依立雄胺對(duì)雄激素非依賴(lài)前列腺癌細(xì)胞DU-145的作用

李 濤，李玉華，李潤(rùn)生，桂亞平，卞崔冬，黃盛松，吳登龍

1上海市同濟(jì)醫(yī)院泌尿外科 200065;2上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所

介紹前列腺癌是威脅男性健康主要疾病之一，美國(guó)2011年前列腺癌在男性新發(fā)腫瘤中排名第一位;死亡率，但近年來(lái)由于經(jīng)濟(jì)水平的提高和生活方式的改變以及男性平均壽命的延長(zhǎng)，前列腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)不斷上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響了男性的健康［2］，目前正在探討有效的藥物治療的方法。5α-還原酶抑制劑-非那雄胺(finasteride)已有報(bào)道對(duì)前列腺癌細(xì)胞有較好的抑制作用，另一種新型的5α-還原酶抑制劑-依立雄胺(epristeride)已在我國(guó)應(yīng)用在前列腺增生的治療，經(jīng)過(guò)臨床和基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)其療效快于非那雄胺，但其對(duì)前列腺癌是否有治療和預(yù)防作用目前還缺乏實(shí)驗(yàn)和臨床的資料，本研究主要探討依立雄胺是否可以在體外影響雄激素非依賴(lài)型前列腺癌細(xì)胞株DU-145的增殖和凋亡，為依立雄胺應(yīng)用在前列腺癌的預(yù)防和治療中打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 依立雄胺溶液的制備和保存

依立雄胺由中科院藥物研究所提供，純度為99.9%的白色粉末狀物質(zhì)，將依立雄胺粉末溶解在無(wú)水乙醇中，配成20 mmol·L-1儲(chǔ)備液后方在-20℃的冰箱中保存?zhèn)溆?，?shí)驗(yàn)是用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成所需要的濃度。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

激素非依賴(lài)型前列腺癌細(xì)胞株DU-145購(gòu)于中科院細(xì)胞所。將細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%進(jìn)口胎牛血清，青、鏈霉素的 DMEM(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)細(xì)胞培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)，用0.25%的胰酶進(jìn)行消化和傳代。

1.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

DU-145 細(xì)胞經(jīng)過(guò) 2.5，5，10，20 和 40μM 依立雄胺作用3天后，用普通倒置顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察。

1.4 黃酰羅丹明B法(SRB法)測(cè)定DU-145細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)

DU-145細(xì)胞以每孔5X104接種于24孔板中，于CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，分別加入含有2.5，5，10，20 和 40μM 依立雄胺的 DMEM培養(yǎng)液，對(duì)照組用含0.5% 的無(wú)水乙醇 DMEM 培養(yǎng)液，從換液次日起，每天每個(gè)劑量組取3個(gè)平行孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞計(jì)數(shù)求均值，連續(xù)7 d。參照SKehan的方法，細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，取出培養(yǎng)板，不除去培養(yǎng)液，每孔加入50%(質(zhì)量/體積)的三氯乙酸(ACT)50 μL固定細(xì)胞。ACT的終濃度為10%，輕輕地加在每孔液面上，靜置5 min后4℃冰箱中放置1h，培養(yǎng)板各孔用去離子水沖洗沉淀5遍，以去除ACT。甩干，空氣干燥至無(wú)濕跡。每孔加0.4%(質(zhì)量/體積)的SRB100 μL，室溫放置10 min，棄去各孔內(nèi)液體后用1%乙酸沖洗5遍，去除未結(jié)合的染料，空氣中干燥后用pH為10.5，10 mmol/L unbuffered Tris base(三羥甲基胺基甲烷)150 μL溶解萃取，在平板振蕩器上振蕩10 min，在LP400酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度A 值，檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm，540 nm，564 nm，630 nm，每波長(zhǎng)測(cè)一A值，再加用參考波長(zhǎng)630 nm再測(cè)其A值。A值=細(xì)胞孔A值-無(wú)細(xì)胞對(duì)照孔A值。取3復(fù)孔讀數(shù)均值。

1.5 流式細(xì)胞儀測(cè)定依立雄胺對(duì)DU-145細(xì)胞的周期阻滯

將DU-145細(xì)胞接種于50 mL培養(yǎng)瓶中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，分別加入含有不同濃度依立雄胺的DMEM培養(yǎng)液，對(duì)照組用含0.5% 的無(wú)水乙醇DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)72 h后，用胰酶消化，PBS漂洗，調(diào)整細(xì)胞密度為1×109L-1，用70% 預(yù)冷乙醇吹打均勻，4℃固定12 h以上。PBS洗滌去乙醇，1 000 rpm，離心5 min，洗兩遍。0.5 ml PBS重懸細(xì)胞，加入PI(碘化丙啶)和 RNaseA至終濃度50 μg/ml，37℃ 溫浴30 min。用流式細(xì)胞儀測(cè)定周期

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 15統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

DU-145 細(xì)胞在 2.5，5，10 μM 依立雄胺作用 3 d后，沒(méi)有觀察到有明顯的細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化，但在20 μM 和40 μM 的依立雄胺作用DU-145細(xì)胞3 d后，DU-145細(xì)胞由梭形變?yōu)閳A形，繼而皺縮，部分細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中，少數(shù)細(xì)胞的細(xì)胞膜出現(xiàn)破裂。另外，發(fā)現(xiàn)依立雄胺對(duì)細(xì)胞增殖呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性的抑制作用(見(jiàn)圖1)。

2.2 依立雄胺對(duì)DU-145細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，經(jīng)過(guò)依立雄胺處理過(guò)的細(xì)胞都受到不同程度的抑制作用，隨著依立雄胺濃度的不斷增加，這種抑制作用越來(lái)越明顯，在20 μM和40 μM的依立雄胺作用DU-145細(xì)胞7 d后其細(xì)胞抑制率都達(dá)到了90%以上。

2.3 依立雄胺對(duì)DU-145細(xì)胞周期阻滯分析結(jié)果

用依立雄胺作用DU-145細(xì)胞72 h后，碘化丙啶染色后發(fā)現(xiàn)，依立雄胺對(duì)DU-145呈現(xiàn)明顯的濃度依賴(lài)地周期阻滯作用，見(jiàn)圖3。

3 討論

5α-還原酶可以使得睪酮轉(zhuǎn)化成活性更強(qiáng)的二氫睪酮［3］。5α-還原酶有兩種亞型，每一種亞型都有單獨(dú)基因編碼［4］。Ⅰ型酶主要分布在人肝臟、皮膚、皮脂腺、睪丸和大多數(shù)毛囊中;Ⅱ型酶在包皮、胡須、頭發(fā)毛囊和前列腺中［5］。Ⅱ型 5α-還原酶主要在前列腺組織的基質(zhì)細(xì)胞、基底上皮細(xì)胞中表達(dá)［6］。非那雄胺可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制Ⅱ型5α-還原酶，對(duì)Ⅰ型5α-還原酶作用微弱。依立雄胺是一種新型的5α-還原酶抑制劑，在體外有較強(qiáng)的抑制Ⅱ型5α-還原酶活性的作用(Ki=25.1 nmol·L-1)，從而有可能抑制前列腺癌的生長(zhǎng)［7，8］。在本研究中已初步驗(yàn)證，依立雄胺能在較高濃度下體外抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，其機(jī)制可能為依立雄胺抑制雙氫睪酮(DHT)的生成［8］以及依立雄胺對(duì)DU-145細(xì)胞周期阻滯作用。Schafhauser等［9］在裸鼠的前列腺癌模型中給予裸小鼠口服25 mg/kg-1依立雄胺21天后，前列腺癌體積和PSA濃度均顯著下降，但不如去勢(shì)組的下降明顯。在老年Beagle犬中，孫祖越等［10］亦報(bào)道依立雄胺能降低Beagle犬前列腺中PSA和DHT的表達(dá)水平。此外，依立雄胺能改變前列腺局部的一些生長(zhǎng)因子水平，如胰島素樣生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和表皮生長(zhǎng)因子［11，12］，因而也可能抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖1 不同濃度依立雄胺對(duì)前列腺癌細(xì)胞株DU-145的抑制作用Fig 1 Inhibiting effect of different concentration of epristeride on human prostate carcinoma cell line DU-145

圖2 不同濃度依立雄胺對(duì)前列腺癌細(xì)胞株DU-145增值的抑制率Fig 2 Inhibiting effect ratio of different concentration of epristeride on human prostate carcinoma cell line DU-145

圖3 不同濃度依立雄胺對(duì)前列腺癌細(xì)胞株DU-145的周期阻滯作用Fig 3 Cycle retardation of different concentration of epristeride on human prostate carcinoma cell line DU-145

Lamb 等［13］認(rèn)為，依立雄胺對(duì)于 5α-還原酶活性較低的前列腺癌的抑制作用會(huì)更好，它能將DHT降低到與去勢(shì)一樣的水平。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果提示，依立雄胺對(duì)于已分化、未轉(zhuǎn)移的前列腺癌，可能具有一定的的控制治療作用。本研究對(duì)利用5α-還原酶在前列腺癌的預(yù)防和治療等方面進(jìn)行了一些初步探討打下了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，對(duì)依立雄胺等5α-還原酶抑制劑在預(yù)防以及治療前列腺癌的機(jī)理方面將進(jìn)行進(jìn)一步深入地研究。

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