基于無花果蛋白酶快速檢測維生素C含量的方法研究

彭 勃，關樺楠，薛 悅，吳巧艷，龔德狀，張 娜，劉曉飛

(哈爾濱商業(yè)大學 食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076)

無花果(FicuscaricaLinn.)是木蘭綱(Magnoliopsida)蕁麻目(Urticales)?？?Moraceae)榕屬(Ficus)落葉灌木，高3～10 m，原產地中海沿岸，分布于土耳其至阿富汗，在我國唐代時從波斯傳入，現(xiàn)南北均有栽培，新疆南部尤多。無花果蛋白酶(ficin)是一種從無花果樹的乳膠和不成熟的果實乳汁中分離出的植物蛋白酶，其酶學性質與木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶類似，屬于巰基蛋白酶[1-2]。無花果蛋白酶具有較強的蛋白水解能力、凝乳、解脂和溶菌活力[3]，與動物蛋白酶或微生物蛋白酶相比，無花果蛋白酶是可以從無花果樹乳膠中直接分離出的植物蛋白酶，其具有來源豐富、成本低、安全可靠、無毒副作用的優(yōu)點，被廣泛用于食品、醫(yī)藥、畜牧業(yè)及生命科學研究等領域[4]。近年來，國內對無花果蛋白酶的研究取得了可喜的進展，研究人員發(fā)現(xiàn)無花果蛋白酶除了具有上述特征和功能外，還具有與辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)催化性質相似的過氧化物模擬酶性質，能夠催化H2O2產生羥自由基(·OH)，氧化一系列過氧化物酶底物，如3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB)、2,2′-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)，ABTS]、鄰苯二胺(o-phenylenediamine，OPD)，發(fā)生顯色反應[5-8]。無花果蛋白酶作為天然植物蛋白酶，兼顧了生物催化劑和模擬酶的優(yōu)點，具有更加廣泛的應用前景。

維生素C又稱抗壞血酸，在人體各種氧化還原代謝反應中起調節(jié)作用[9]。作為有效的抗氧化劑，維生素C可以去除體內的活性氧和一些自由基，保護細胞免受氧化損傷，具有增強免疫功能，預防維生素C缺乏病、感冒、癌癥等功效[10-14]。維生素C不能在人體內直接合成，必須從食物中攝入，而水果蔬菜的食用是人體維生素C的重要來源[15]。維生素C在果蔬貯存和加工中所具有的變化情況對人們的健康具有重要的影響，因此維生素C的檢測分析逐漸在食品營養(yǎng)分析中占據(jù)著重要地位[16]。目前常規(guī)的維生素 C 的測定方法包括液相色譜法[17-18]、電化學法[19]、熒光法[20]和分光光度法[21-22]等，其中大多數(shù)方法都有昂貴精密設備和高昂成本的限制，而比色分析由于可通過肉眼識別，靈敏度高、成本低、簡單、快速、實用性強等特點越來越受到人們的青睞，更適于實現(xiàn)現(xiàn)場分析和快速檢測[23]。

本研究首先驗證無花果蛋白酶的過氧化物酶模擬酶特性，再利用其模擬過氧化物酶活性構建維生素C的檢測方法。如圖1，無花果蛋白酶具有良好的模擬過氧化物酶活性，能催化H2O2產生·OH，從而氧化底物ABTS，產生典型的綠色反應。而維生素C具有的抗氧化性可清除自由基，從而誘導綠色ABTS+·還原為無色的ABTS，隨著維生素C含量的增加，綠色體系逐漸趨近于無色，依此原理建立了一種靈敏快速比色檢測維生素C的方法，為維生素C的檢測提供了一種新思路，拓寬了其在食品安全和食品分析中的應用范圍。

圖1 無花果蛋白酶模擬過氧化物酶反應原理Fig.1 Reaction mechanism of ficin mimetic peroxidase

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

無花果蛋白酶(50萬U/g)，分析純，安徽酷爾生物工程有限公司；過氧化氫溶液，分析純，蘇州達江精細化工有限公司；2,2′-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；醋酸，分析純，蘇州達江精細化工有限公司；醋酸鈉，分析純，蘇州達江精細化工有限公司；抗壞血酸，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；維生素C泡騰片，購自哈爾濱人民同泰醫(yī)藥連鎖。

UV2250型紫外-可見光分光光度計，上海圣科儀器設備有限公司；HWS26型電熱恒溫水浴鍋，上海向帆儀器有限公司；FA1204T型電子天平，廈門雄發(fā)儀器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1單因素優(yōu)化檢測方法

將500 μL不同濃度的H2O2溶液(1.5、1.0、0.5、0.1、0.05 mol/L)，100 μL不同濃度的無花果蛋白酶溶液(0.05、0.1、0.5、5、10 μg/mL)，200 μL ABTS(5 mmol/L)溶液和3 mL HAc-NaAc緩沖溶液(pH=4.4)依次加入具蓋離心管中，充分混勻后，將反應體系放置于不同溫度的水浴鍋中(30、40、50、60、70 ℃)，水浴30 min后(水浴過程中每過1 min溫和倒轉1次)取出，靜置1 min，吸取上清液3 mL，以蒸餾水為空白，測定420 nm處吸光度。在反應體系分別加入100 μL 維生素C溶液(0.5 mmol/L)，孵育不同時間間隔(10、20、30、60、120 s)再測定420 nm處吸光度。

體系指標ΔA見式(1)。

ΔA=A0-A。

(1)

式(1)中，A0為不加入維生素C時420 nm處的吸光度值，A為加入維生素C后420 nm處的吸光度值，ΔA越大表示檢測效果越明顯，結果越好，重復實驗3次。

1.2.2正交實驗優(yōu)化檢測方法

選擇L9(34)正交設計表進行實驗，確定影響因素的主次順序及優(yōu)選方案。依次將500 μL H2O2(濃度為單因素優(yōu)化結果)，100 μL無花果蛋白酶溶液(質量濃度為單因素優(yōu)化結果)，200 μL ABTS溶液(5 mmol/L)和3 mL的HAc-NaAc緩沖溶液加入具蓋離心管中，混勻后，將反應體系放置于水浴鍋中(溫度為單因素優(yōu)化結果)，水浴30 min后(水浴過程中每過1 min溫和倒轉1次)取出，靜置1 min，吸取上清液3 mL，以蒸餾水為空白，測定420 nm處吸光度。在反應體系中分別加入100 μL維生素C溶液(0.5 mmol/L)，孵育一段時間(孵育時間為單因素優(yōu)化結果)后再測定420 nm處吸光度，重復實驗3次。

1.2.3檢測方法工作曲線、檢出限、回收率和選擇性的測定方法

在較優(yōu)條件下，將500 μL H2O2溶液，100 μL的無花果蛋白酶溶液，200 μL的ABTS(5 mmol/L)溶液和3 mL的HAc-NaAc緩沖溶液依次加入具蓋離心管中，充分混勻，水浴30 min后(水浴過程中每過1 min溫和倒轉1次)，靜置1 min，吸取上清液3 mL，以蒸餾水為空白，測定420 nm處吸光度。依次在體系中加入100 μL不同濃度的維生素C溶液(0.080、0.060、0.040、0.020、0.010、0.008、0.005、0.001 mmol/L)，孵育30 s后再測定420 nm處吸光度，根據(jù)不同濃度維生素C與吸光度差值繪制工作曲線，計算最低檢出限，并與天然酶催化方法進行比較[24]。選擇濃度為0.005、0.010、0.050 mmol/L的維生素C標準液加入上述檢測體系，測定其吸光度值，重復實驗3次，結果取平均值帶入工作曲線方程，測定其回收率。

比色檢測方法的一個重要指標就是檢測其選擇性，評估模擬酶檢測抗壞血酸體系的特異性。研究其他可能與維生素C共存物質對檢測系統(tǒng)的影響，在體系中添加食品中常見的鹽類、糖類和氨基酸代表物質作為干擾物質，包括氯化鈉、氯化鈣、氯化汞、甘氨酸、葡萄糖和蔗糖，干擾物質工作濃度為維生素C濃度的20倍(維生素C濃度為0.05 mmol/L，干擾物質濃度為1.00 mmol/L)，ΔA作為評價標準。

1.2.4實際樣品檢測

將一片市售維生素C泡騰片溶于去離子水中，定容至100 mL，然后用去離子水將溶液稀釋10倍，檢測步驟與上述溶液檢測實驗相同。加入不同濃度的維生素C標準液，重復測定3次，考察檢測方法的加標回收率，并評價檢測方法的精確度和重復性。

2 結果與分析

2.1 無花果蛋白酶的模擬過氧化物酶活性分析

研究表明，過氧化物酶可以利用H2O2為電子受體催化底物氧化，引起體系顏色發(fā)生變化。反應體系中，模擬酶能夠催化H2O2與底物ABTS反應產生綠色產物[7-8]。為了證明無花果蛋白酶具有模擬過氧化物酶的活性，本實驗設置了不同組分的催化反應體系，并進行對比分析，結果見圖2。

圖2 無花果蛋白酶模擬過氧化物酶催化活性Fig.2 Catalytic activity of ficin mimetic peroxidase

結果表明，ficin+ABTS體系(曲線a)、ficin+H2O2體系(曲線b)、H2O2+ABTS體系(曲線c)溶液體系均沒有出現(xiàn)特征吸收峰，所對應的溶液體系顏色也均為無色，說明當體系中只有H2O2和ABTS存在時，ABTS不會被氧化，彼此之間沒有發(fā)生任何還原反應，而當無花果蛋白酶分別與H2O2和ABTS存在時，也不發(fā)生任何反應；與此同時，ficin+H2O2+ABTS體系(曲線d)溶液體系卻呈現(xiàn)出綠色，且ficin+H2O2+ABTS體系在波長420 nm處具有明顯的特征吸收峰，該峰是由于無花果蛋白酶催化H2O2產生·OH從而將ABTS氧化成ABTS+·所形成的。綜上所述，只有在無花果蛋白酶、H2O2和ABTS共同存在的條件下，無花果蛋白酶可以發(fā)生模擬過氧化物酶的催化反應。說明無花果蛋白酶有過氧化物模擬酶的催化活性，可以專一的催化H2O2與底物ABTS產生顯色反應。

2.2 不同因素對檢測方法的影響

無花果蛋白酶模擬過氧化物酶的催化活性受H2O2濃度、無花果蛋白酶質量濃度、溫度和孵育時間影響，依據(jù)1.2.1節(jié)實驗方案，進行條件優(yōu)化，結果如圖3。由圖3(a)可知，H2O2濃度在0.05～0.5 mol/L范圍內時，隨H2O2濃度的增加吸光度差值呈快速增加趨勢；添加量在0.5～1.5 mol/L范圍內時，隨H2O2濃度的增加，吸光度差值逐漸下降。溶液中過量的H2O2會與維生素C發(fā)生反應，影響自由基清除體系的響應效果，考慮到檢測的靈敏度和精確度，在后續(xù)實驗中選擇0.5 moL/L H2O2進行維生素C檢測，且在正交試驗中選擇H2O2濃度為0.1、0.5、1.0 mol/L。

由圖3(b)可知，考察無花果蛋白酶質量濃度對催化活性的影響。無花果蛋白酶質量濃度在0.05～0.5 μg/mL范圍內時，隨濃度的增加吸光度差值呈快速增加趨勢；在0.5～10 μg/mL范圍內時，隨質量濃度增加吸光度差值變化緩慢平穩(wěn)上升。因此選擇0.5、5、10 μg/mL參與之后的優(yōu)化實驗。

由圖3(c)可知，當溫度在30～60 ℃范圍內時，隨著催化的溫度不斷升高，吸光度差值呈上升趨勢，說明在較寬的溫度范圍內，模擬酶具有較好的催化效果；當溫度在60～70 ℃范圍內，出現(xiàn)下降趨勢，表明溫度過高會使活性減弱。在接下來的正交優(yōu)化實驗中，溫度取50、60、70 ℃較為適合。

由圖3(d)可知，孵育時間在10～30 s范圍內反應速度很快，說明該方法具有快速的維生素C檢測響應能力。孵育時間在30～120 s時，催化活性呈下降趨勢。結果表明，孵育時間為30 s時催化體系反應效果基本達到最優(yōu)，且過長的反應時間不利于模擬酶催化體系應用于快檢研究。故在正交優(yōu)化設計實驗時選擇孵育時間為20、30、60 s。

圖3 不同因素對無花果蛋白酶模擬酶催化活性的影響Fig.3 Effect of different factors on mimetic enzyme catalytic activity of ficin

2.3 正交試驗優(yōu)化影響因素分析

設計正交實驗，各因素取3個合適的水平，分別以H2O2濃度為A因素，無花果蛋白酶質量濃度為B因素，溫度為C因素，孵育時間為D因素，考察它們對反應體系的影響。進行正交試驗，將波長420 nm處的吸光度差值ΔA設為參考指標，選擇L9(34)正交試驗表，利用極差分析，獲得無花果蛋白酶模擬酶檢測維生素C體系的因素優(yōu)選方案，結果見表1。由表1可知，極差分析表明影響因素由大到小依次為孵育時間、H2O2濃度、無花果蛋白酶質量濃度、溫度。通過極差分析確定的較優(yōu)方案組合為A2B1C2D3，即H2O2濃度0.5 mol/L，無花果蛋白酶質量濃度0.5 μg/mL，溫度50 ℃，孵育時間30 s。以正交結果較優(yōu)方案進行維生素C檢測，重復實驗3次，吸光度差值平均值為0.636，相對標準偏差為3.17%。

表1 正交試驗結果分析Tab.1 Analysis of orthogonal experiment results

2.4 檢測方法工作曲線的構建與檢出限分析

配置不同濃度的維生素C溶液，在最優(yōu)反應條件下進行實驗，結果見圖4。由圖4可知，吸光度差值與體系中維生素C濃度成正比。維生素C濃度在0.001～0.080 mmol/L范圍內呈現(xiàn)良好的線性關系，線性回歸方程為y=7.381x+0.109 1，相關系數(shù)R2值為0.992 3，檢出限為0.43 μmol/L，說明此基于無花果蛋白酶模擬酶性質檢測維生素C的檢測方法靈敏度高。

插圖中反應瓶由左至右是建立標準曲線選取的8個由低到高維生素C樣品濃度的測試結果。圖4 維生素C檢測方法工作曲線Fig.4 Working curve of vitamin C detection method

2.5 維生素C檢測方法抗干擾性研究

比色檢測方法的一個重要指標就是檢測其抗干擾性，評估模擬酶檢測維生素C體系的特異性和選擇性。研究其他可能與維生素C共存物質對檢測系統(tǒng)的影響，體系中添加干擾物質包括葡萄糖、蔗糖、甘氨酸、氯化鈉、氯化鈣和氯化汞，ΔA作為評價標準，結果見圖5。由圖5可知，當維生素C存在時，吸光度強度有顯著變化，而其他干擾物質工作濃度為維生素C濃度的20倍，卻不能產生任何明顯的吸光度變化，這是因為維生素C能將綠色ABTS+·還原為無色的ABTS。因此，基于比色系統(tǒng)檢測維生素C的方法具有極好的選擇性。

圖5 維生素C檢測方法的選擇性Fig.5 Selectiveness of vitamin C detection method

2.6 檢測方法回收率與實際樣品檢測結果

以最優(yōu)工藝條件，選擇濃度為0.005、0.010、0.050 mmol/L的維生素C溶液進行回收率實驗，得出回收率分別為95.59%、104.88%和90.05%，反映出所創(chuàng)建的方法對維生素C檢測精確度高、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好。雖然該檢測系統(tǒng)在測定維生素C標準溶液時具有較高的精確度，為驗證其對較復雜的真實樣品中維生素C的準確測量，探究其對樣品中不同濃度維生素C的加標回收率和精密度，通過測定維生素C泡騰片濃度，進一步評價了該方法的可靠性。通過在維生素C泡騰片溶液中加入標準維生素C溶液，進行了維生素C的回收實驗。結果表明，平均回收率在95%～105%，相對標準偏差低于2.57%，表明此法可以快速、可靠地應用于大量樣品的分析。構建的檢測方法操作簡單、檢測成本低，為維生素C檢測提供了一種新思路，具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

3 結 論

無花果蛋白酶作為過氧化物模擬酶，能夠催化ABTS+H2O2的顯色反應，而維生素C的強抗氧化性能清除自由基，使溶液由綠色變回無色?；跓o花果蛋白酶的過氧化物模擬酶性質建立維生素C的比色法檢測方法，反應過程不需要復雜的合成和修飾過程，不用引入有機溶劑或重金屬，綠色環(huán)保，可視化分析結果。該方法靈敏度高，選擇性好，且適用于實際樣品中維生素C的測定，表明無花果蛋白酶在檢測維生素C含量方面潛在的應用價值，有利于促進無花果蛋白酶模擬酶性質在食品分析、醫(yī)藥診斷和生物化學方面的應用。