李飛 安妮妮 彭金普 陳輝 范霞
(貴州省人民醫(yī)院小兒外科,貴州 貴陽(yáng) 550002)
尿道下裂(hypospadias)是兒童最常見(jiàn)的先天性泌尿生殖畸形之一,發(fā)病率為1/200~1/300,且呈逐年上升的趨勢(shì)[1]。尿道下裂是一種尿道開(kāi)口位置異常的男性先天畸形,尿道口分布在正常尿道口至?xí)幉康倪B線上,多數(shù)病人伴有陰莖彎曲,患兒不能站立排尿,對(duì)成年后的性功能及生育能力有顯著影響,嚴(yán)重危害患兒的身心健康,給家庭和社會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重影響[2]。迄今為止,手術(shù)矯形仍是治療本病的唯一措施,然而,300多種術(shù)式無(wú)一例外均伴有明顯的術(shù)后并發(fā)癥,如尿瘺,尿道狹窄,手術(shù)瘢痕等,最終造成“尿道下裂殘廢”[3]。因此,深入研究尿道下裂的發(fā)生機(jī)制并尋求其防治手段是重要的研究方向。尿道下裂的發(fā)生原因多且復(fù)雜,就目前而言,能明確病因的病例不足5%[4]。其中,遺傳因素、內(nèi)分泌因素和環(huán)境因素與之密切相關(guān)[5]。非那雄胺,是一種四氮雜甾體化合物,可抑制睪酮轉(zhuǎn)化成雙氫睪酮,對(duì)雄激素受體沒(méi)有親和力,更為重要的是,它不影響其他的激素的水平,如促卵泡素,促黃體激素、皮質(zhì)激素、雌二醇、催乳素和甲狀腺素等[5],能更好的模擬尿道下裂的發(fā)生。因此,在本研究中,我們首次采用非那雄胺構(gòu)建尿道下裂的SD雄鼠模型,探索尿道下裂的發(fā)生機(jī)制。報(bào)告如下。
1.1實(shí)驗(yàn)材料 SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠,約6周齡,體重150g左右,購(gòu)于南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)SCXK(蘇)2014-0001),動(dòng)物飼養(yǎng)房間的室溫22~25℃,濕度50%左右,晝夜周期為12/12 h,自由飲食和攝水。
1.2實(shí)驗(yàn)方法 (1)非那雄胺暴露動(dòng)物模型構(gòu)建:SD大鼠正常飼養(yǎng)至其成年,體重250g左右,將其按雄雌比例1:1于下午4點(diǎn)合籠,次日上午10點(diǎn)檢查雌鼠有無(wú)陰栓,有陰栓者計(jì)為妊娠第0.5天(GD0.5)。將孕鼠隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組、非那雄胺低劑量組(10 mg/kg.bw)、非那雄胺中劑量組(50 mg/kg.bw)和非那雄胺高劑量組(100 mg/kg.bw)。每組12只,于GD8~GD16每天上午8點(diǎn)灌胃。非那雄胺溶于生理鹽水中。其中10只孕鼠于GD18上午8點(diǎn)剖腹取出胎鼠,2只孕鼠自然分娩,待子代雄鼠生長(zhǎng)至30 d觀察陰莖外觀。(2)觀察胎鼠尿道下裂畸形:正常雄性SD大鼠尿道開(kāi)口于陰莖頂端,包皮完整。尿道開(kāi)口于陰莖與會(huì)陰的交接處或陰莖體腹側(cè),伴有包皮分裂為判定尿道下裂雄性大鼠的標(biāo)準(zhǔn)。(3)陰莖組織病理學(xué)觀察:陰莖組織置于4%多聚甲醛中固定48 h左右,隨后脫水、包埋。組織包埋機(jī)沿著陰莖橫切面進(jìn)行石蠟包埋后切片,厚度為4 μm,放入60oC烤箱中過(guò)夜。石蠟切片經(jīng)脫蠟、復(fù)水后,浸泡于蘇木素染液中約2 min,采用1%酸乙醇分化3 s,隨后用自來(lái)水沖洗2 min以復(fù)藍(lán)。飽和碳酸鋰溶液中5 s,自來(lái)水沖洗1 min。置于伊紅染液中5 s,自來(lái)水沖洗3 min。隨后切片依次放入50%、70%、85%、95%、100%、100%酒精、二甲苯、二甲苯各2 min,中性樹(shù)脂封片。待其充分晾干后,在光學(xué)顯微鏡下觀察陰莖的組織病理學(xué)改變。(4)尿道板成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng):SD孕鼠于GD18斷頸處死,剖腹取出胎鼠,在解剖顯微鏡下觀察性腺,以找到睪丸為準(zhǔn)選出雄性胎鼠。無(wú)菌條件下取出胎鼠尿道組織,轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái),用含青鏈霉素的PBS沖洗組織5遍。刮去尿道周圍的組織內(nèi)膜,用眼科剪將組織塊剪成2 mm×2 mm 大小。將組織塊貼到培養(yǎng)瓶中,置于37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。待其完全貼壁后,加入5 mL含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),每3 d換液。待細(xì)胞長(zhǎng)滿至85%時(shí),移去組織塊,用PBS清洗兩次,隨后用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞2 min,傳代。(5)尿道板成纖維細(xì)胞的鑒定:4%多聚甲醛固定細(xì)胞爬片15 min, 0.5% Triton X-100(PBS配制)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行穿孔,室溫放置15 min。5% BSA室溫封閉1 h;加入vimentin抗體(ABCAM,ab11256),4℃過(guò)夜。PBS清洗3次,10 min/次。室溫孵育熒光二抗1 h(Roche,11684817910)。DAPI孵育30 min,隨后用PBS清洗3次,10 min/次。用蒸餾水洗去殘留的PBS,抗熒光淬滅劑封片,熒光顯微鏡采集圖像。(6)CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖:將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的成纖維細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化,細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)消化后的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),將細(xì)胞接種于含有96孔板中,2×104個(gè)細(xì)胞/孔/100 μL培養(yǎng)基。待細(xì)胞長(zhǎng)滿約80%時(shí),更換無(wú)血清培養(yǎng)液,繼續(xù)孵育24 h使細(xì)胞同步化。按照實(shí)驗(yàn)分組,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。每孔加入10 μL CCK8溶液,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h。酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度,450 nm,記錄吸光度值。計(jì)算細(xì)胞增殖程度:細(xì)胞活力(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)] ×100 。(7)檢測(cè)細(xì)胞凋亡:Western blot檢測(cè)尿道板成纖維細(xì)胞中凋亡蛋白caspase 3和p53的蛋白表達(dá)情況,采用Image J軟件測(cè)定顯色條帶灰度值,目的蛋白/ GAPDH,從而得到目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。將陰莖組織進(jìn)行石蠟切片后,利用免疫組化檢測(cè)凋亡蛋caspase 3和p53的蛋白表達(dá)。將細(xì)胞爬片用4%多聚甲醛固定15 min, 0.5% Triton X-100(PBS配制)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行穿孔,室溫放置15 min。5% BSA室溫封閉1 h;加入caspase 3(ABCAM,ab13847)和p53抗體(ABCAM,ab32389),室溫過(guò)夜。PBS清洗3次,10 min/次。室溫孵育二抗1 h(Roche,11684817910)。DAB顯色后封片,待其充分晾干后,光學(xué)顯微鏡下觀察。
2.1非那雄胺成功誘導(dǎo)雄性胎鼠發(fā)生尿道下裂 非那雄胺暴露后導(dǎo)致胎鼠出現(xiàn)典型的尿道下裂表現(xiàn),尿道開(kāi)口異常,于陰莖根部開(kāi)口,且包皮出現(xiàn)分裂,龜頭和部分尿道外露。在正常對(duì)照組中,雄性胎鼠無(wú)尿道下裂發(fā)生。各組發(fā)生率見(jiàn)表1,隨著暴露濃度的增加,尿道發(fā)生率亦明顯升高,但中劑量和高劑量組之間并無(wú)明顯差異。
表1 非那雄胺誘導(dǎo)尿道下裂發(fā)生
2.2陰莖的組織病理學(xué)改變 將橫向包埋好的陰莖組織進(jìn)行連續(xù)切片,隨后進(jìn)行HE染色觀察陰莖的組織病理學(xué)變化。HE染色結(jié)果顯示,正常尿道海綿體血竇大小相對(duì)均一,白膜與皮膚之間的組織層次多而疏松。與正常組相比,大鼠陰莖與正常組相比,均表現(xiàn)為發(fā)育不良。其中以10 mg/kg.bw 非那雄胺組最為嚴(yán)重,分叉尿道海綿體異位嚴(yán)重,表現(xiàn)為大小極不一致的血竇之間夾雜著一些纖維結(jié)締組織,無(wú)明顯白膜結(jié)構(gòu),且與皮膚間隔的組織較薄而相對(duì)致密(圖1)。因此,在后續(xù)的研究中,我們選擇10 mg.kg.bw的濃度進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。
注:A:正常對(duì)照組;B:10 mg/kg非那雄胺組;C:50 mg/kg非那雄胺組;D:100 mg/kg非那雄胺組;圖1 陰莖的組織病理學(xué)改變
2.3尿道板成纖維細(xì)胞的鑒定 由于成纖維細(xì)胞特異性的表達(dá)Vimentin,因此,我們應(yīng)用免疫熒光檢測(cè)原代培養(yǎng)細(xì)胞Vimentin的表達(dá)以確定其為成纖維細(xì)胞。90%以上的細(xì)胞均表達(dá)Vimentin(紅色熒光),證明我們分離出的原代細(xì)胞為成纖維細(xì)胞,且純度可用于后續(xù)研究。
2.4尿道板成纖維細(xì)胞的增殖活力 隨后,我們檢測(cè)了非那雄胺暴露后成纖維細(xì)胞的活力變化。與正常對(duì)照組相比,非那雄胺組的成纖維細(xì)胞增殖明顯增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給予p38或ERK抑制劑處理后,成纖維細(xì)胞增殖活力明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與對(duì)照組無(wú)明顯差別(圖2)。
注:*與正常對(duì)照組相比,P<0.05;#與非那雄胺組相比,P<0.05。圖2 尿道板成纖維細(xì)胞的增殖活力
2.5尿道板成纖維細(xì)胞的凋亡增加 Caspase-3是一種蛋白酶,是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶。p53是一種腫瘤抑制基因,控制細(xì)胞周期的啟動(dòng)。二者均促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。因此,我們檢測(cè)這兩個(gè)基因在成纖維細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平。免疫組化結(jié)果顯示,p53和caspase-3在兩組中均有表達(dá),且定位于細(xì)胞核,但趨勢(shì)不是很明顯(圖3)。這可能是由于免疫組化更趨向于檢測(cè)目的蛋白的定位而非定量,因此,我們隨后采用Western blot檢測(cè)這兩個(gè)基因的蛋白表達(dá)水平。Western blot結(jié)果顯示(圖4), Caspase-3和p53表達(dá)模式是一致的,二者在非那雄胺組中的蛋白水平顯著低于正常對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),p38抑制劑組和ERK抑制劑組中Caspase-3和P53的蛋白水平高于非那雄胺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但與正常對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
注:*與正常對(duì)照組相比,P<0.05;#與非那雄胺組相比,P<0.05。圖4 Caspase-3和p53在尿道板成纖維細(xì)胞中的免疫組化結(jié)果
尿道下裂是除隱睪外小兒最常見(jiàn)的泌尿先天畸形,且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì),引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注,主要表現(xiàn)為尿道口開(kāi)口異位,陰莖下彎和包皮分布異常[6]。在我國(guó),城市的發(fā)病率明顯高于農(nóng)村[7]。因此,對(duì)尿道下裂發(fā)生機(jī)制的研究有助于臨床治療和預(yù)防該疾病。
由于GD14~GD21是尿道發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期[8],因此,我們?cè)贕D8~GD16每天連續(xù)給予梯度劑量的非那雄胺,干擾胎鼠陰莖及尿道的發(fā)育,構(gòu)建尿道下裂的SD雄鼠模型。結(jié)果顯示,雖然3種非那雄胺暴露劑量均不會(huì)影響性別分化和雄性胎鼠的體重,但10 mg/kg非那雄胺即可成功導(dǎo)致雄性胎鼠發(fā)生尿道下裂,HE染色顯示,大鼠陰莖發(fā)育不良。其中以10 mg/kg非那雄胺組最為嚴(yán)重,因此,我們認(rèn)為10 mg/kg為構(gòu)建尿道下裂SD大鼠的最佳劑量,非那雄胺可作為構(gòu)建尿道下裂動(dòng)物模型的優(yōu)選藥物。尿道形成的關(guān)鍵步驟是尿道板兩側(cè)隆起向腹側(cè)卷曲并在中線融合形成尿道縫,當(dāng)融合過(guò)程受阻將導(dǎo)致尿道形成障礙。有學(xué)者證實(shí),尿道縫形成包括3種機(jī)制:細(xì)胞凋亡[9]、細(xì)胞遷移[10]和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[11]。其中,細(xì)胞凋亡是一種基本生物學(xué)現(xiàn)象,可去除不需要的或異常的細(xì)胞,在生物體的進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及多個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要的作用。細(xì)胞凋亡與胚胎發(fā)生和發(fā)展等密切相關(guān),在管狀器官的隆起融合及腔化中更是起著關(guān)鍵作用[12]。尿道發(fā)育依賴于尿道襞和尿道板上皮腔化在中縫吻合,凋亡減少將導(dǎo)致尿道板腔化受阻、上皮殘留、阻礙間質(zhì)吻合進(jìn)而影響尿道縫形成[13]。當(dāng)Hoxa13或BMPr1a基因發(fā)生變異時(shí),尿道下裂小鼠陰莖中發(fā)生凋亡的細(xì)胞數(shù)量顯著減少[14-15]。DEHP誘導(dǎo)的尿道下裂小鼠陰莖中,細(xì)胞的凋亡也是明顯減少的[16]。值得注意的是,這些研究均是以陰莖細(xì)胞或生殖結(jié)節(jié)成纖維細(xì)胞為對(duì)象。由于尿道板是陰莖及尿道發(fā)育的分子信號(hào)中心,對(duì)尿道下裂發(fā)病機(jī)制的深入研究必須建立在正常尿道發(fā)育機(jī)理的基礎(chǔ)之上,因此,在本研究中,我們選擇尿道板成纖維細(xì)胞作為研究對(duì)象。在本研究中,我們亦發(fā)現(xiàn)在尿道下裂的發(fā)生過(guò)程中,尿道板成纖維細(xì)胞凋亡減少,且其增殖能力有所提升,這是以往研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的。因此,我們推測(cè)在正常尿道發(fā)育過(guò)程中,尿道板成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡必須處于一種平衡的狀態(tài),若凋亡和增殖狀態(tài)失衡,尿道板則不能融合形成尿道縫,進(jìn)而導(dǎo)致尿道下裂的發(fā)生。
綜上所述,本研究首次應(yīng)用非那雄胺成功構(gòu)建出尿道下裂的SD大鼠模型,使用劑量顯著小于DBP和DEHP等環(huán)境內(nèi)分泌干擾物,具有明顯的優(yōu)勢(shì),可作為建立尿道下裂動(dòng)物模型的優(yōu)選藥物。尿道板成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡的異常是導(dǎo)致尿道下裂組發(fā)生的關(guān)鍵原因。