲透，參與全身和局部感染反應(yīng)的產(chǎn)生[9]。據(jù)報(bào)道，NLRP3基因多態(tài)性與人類患IBD的風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)[10]。NF-κB和NLRP3軸可能是開發(fā)IBD新療法的潛在靶點(diǎn)。木蘭花堿是中草藥木蘭和馬兜鈴的主要活性成分。LI等[11]發(fā)現(xiàn)大劑量木蘭花堿具有較強(qiáng)的抗炎作用，可以抑制一氧化氮(NO)的產(chǎn)生，保護(hù)小鼠巨噬細(xì)胞免受脂多糖誘導(dǎo)的凋亡。木蘭花堿通過負(fù)調(diào)控MAPK信號(hào)通路的Braf蛋白，抑制銅綠假單胞菌PAK株誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[12]。GUO等[13]關(guān)于木蘭花堿對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的體內(nèi)外急性肺損傷的抗炎作用研究表明，木蘭花堿可劑量依賴性降低促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。但是，筆者尚未見木蘭花堿治療UC的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬考察木蘭花堿對(duì)UC模型大鼠的緩解作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料和試劑 木蘭花堿(上海梵態(tài)生物科技有限公司，含量≥98%，批號(hào)：FT10031227)，3%葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS，德國(guó)MP Biomedicals公司，批號(hào)：S3045)，IL-1β(批號(hào)：ab22957)、IL-18(批號(hào)：ab24562)、腫瘤壞死因子(TNF)-α(批號(hào)：22784)等酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，F(xiàn)ITC anti-CD11b(批號(hào)ab12452)、NLRP3(批號(hào)：ab13544)、IKKβ-1(批號(hào)：ab34631)、Iκβα(批號(hào)：ab32524)、p-IκBα(批號(hào)：ab34246)、p-IKKβ(批號(hào)：ab41744)、p-NF-κB p65(批號(hào)：abs124475) 等抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，cleaved caspase-1抗體(上海愛必信生物科技有限公司，批號(hào)：abs143596)，其他試劑和化學(xué)品均來自標(biāo)準(zhǔn)的商業(yè)公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠，6～8周，體質(zhì)量(200±20) g，購(gòu)自南通大學(xué)，合格證號(hào)：SCXK(蘇)2019-0001。自由飲用食物和水，溫度25 ℃，濕度45%。

1.3儀器 酶標(biāo)儀(美國(guó)MD公司，型號(hào)SpectraMax 190)；熒光顯微鏡(日本 Olympus公司，型號(hào)IX71)；石蠟切片機(jī)(德國(guó)Medite公司，型號(hào)M530)；高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司，型號(hào)5430R)。

1.4造模與分組 SD大鼠進(jìn)入SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、5-氨基水楊酸組(100 mg·kg-1)和木蘭花堿小、中、大劑量組(25，50，100 mg·kg-1)，每組10只，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)造模[14]。自實(shí)驗(yàn)第1天開始，正常對(duì)照組大鼠灌胃純凈水，其余5組大鼠灌胃給予相應(yīng)藥物，每天1次，連續(xù)10 d 。第11天，處死大鼠后解剖取結(jié)腸組織，一部分冷凍(-80 ℃)保存，一部分用10%甲醛溶液固定，用于后續(xù)分析。

1.5疾病活動(dòng)指數(shù)分析(disease activity index，DAI) 評(píng)估大鼠DAI，指標(biāo)包括質(zhì)量、大便性狀、便血情況。

1.6髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性分析 稱取大鼠結(jié)腸組織50 mg，冰上充分勻漿后取上清液，依據(jù)MPO試劑盒說明書中方法測(cè)定MPO活性。

1.7蘇木精-伊紅(HE)染色及病理組織學(xué)評(píng)分 大鼠結(jié)腸組織置于10%甲醛溶液固定，包埋后切片(厚度5 μm)，HE染色，顯微鏡下觀察并攝像。根據(jù)以下5個(gè)參數(shù)評(píng)分，①病變范圍：0分=0%，1分=1%～25%，2分=26%～50%，3分=51%～75%，4分=76%～100%；②病變深度：0分=無損傷，1分=黏膜上皮，2分=黏膜固有層，3分=黏膜下層，4分=肌層和漿膜層；③隱窩損傷：0分=無損傷，1分=1/3隱窩損傷，2分=2/3隱窩損傷，3分=隱窩缺失或者表面上皮完整，4分=隱窩、表面上皮兩者都缺失；④炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)：0分=無浸潤(rùn)，1分=輕微浸潤(rùn)，2分=輕度浸潤(rùn)，3分=中度浸潤(rùn)，4分=重度浸潤(rùn)；⑤纖維組織增生：0分=無增生，1分=輕微增生，2分=輕度增生，3分=中度增生，4分=重度增生。

1.8ELISA法檢測(cè)炎癥因子含量 結(jié)腸組織中炎癥細(xì)胞因子(IL-1β、IL-18和TNF-α)根據(jù)相應(yīng)ELISA試劑盒的操作步驟進(jìn)行定量分析。

1.9Western blotting分析蛋白表達(dá) 提取組織蛋白后，采用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒定量分析，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophore-sis，SDS-PAGE)凝膠分離，轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉1.5 h。分別加入一抗稀釋液：IκBα、p-IκBα、p-IKKβ、p-NF-κB p65、NLRP3、IKKβ、cleaved caspase-1，4 ℃，過夜。TBST洗膜后加入二抗，孵育1 h。TBST洗膜后加入化學(xué)發(fā)光試劑，用電化學(xué)發(fā)光法監(jiān)測(cè)蛋白表達(dá)，Image J軟件分析灰度值。

1.10免疫組化分析 被石蠟包埋的結(jié)腸組織切片(厚度5 μm)，脫蠟，修復(fù)抗原，雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化物酶，5%牛血清蛋白(albumin from bovine serum，BSA)封閉后滴加1：200稀釋的一抗(p-NF-κB p65、NLRP3、cleaved caspase-1)，4 ℃過夜后，加二抗后滴加現(xiàn)配的二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB )顯色液，然后用蘇木精染核，封片，顯微鏡下觀察后攝像。

1.11免疫熒光分析 被石蠟包埋的組織切片后，依次進(jìn)行脫蠟、水化、修復(fù)、1%磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌、10%山羊血清封閉等操作后，滴加提前稀釋的直標(biāo)的熒光抗體(CD11b-FITC)，避光4 ℃孵育過夜。PBS洗滌后滴加4’，6-二脒基-2-苯基吲哚染液，避光孵育0.5 h。PBS洗滌后加防熒光猝滅劑，最后用鑷子夾取蓋玻片封片。熒光顯微鏡觀察，分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1木蘭花堿對(duì)DSS誘導(dǎo)UC大鼠一般狀態(tài)、DAI評(píng)分和MPO活性的影響 正常對(duì)照組大鼠毛發(fā)光澤鮮亮，活潑好動(dòng)，正常飲食和排便；模型對(duì)照組大鼠飲用DSS溶液第2天，毛發(fā)色澤暗淡，活動(dòng)減少，體質(zhì)量減輕，稀便，上述癥狀隨著時(shí)間延長(zhǎng)加重，并出現(xiàn)便血；用5-氨基水楊酸和木蘭花堿干預(yù)后，可不同程度改善上述病癥。治療結(jié)束后，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組DAI評(píng)分顯著提高(P<0.01)；木蘭花堿中、大劑量組DAI評(píng)分明顯低于模型對(duì)照組(P<0.01)，其中大劑量組DAI評(píng)分最低；木蘭花堿小劑量組DAI評(píng)分顯著高于5-氨基水楊酸組(P<0.05)，但是木蘭花堿中、大劑量組DAI評(píng)分與5-氨基水楊酸組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型對(duì)照組MPO含量較正常對(duì)照組增加(P<0.01)；木蘭花堿中、大劑量組可逆轉(zhuǎn)模型對(duì)照組中MPO值升高(P<0.01)，其中木蘭花堿大劑量組MPO值最低；木蘭花堿小、中劑量組MPO值顯著高于5-氨基水楊酸組(P<0.05，P<0.01)，木蘭花堿大劑量組MPO值與5-氨基水楊酸組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 6組大鼠DAI、MPO比較

2.2結(jié)腸組織病理形態(tài)的改變 正常對(duì)照組中大鼠結(jié)腸上皮結(jié)構(gòu)完整清晰，固有層炎癥細(xì)胞數(shù)量不變，黏膜腺體整齊完好，黏膜下層、肌層、漿膜層無病變特征。模型對(duì)照組大鼠可見杯狀細(xì)胞丟失，黏膜層和黏膜下層炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重，隱窩結(jié)構(gòu)損壞；DSS引起大鼠的病理組織學(xué)評(píng)分顯著提高(P<0.01)。木蘭花堿小、中、大劑量及5-氨基水楊酸均可以減輕結(jié)腸組織損傷，顯著改善結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)(圖1)。5-氨基水楊酸組和木蘭花堿各劑量組大鼠病理組織學(xué)評(píng)分較模型對(duì)照組顯著降低(P<0.05或P<0.01)；木蘭花堿3個(gè)劑量組中大劑量組的病理組織學(xué)評(píng)分最低；木蘭花堿各劑量組病理組織學(xué)評(píng)分高于5-氨基水楊酸組，其中小、中劑量組與5-氨基水楊酸組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.5-氨基水楊酸組；D.木蘭花堿小劑量組；E.木蘭花堿中劑量組；F.木蘭花堿大劑量組。①與正常對(duì)照組比較，P< 0.01；②與模型對(duì)照組比較，P<0.01；③與模型對(duì)照組比較，P<0.05；④與5-氨基水楊酸組比較，P<0.01(F=103.500)。

2.3木蘭花堿調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥因子的表達(dá) IL-1β、IL-18和TNF-α等 3個(gè)促炎癥細(xì)胞因子含量在UC大鼠結(jié)腸組織中明顯增加。與模型對(duì)照組比較，5-氨基水楊酸組大鼠結(jié)腸組織中上述 3個(gè)促炎癥細(xì)胞因子含量降低(P<0.05或P<0.01)，且木蘭花堿各劑量組大鼠炎癥因子含量不同程度降低(P<0.05或P<0.01)；與5-氨基水楊酸組比較，木蘭花堿小劑量組IL-1β和 3個(gè)不同劑量組IL-18、小劑量組TNF-α均顯著增加(均P<0.05)；木蘭花堿 3個(gè)不同劑量組中，大劑量組IL-1β、IL-18、TNF-α的含量最低(圖2)。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.5-氨基水楊酸組；D.木蘭花堿小劑量組；E.木蘭花堿中劑量組；F.木蘭花堿大劑量組。①與正常對(duì)照組比較，P< 0.01；②與模型對(duì)照組比較，P<0.01；③與5-氨基水楊酸組比較，P<0.05；④與模型對(duì)照組比較，P<0.05(F=34.822～55.787)。

2.4結(jié)腸組織中CD11b+巨噬細(xì)胞數(shù)量 因圖1，2提示木蘭花堿大劑量對(duì)UC的療效較好，故免疫熒光法檢測(cè)中以木蘭花堿大劑量組為代表。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組大鼠比較，模型對(duì)照組大鼠結(jié)腸組織中CD11b+巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增加。與模型對(duì)照組比較，木蘭花堿大劑量組大鼠結(jié)腸組織中CD11b+巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯減少(圖3)。

圖3 3組大鼠結(jié)腸組織中CD11b+巨噬細(xì)胞免疫熒光分析(×200)

2.5木蘭花堿抑制NF-κB激活 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組細(xì)胞核中p-NF-κB p65、p-IκBα、p-IKKβ蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.01)，而細(xì)胞質(zhì)中p-NF-κB p65蛋白表達(dá)降低(P<0.01)，IκBα、IKKβ兩個(gè)蛋白水平基本沒有變化。木蘭花堿各劑量組結(jié)腸組織中p-IκBα、p-IKKβ和細(xì)胞核p-NF-κB p65蛋白表達(dá)較模型對(duì)照組降低(P<0.05或P<0.01)，細(xì)胞質(zhì)p-NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05或P<0.01)，IκBα、IKKβ蛋白水平亦無明顯變化。木蘭花堿各劑量組中，細(xì)胞質(zhì)p-NF-κB p65蛋白在木蘭花堿大劑量組中表達(dá)最高，細(xì)胞核p-NF-κB p65蛋白在木蘭花堿中劑量組中表達(dá)最低，p-IκBα蛋白在木蘭花堿大劑量組中表達(dá)最低，而p-IKKβ蛋白在木蘭花堿 3個(gè)劑量組中表達(dá)基本一致，見圖4。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.木蘭花堿小劑量組； D.木蘭花堿中劑量組； E.木蘭花堿大劑量組。①與正常對(duì)照組比較，P< 0.01；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05；③與模型對(duì)照組比較，P<0.01( F=42.544～75.734)。

2.6木蘭花堿抑制NLRP3炎性小體活性 由免疫組化結(jié)果可知，模型對(duì)照組NLRP3蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組增加(圖5)。Western blotting法分析結(jié)果亦表明，DSS能夠提高大鼠結(jié)腸組織中NLRP3、cleaved caspase-1和ASC蛋白表達(dá)水平(P<0.01)。但是，木蘭花堿中、大劑量組大鼠結(jié)腸組織中NLRP3和cleaved caspase-1蛋白表達(dá)水平降低(P<0.01)，其中大劑量組中NLRP3蛋白含量最低，中劑量組與大劑量組中cleaved caspase-1蛋白含量基本一致；木蘭花堿小、中、大劑量組大鼠ASC蛋白表達(dá)水平降低(P<0.01)，其中大劑量組最低(圖6)。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.木蘭花堿小劑量組； D.木蘭花堿中劑量組； E.木蘭花堿大劑量組。

A.正常對(duì)照組；B.模型對(duì)照組；C.木蘭花堿小劑量組； D.木蘭花堿中劑量組； E.木蘭花堿大劑量組。①與正常對(duì)照組比較，P< 0.01；②與模型對(duì)照組比較，P<0.01(F=34.132～74.964)。

3 討論

目前，治療UC的傳統(tǒng)藥物有氨基水楊酸類、糖皮質(zhì)激素類和免疫抑制劑類等三大類，本研究選擇5-氨基水楊酸為陽性對(duì)照藥。結(jié)果顯示，5-氨基水楊酸組和木蘭花堿小、中、大劑量組UC模型大鼠的病理特征均明顯改善，其中，木蘭花堿小、中劑量組病理組織學(xué)評(píng)分顯著大于5-氨基水楊酸組，而大劑量組與5-氨基水楊酸組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究表明，IBD患者體內(nèi)TNF-α、IL-1β和IL-18等促炎細(xì)胞因子水平較健康受試者升高[6]。TNF-α已被證明通過誘導(dǎo)血管通透和血管生成、增加巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子、引起屏障破壞和促進(jìn)腸上皮細(xì)胞死亡，發(fā)揮多種促炎功能[15]。抑制TNF是目前常用的治療IBD的方法[16]。IL-1β和IL-18是結(jié)腸炎早期炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)是必不可少的[17]。IBD患者的血清和黏膜活檢中IL-1β和IL-18表達(dá)水平升高[18]。本研究中，木蘭花堿可顯著抑制DSS誘導(dǎo)的UC大鼠結(jié)腸組織中IL-1β、IL-18和TNF-α含量。這可能與局部炎癥反應(yīng)的分子變化有關(guān)。先天免疫系統(tǒng)參與了DSS誘導(dǎo)的腸道炎癥，這一觀點(diǎn)已被廣泛接受[19]。木蘭花堿小劑量組IL-1β、TNF-α與小、中、大劑量組IL-18顯著高于5-氨基水楊酸組，但是中、大劑量組IL-1β、TNF-α與5-氨基水楊酸組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示5-氨基水楊酸和木蘭花堿對(duì)UC均有療效，但是5-氨基水楊酸優(yōu)于木蘭花堿，這可能與治療周期、給藥途徑、給藥劑量等因素有關(guān)，尚待進(jìn)一步研究。IBD患者體內(nèi)巨噬細(xì)胞的數(shù)量較健康受試者顯著增加[20]。而且，巨噬細(xì)胞在UC模型中比例亦增加[21]。本研究顯示，木蘭花堿可降低DSS誘導(dǎo)的模型對(duì)照組大鼠結(jié)腸組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。

在應(yīng)對(duì)炎癥因子、脂多糖或氧化劑等刺激時(shí)，IκBα被快速降解和磷酸化，激活NF-κB二聚體的釋放和易位進(jìn)入細(xì)胞核，從而上調(diào)靶基因的轉(zhuǎn)錄[22-23]。與正常對(duì)照組比較，UC大鼠結(jié)腸組織細(xì)胞核p-NF-κB p65、p-IκBα、p-IKKβ蛋白含量明顯增加，細(xì)胞質(zhì)中p-NF-κB p65蛋白表達(dá)下降，說明NF-κB被DSS激活。木蘭花堿治療后，細(xì)胞核p-NF-κB p65、p-IκBα、p-IKKβ蛋白含量下降，與DU等[24]研究羧胺三唑治療UC的結(jié)果一致。以上結(jié)果表明，木蘭花堿治療UC可能與抑制NF-κB活性有關(guān)。

NLRP3炎性小體主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，與UC密切相關(guān)[25]。在急性UC的誘導(dǎo)過程中，NLRP3炎性小體被活化，巨噬細(xì)胞中產(chǎn)生更多的IL-1β[26]。BAUER等[27]證實(shí)小鼠NLRP3缺陷可抵抗DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。此外，F(xiàn)ILARDY等[28]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后NLRP3失去控制與結(jié)腸炎癥有關(guān)。本研究顯示，UC模型對(duì)照組大鼠的結(jié)腸組織中NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組升高，而木蘭花堿可逆轉(zhuǎn)上述蛋白含量的升高。說明木蘭花堿可通過抑制NLRP3炎性小體活性發(fā)揮治療UC作用。

綜上所述，木蘭花堿可減輕DSS誘導(dǎo)的UC的嚴(yán)重程度，降低炎癥細(xì)胞因子含量，抑制NF-κB信號(hào)通路和NLRP3炎性小體活性。提示木蘭花堿可能作為一種治療UC的候選藥物。