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    醬油風(fēng)味與功能性成分研究進(jìn)展

    2021-08-27 00:56:40馮云子吳偉宇趙謀明
    關(guān)鍵詞:鮮味滋味醬油

    馮云子,周 婷,吳偉宇,蔡 宇,趙謀明

    (華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 510641)

    醬油是一種傳統(tǒng)的發(fā)酵調(diào)味品,其起源可追溯到我國(guó)周朝時(shí)期,距今已有2 000多年的歷史,是我國(guó)及東南亞各國(guó)飲食文化的重要代表[1]。近年來(lái),歐美等國(guó)家的醬油消費(fèi)量也逐年增加,醬油已成為世界性的大宗調(diào)味品,年產(chǎn)量約為1 000多萬(wàn)t。醬油主要以大豆、豆粕等植物蛋白為原料,輔以面粉或小麥粉等淀粉質(zhì)原料,在一定鹽濃度條件下,利用微生物(如霉菌、酵母菌、細(xì)菌、乳酸菌等)的發(fā)酵作用,水解原料生成多種氨基酸、肽、有機(jī)酸、糖醇和糖類(lèi)物質(zhì),并以此為基礎(chǔ),經(jīng)過(guò)復(fù)雜的生物化學(xué)變化,形成具有特殊色澤、香氣、滋味和狀態(tài)的調(diào)味液[1-2]。

    作為調(diào)味品,醬油的風(fēng)味是其品質(zhì)組成的重要指標(biāo),更是影響消費(fèi)者嗜好性選擇的關(guān)鍵因素。醬油中香氣物質(zhì)的貢獻(xiàn)可分為以下幾個(gè)維度,如酸香、醇香、麥芽香、花果香、焦糖香、煙熏香、烘烤香和蔬菜類(lèi)香(或烤土豆香)等,不同香型的化合物以一定比例組合形成了醬油濃郁的醬香和酯香[2-3]。在滋味上,醬油具有酸、甜、苦、咸、鮮和濃厚味的綜合味感,其中咸、鮮味較為突出[4]。醬油的風(fēng)味復(fù)雜而平衡,其中揮發(fā)性成分和非揮發(fā)性成分是構(gòu)成醬油獨(dú)特風(fēng)味的物質(zhì)基礎(chǔ),如何全面地解析這些成分和確定關(guān)鍵風(fēng)味化合物并對(duì)其進(jìn)行有效的調(diào)控一直是調(diào)味品行業(yè)的研究熱點(diǎn)。而在“健康中國(guó)2030”規(guī)劃綱要的引領(lǐng)下,人們對(duì)食品的營(yíng)養(yǎng)與健康也提出了更高的要求。有研究表明,除具有獨(dú)特的風(fēng)味外,醬油還富含功能活性物質(zhì),具有一定的生理功能,如抗氧化[5-6]、抗癌[7-8]、降血壓[9]和提高免疫力[10]等。

    本文依據(jù)風(fēng)味和生理功能屬性,分別總結(jié)了醬油中檢出的香氣、滋味以及功能性化合物,并系統(tǒng)闡述了風(fēng)味研究方法的進(jìn)展,探討了研究中存在的問(wèn)題,并對(duì)今后的研究方向提出建議。

    1 醬油的風(fēng)味物質(zhì)研究進(jìn)展

    早期醬油風(fēng)味研究多以傳統(tǒng)感官描述結(jié)合基礎(chǔ)理化指標(biāo)為主,但隨著精密儀器和相關(guān)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展,分析風(fēng)味物質(zhì)的能力得到了顯著提升,進(jìn)一步帶動(dòng)了風(fēng)味研究的數(shù)據(jù)信息化,包括定量感官分析、氣(液)相及質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用等;近年來(lái),精密儀器與感官分析的有機(jī)結(jié)合,更是推動(dòng)了關(guān)鍵風(fēng)味活性化合物的鑒定,其中代表性的研究體系是分子感官組學(xué),包括GC-O/MS、重組缺失實(shí)驗(yàn)等技術(shù),幫助科研工作者從龐大的數(shù)據(jù)系統(tǒng)中關(guān)注到具有代表性的風(fēng)味化合物,明確風(fēng)味調(diào)控的核心目標(biāo)。

    1.1 醬油香氣的分析方法研究

    香氣物質(zhì)的分析主要分為感官分析和揮發(fā)性物質(zhì)分析兩個(gè)部分,揮發(fā)性化合物的分析則包括了提取、分離、鑒定、定量以及關(guān)鍵香氣物質(zhì)的分析,見(jiàn)圖1。

    圖1 醬油風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)Fig.1 Detection technology of flavor substances in soy sauce

    根據(jù)GB 2717—2018《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 醬油》的規(guī)定,優(yōu)質(zhì)醬油的香氣描述為濃郁的醬香及酯香。因此,早期的感官評(píng)估多以醬香、酯香強(qiáng)度來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)。現(xiàn)階段定量描述分析(quantitative descriptive analysis,QDA)技術(shù)[11-12]在研究中使用更為廣泛,醬油常用的香氣標(biāo)度為酸香、醇香、麥芽香、花香、果香、焦糖香、煙熏香、烘烤香和烤土豆香等[2-3,12]。QDA方法執(zhí)行期間,需要感官人員提前熟悉每個(gè)香氣特征對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的香氣,如4-乙基愈創(chuàng)木酚(煙熏香)、4-羥基-2-乙基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮或4-羥基-2-甲基-5-乙基-3(2H)-呋喃酮(HEMF,焦糖香),然后對(duì)樣品的特征香氣強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)估。QDA適用于樣品間差異細(xì)節(jié)的挖掘,以及感官與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)數(shù)據(jù)的結(jié)合分析,但該方法對(duì)感官人員要求相對(duì)較高,需要經(jīng)過(guò)一定時(shí)長(zhǎng)的訓(xùn)練。

    揮發(fā)性化合物的提取是香氣檢測(cè)的重要前提,醬油香氣的提取方法主要包括液液萃取(liquid-liquid extraction,LLE)、同時(shí)蒸餾萃取(simultaneous distillation and extraction,SDE)、固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)、溶劑輔助蒸餾萃取(solvent assisted flavor evaporation,SAFE)和大孔樹(shù)脂吸附等[2-3,13-14]。本研究團(tuán)隊(duì)對(duì)比了LLE、SDE、SPME 3種方法對(duì)醬油香氣分析的影響[2],發(fā)現(xiàn)LLE適用于半揮發(fā)性化合物的分析,特別是對(duì)呋喃酮和酸類(lèi)物質(zhì)萃取效率較高;SDE分析結(jié)果中醛類(lèi)物質(zhì)含量較高,其提取過(guò)程需要保持樣品沸騰,高溫促使了醬油中的氨基酸、肽與糖類(lèi)物質(zhì)的熱反應(yīng),生成大量的Strecker醛類(lèi)化合物等[15],導(dǎo)致分析結(jié)果與醬油真實(shí)的揮發(fā)性物質(zhì)組成差異較大,因此SDE并不適合于醬油這一類(lèi)具有較高氨基酸和糖類(lèi)物質(zhì)的食品。無(wú)溶劑萃取技術(shù)SPME近年來(lái)使用越來(lái)越廣泛[12,16]。該方法無(wú)需有機(jī)溶劑,上樣操作簡(jiǎn)單,能有效地萃取揮發(fā)性化合物。但有兩點(diǎn)局限,一是由于目標(biāo)化合物在樣品、頂空和萃取頭中處于三相平衡狀態(tài),其絕對(duì)定量的準(zhǔn)確度容易受到競(jìng)爭(zhēng)性吸附及基質(zhì)效應(yīng)影響;二是SPME法不適于低揮發(fā)性化合物的分析,比如醬油中的3-羥基-4,5-二甲基-2(5H)-呋喃酮(sotolone)等;為了改善SPME的局限性,新開(kāi)發(fā)的SPME-Arrow萃取技術(shù)[17],可有效改善萃取頭對(duì)低揮發(fā)性化合物的提取效率,值得在醬油中進(jìn)行應(yīng)用嘗試。此外,SAFE[3]采用高真空、液氮冷凝,可以避免SDE的熱效應(yīng),較好地還原樣品的實(shí)際香氣特征,同時(shí)避免一些難揮發(fā)性成分進(jìn)入GC-MS影響分離效果。然而,SAFE提取過(guò)程涉及液氮和真空裝置,實(shí)驗(yàn)成本高、設(shè)備操作相對(duì)煩瑣,對(duì)于醬油樣品來(lái)說(shuō),因其體系以水為主,難揮發(fā)性雜質(zhì)如油脂等含量相對(duì)較低,常規(guī)LLE法也可基本滿足分析測(cè)定。整體而言,不同的方法提取效果和針對(duì)的物質(zhì)各有差異,實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)根據(jù)分析的目標(biāo)不同擇優(yōu)選用方法,采用不同方法結(jié)合來(lái)全面分析醬油的香氣化合物也是一個(gè)較為實(shí)用的策略,如采用SPME法和LLE法結(jié)合等。

    揮發(fā)性化合物分離和鑒定技術(shù)中,最常用的是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)。在分離上,近年來(lái)多維氣相色譜(GC×GC)的應(yīng)用使得檢出化合物的數(shù)量大大提高,如醬油中可分離的揮發(fā)性化合物從百來(lái)種增加到400余種[18]。而在定性技術(shù)上,可以分為氣相色譜檢測(cè)器(氫火焰離子檢測(cè)器FID、氮磷檢測(cè)器NPD、火焰光度檢測(cè)器FPD、硫化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器SCD),離子遷移譜,及質(zhì)譜等,其中質(zhì)譜根據(jù)質(zhì)量分析器類(lèi)型的不同,又可分為低分辨質(zhì)譜(單四極桿、三重四極桿、離子阱)和高分辨質(zhì)譜(如靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜Orbitrap-MS、飛行時(shí)間質(zhì)譜TOF-MS)。風(fēng)味定性一般需要考慮質(zhì)譜庫(kù)匹配程度、保留指數(shù)(RI)和標(biāo)準(zhǔn)品,通過(guò)GC-O嗅聞技術(shù)的研究一般還需要核對(duì)物質(zhì)的香氣特征。關(guān)于醬油風(fēng)味物質(zhì)的系統(tǒng)研究,最早的SCI發(fā)表于1961年,日本Yokotsuka[19]對(duì)日式醬油風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行研究,認(rèn)為愈創(chuàng)木酚化合物是烹調(diào)醬油的特色風(fēng)味成分。到了80年代,Nunomura等[20-22]利用GC-MS技術(shù)從日本醬油酸、中、堿性組分中分離鑒定出93、142及35種揮發(fā)性化合物。隨后的40年間,醬油的風(fēng)味研究得到了迅速的發(fā)展,特別是中國(guó)研究技術(shù)手段的升級(jí)帶來(lái)了傳統(tǒng)發(fā)酵行業(yè)的理論研究的熱潮。筆者曾對(duì)已報(bào)道文獻(xiàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),有近1 038種化合物在醬油中檢出。結(jié)合氣相色譜-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜法(gas chromatography-orbitrap/mass spectrometry),更是有助于GC-MS/O中未知香氣活性化合物的分析,如貢獻(xiàn)甜香的大馬酮[23]。

    氣相色譜-質(zhì)譜/嗅聞儀聯(lián)用技術(shù)(GC-MS/olfactory,GC-MS/O)的發(fā)展使得關(guān)鍵香氣活性化合物的檢測(cè)成為可能。該技術(shù)將GC流出物分成兩部分,一半進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)器分析結(jié)構(gòu),另一半進(jìn)入嗅聞口,以感官人員的鼻子作為檢測(cè)器,感官人員描述嗅聞到的化合物的香氣強(qiáng)度和特點(diǎn)[23]。GC-MS/O方法包括香氣提取稀釋分析(aroma extraction distillation analysis,AEDA)、頻次檢測(cè)法和直接強(qiáng)度法,其中AEDA應(yīng)用最為常見(jiàn)[24-25]。從2004年開(kāi)始,至今為止共有近9個(gè)團(tuán)隊(duì)對(duì)中國(guó)、日本、韓國(guó)、泰國(guó)各種代表性工藝的醬油產(chǎn)品進(jìn)行了深入分析,分別檢出了11~94種香氣活性化合物[3,13,15,18,25-33]。

    1.2 揮發(fā)性物質(zhì)和香氣活性化合物研究

    醬油中揮發(fā)性化合物的種類(lèi)和數(shù)量繁多,已檢出的1 038種揮發(fā)性化合物[2]主要可分為酸類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)、酚類(lèi)、酯類(lèi)、吡嗪類(lèi)、呋喃(酮)類(lèi)、吡喃(酮)類(lèi)、吡咯類(lèi)、吡啶類(lèi)、含硫化合物及含氮化合物等13大類(lèi),其具體的數(shù)量分布見(jiàn)圖2。由圖2可知,酯類(lèi)和醇類(lèi)是檢出數(shù)量較多的類(lèi)別。

    圖2 醬油中不同種類(lèi)的揮發(fā)性化合物的數(shù)量Fig.2 Number of different kinds of volatile compounds in soy sauce

    從2004年開(kāi)始,韓國(guó)的Beak等[26]首次采用固相微萃取-氣相色譜-嗅聞聯(lián)用(SPME-GC-O)對(duì)醬油中關(guān)鍵香氣活性化合物進(jìn)行了分析,描述了11種化合物的香氣特征。迄今為止,研究者們[3,13,15,18,25-33]采用GC-MS/O技術(shù)共在醬油中鑒定出了202種香氣活性化合物,根據(jù)其檢出頻次(≥1次和≥5次)的不同,分別做了統(tǒng)計(jì)總結(jié),見(jiàn)圖3。由圖3可知,醇類(lèi)、醛類(lèi)、酯類(lèi)、呋喃(酮)類(lèi)、酮類(lèi)是檢出關(guān)鍵香氣活性化合物較多(≥25個(gè))的化合物類(lèi)別。但202個(gè)化合物中沒(méi)有一種物質(zhì)可以完全被描述為“醬油香”或“醬香”,可見(jiàn)醬油的香氣是由多種物質(zhì)按一定比例組成的復(fù)雜香氣組合。

    圖3 醬油中不同種類(lèi)香氣活性化合物的數(shù)量Fig.3 Number of different kinds of aroma-active compounds in soy sauce

    表1及圖4重點(diǎn)列舉了醬油中高頻檢出(≥5次)的31種香氣活性化合物及其香氣描述詞、強(qiáng)度和檢出頻次。根據(jù)香氣描述詞大致可歸納為酸醇香、麥芽香、花香、果香、焦糖香、煙熏香、烘烤香和蔬菜類(lèi)香8種香型。

    圖4 醬油中的關(guān)鍵風(fēng)味化合物Fig.4 Key flavor compounds in soy sauce

    表1 醬油中檢出頻次大于等于5的香氣活性化合物Tab.1 Aroma-active compounds with detection frequency greater than or equal to 5 times in soy sauce

    1.2.1酸香和醇香物質(zhì)

    醬油中的酸香主要由低分子量的揮發(fā)性酸構(gòu)成,如乙酸、2-甲基丁酸和3-甲基丁酸。酸類(lèi)物質(zhì)能使發(fā)酵環(huán)境的pH值下降,為酵母的生長(zhǎng)和發(fā)育提供酸性環(huán)境,同時(shí),可與醇類(lèi)發(fā)生酯化反應(yīng)形成酯類(lèi)化合物,對(duì)香氣和口感起著重要作用。醬油中乙酸含量較高,一般可達(dá)到1~10 mg/L,但其閾值相對(duì)較高(22 mg/L)[2-3];相比之下,2/3-甲基丁酸的含量需要在發(fā)酵過(guò)程中有所控制,過(guò)高會(huì)產(chǎn)生“汗味”“臭襪子味”等異味,影響醬油品質(zhì)。

    乙醇是醬油醇類(lèi)中含量最高的揮發(fā)性化合物,一般含量為3 000~10 000 mg/L[1,3]。日式醬油的醇香顯著強(qiáng)于中式醬油,這與其發(fā)酵工藝中酵母的代謝密切相關(guān),部分產(chǎn)品還有添加乙醇,以提高醬油的防腐性能[1]。

    1.2.2麥芽香物質(zhì)

    2/3-甲基-1-丁醇、2-甲基丙醛和2/3-甲基丁醛是醬油“麥芽香”的重要來(lái)源,該類(lèi)物質(zhì)與氨基酸的代謝關(guān)系密切,如纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸,這一類(lèi)氨基酸前體的廣泛存在,使得它們?cè)诙喾N食品中都具有香氣活性,如大豆醬[34]、黑巧克力等。

    1.2.3花香和果香物質(zhì)

    在花香特征上,苯乙醇和苯乙醛是主要的貢獻(xiàn)者,具有“花香”“甜香”和“蜂蜜香”,與苯丙氨酸的代謝相關(guān),兩者在醬油中平均香氣強(qiáng)度達(dá)到3.6,檢出頻次超過(guò)80%,是醬油中重要的香氣物質(zhì),也在很多食品(如奶酪、面包和紅酒)中被鑒定為關(guān)鍵香氣活性化合物[35],同時(shí)也是花朵芬芳的重要來(lái)源。

    醬油中果香與乙酯類(lèi)化合物密切相關(guān),主要包括乳酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸乙酯和異丁酸乙酯,特別是異丁酸乙酯,具有特征的蘋(píng)果香味,帶給醬油濃郁而柔和的特征[1],但在低分辨MS的鑒定中異丁酸乙酯容易被前一個(gè)物質(zhì)覆蓋,利用高分辨質(zhì)譜結(jié)合解卷積可以有效鑒定該物質(zhì)[23]。在日式醬油中乙酯類(lèi)化合物的含量相對(duì)中式醬油更高[31],約為中式醬油的4~5倍,使得日式醬油具有較為濃郁的果香,這與酵母的代謝活動(dòng)有關(guān)。

    1.2.4焦糖香物質(zhì)

    由表1可知,焦糖香化合物平均香氣強(qiáng)度為3.4分,平均檢出頻次達(dá)到64%,是醬油重要的香氣特征之一,其物質(zhì)基礎(chǔ)是HEMF、HDMF、麥芽酚和sotolone等,這些化合物的分子結(jié)構(gòu)特征均是環(huán)酮分子中含有烯醇化的結(jié)構(gòu)單元[2]。焦糖香氣物質(zhì)中,檢出頻次最高的物質(zhì)為HEMF,俗稱醬油酮,在GC-MS檢測(cè)時(shí),這個(gè)物質(zhì)一般能檢出2個(gè)同分異構(gòu)體,包括4-羥基-2-乙基-5-甲基-3(2H)-呋喃酮和4-羥基-5-乙基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮,典型離子碎片為142 m/z。本研究團(tuán)隊(duì)曾調(diào)查了27種商業(yè)醬油的香氣活性化合物,HEMF在醬油的所有香氣活性化合物中,平均OAV值排第二,最高可達(dá)到2 163[36]。此外,sotolone的檢出頻次為焦糖香化合物中最低,但其平均香氣強(qiáng)度排名第一,這可能與其揮發(fā)特性及檢測(cè)方法的選用有關(guān),該物質(zhì)除貢獻(xiàn)焦糖香外,還常被描述為調(diào)味品香[2-3]。

    1.2.5煙熏香物質(zhì)

    煙熏香化合物檢出頻次達(dá)到71%,2,6-二甲氧基苯酚、愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚(4-EG)和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚這4種甲氧基酚類(lèi)化合物是最主要的貢獻(xiàn)者,常被描述為“煙熏”“焦香”及“培根”等[3,12]。該類(lèi)化合物檢出最多的4-乙基愈創(chuàng)木酚具有強(qiáng)烈的煙熏香和培根香,是日韓醬油香氣的重要貢獻(xiàn)化合物。

    1.2.6烘烤香物質(zhì)

    貢獻(xiàn)烘烤香的物質(zhì)主要是吡嗪類(lèi)化合物,常檢出的有2,6-二甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪,吡嗪類(lèi)化合物是含有1,4-二氮雜苯母環(huán)的一類(lèi)化合物的總稱,經(jīng)常在堅(jiān)果、芝麻和花生等焙烤食品中發(fā)現(xiàn),貢獻(xiàn)著烘烤香和堅(jiān)果香[2-3]。該類(lèi)物質(zhì)在醬油中具有中等香氣強(qiáng)度(2.7分),檢出頻次較低。這與醬油中常檢出的幾類(lèi)吡嗪類(lèi)化合物閾值較高是有關(guān)系的,前期對(duì)商業(yè)醬油的研究中發(fā)現(xiàn)其OAV值都小于1[36]。

    1.2.7蔬菜香物質(zhì)

    蔬菜香型包括“蘑菇香”“煮熟的洋蔥味”和“烤土豆味”等,具有較高的香氣強(qiáng)度(3.1分),且檢出頻次達(dá)到68%。1-辛烯-3-醇具有類(lèi)似蘑菇的香氣,也被稱之為蘑菇醇。二甲基三硫除了貢獻(xiàn)“煮熟的洋蔥味”,還貢獻(xiàn)“硫黃味”?!翱就炼刮丁庇袃蓚€(gè)典型的化合物,即3-甲硫基丙醛和3-甲硫基丙醇,而3-甲硫基丙醛是醬油[3]和豆醬[34]等發(fā)酵豆制品中常見(jiàn)的香氣活性化合物。二甲基三硫、3-甲硫基丙醛和3-甲硫基丙醇是醬油中最常檢出的含硫化合物,雖然含量不高,但具有較低的閾值[2],故具有較強(qiáng)的香氣貢獻(xiàn)。

    2 醬油的滋味物質(zhì)研究進(jìn)展

    2.1 醬油滋味的分析方法研究

    醬油的滋味具有五味調(diào)和、咸鮮突出的特點(diǎn),其基本研究思路與香氣類(lèi)似,也包括感官和非揮發(fā)性物質(zhì)分析兩個(gè)部分(圖1)。感官分析一般采用人來(lái)評(píng)價(jià)醬油的滋味特點(diǎn),但其鹽濃度常高達(dá)16%~18%,感官分析難度較高。近年來(lái),電子舌技術(shù)也被引入到醬油滋味的研究中,通過(guò)馴化建立模型,可以用來(lái)輔助醬油調(diào)配工作[37]。同時(shí),隨著分離和檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展,非揮發(fā)性物質(zhì)的鑒定種類(lèi)也與日俱增,關(guān)注對(duì)象從乳酸、谷氨酸等,逐漸擴(kuò)展到了糖類(lèi)、氨基酸、肽和美拉德反應(yīng)產(chǎn)物等,代謝組學(xué)思想的引入更是為傳統(tǒng)發(fā)酵行業(yè)的科學(xué)發(fā)展注入了新力量。

    采用HPLC和氨基酸分析儀,一般能從醬油中檢測(cè)到15~18種氨基酸[4,38-39]和7~10種糖類(lèi)物質(zhì)。隨后,核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)、LC-MS、UPLC-MS/MS、GC-MS衍生化等組學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,進(jìn)一步揭秘了醬油的物質(zhì)基礎(chǔ)。筆者和團(tuán)隊(duì)成員曾優(yōu)化并采用以上幾種技術(shù)研究醬油的小分子代謝物質(zhì),并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道,總結(jié)發(fā)現(xiàn),NMR和GC-MS衍生化適合于初級(jí)代謝產(chǎn)物(糖、糖醇、有機(jī)酸等)的檢測(cè),而LC-MS和UPLC-MS/MS相對(duì)更適合次級(jí)代謝產(chǎn)物和肽類(lèi)物質(zhì)的分析,也包括一系列氨基酸和肽的衍生物。Kamal等[40]和林涵玉[41]采用 NMR 技術(shù)分別從醬油中檢測(cè)到 18、24種非揮發(fā)性化合物,而GC-MS結(jié)合衍生化法[42-43],可鑒定出50~100種化合物,包括糖、氨基酸、糖醇、有機(jī)酸、核苷酸等;UPLC-MS/MS技術(shù)的應(yīng)用,將物質(zhì)鑒定數(shù)量更是提高到了155~427種[44-46]。

    關(guān)鍵滋味化合物的分析也隨著分子感官科學(xué)的不斷革新有了新的進(jìn)展,主要包括以下幾方面的技術(shù)。QDA表征醬油酸甜苦咸鮮以及濃厚六個(gè)維度的滋味強(qiáng)度,為分析滋味物質(zhì)基礎(chǔ)打下了良好的基礎(chǔ)。此外,滋味稀釋分析(TDA)[47]是一種基于凝膠色譜、HPLC分離,并通過(guò)感官分析連續(xù)稀釋級(jí)分,以在食品復(fù)雜的混合物中鑒定出最強(qiáng)烈的滋味化合物的技術(shù),它的應(yīng)用是食品關(guān)鍵滋味活性化合物分析的里程碑[48]。本團(tuán)隊(duì)采用該方法從醬油中鑒定得到了15條鮮味肽[49-50],然而該類(lèi)方法工作量大,研究周期相對(duì)較長(zhǎng)。此外,重組、缺失實(shí)驗(yàn)也被應(yīng)用到紅酒[51]和綠茶[52]上,用于鑒定其關(guān)鍵滋味化合物,而醬油中非揮發(fā)性化合物的種類(lèi)和數(shù)量眾多,如何將這一些技術(shù)更好地應(yīng)用于醬油值得關(guān)注。

    2.2 非揮發(fā)性化合物和滋味化合物研究

    對(duì)已發(fā)表的文獻(xiàn)總結(jié)發(fā)現(xiàn),在醬油中共檢測(cè)到230種非揮發(fā)性化合物,包括90種肽、49種有機(jī)酸、27種氨基酸及其衍生物、28種糖、11種糖醇、6種生物胺、4種核苷酸和16種其他類(lèi)化合物,結(jié)果見(jiàn)圖5,這些物質(zhì)分別構(gòu)成了醬油的酸、甜、苦、咸、鮮和濃厚味。

    圖5 醬油中不同種類(lèi)非揮發(fā)性化合物的數(shù)量Fig.5 Number of different types of non-volatile compounds in soy sauce

    2.2.1酸味物質(zhì)

    醬油的酸味主要貢獻(xiàn)者是種類(lèi)繁多的有機(jī)酸,包括揮發(fā)性和非揮發(fā)性的。非揮發(fā)性有機(jī)酸主要有乳酸、琥珀酸、酒石酸和檸檬酸等[41]。有機(jī)酸可以調(diào)和醬油的風(fēng)味,如乳酸可以賦予醬油圓潤(rùn)綿長(zhǎng)的口感,在醬油風(fēng)味中能夠緩解咸味[1],而Kong等[53]發(fā)現(xiàn),乳酸和焦谷氨酸能夠平衡中式醬油的滋味。

    2.2.2甜味物質(zhì)

    醬油甜味的主要來(lái)源是糖類(lèi)物質(zhì),如葡萄糖、半乳糖和果糖等單糖[54],他們來(lái)自原料營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的水解,此外,也有在調(diào)配過(guò)程中加入的蔗糖。早期采用HPLC等分離鑒定醬油中的糖類(lèi),而GC-MS衍生化法的應(yīng)用,可從醬油中鑒定出14~23種糖和糖醇類(lèi)化合物[41,55],糖醇類(lèi)化合物的滋味貢獻(xiàn)早期報(bào)道較少,如赤蘚糖醇、半乳糖醇、木糖醇和核糖醇等,值得進(jìn)一步探討。

    除糖與糖醇類(lèi)以外,還有一類(lèi)弱疏水性的氨基酸化合物為醬油貢獻(xiàn)甜味,如丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、絲氨酸等,其中丙氨酸具有較強(qiáng)的甜味,在中式和日式醬油中其濃度分別為丙氨酸呈味閾值(60 mg/100 mL)的2.9倍和6.2倍[4]。

    2.2.3苦味物質(zhì)

    氨基酸的滋味與其側(cè)鏈密切相關(guān),當(dāng)氨基酸具有強(qiáng)疏水性時(shí),大多數(shù)具有苦味,如組氨酸、蛋氨酸、纈氨酸、精氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。除此之外,還有多酚和部分的肽呈苦味,如崔春等[56]在2019年報(bào)道的醬油中16條小肽(分子質(zhì)量<1 000 Da,富含疏水性氨基酸)。本研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為這些苦味物質(zhì)及其衍生物在適宜的濃度范圍內(nèi),可能對(duì)醬油的濃厚味感具有積極的影響。

    2.2.4咸味物質(zhì)

    高濃度的NaCl(12%~18%)是醬油咸味特征的來(lái)源,是醬油中除水以外含量最高的化合物。在發(fā)酵過(guò)程中,高濃度的鹽能夠抑制有害微生物的生長(zhǎng),從而保證了醬油的風(fēng)味和品質(zhì)。近年來(lái),減鹽醬油的開(kāi)發(fā)也成為熱潮,如何在發(fā)酵過(guò)程采用控溫、微生物添加等技術(shù)來(lái)保證減鹽醬油的風(fēng)味品質(zhì)和安全生產(chǎn)是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

    2.2.5鮮味物質(zhì)

    醬油鮮味是其最重要的滋味特征,鮮味氨基酸谷氨酸和天冬氨酸一直是關(guān)注的重點(diǎn),主要來(lái)源于蛋白質(zhì)的分解,也有部分來(lái)源于調(diào)配階段所加入的鮮味劑——谷氨酸鈉。這也是醬油品質(zhì)指標(biāo)氨基酸態(tài)氮所反映的內(nèi)涵之一。此外,部分有機(jī)酸也具有增鮮作用,如琥珀酸[1]。

    然而,以上單體物質(zhì)的重組體系與醬油的鮮味輪廓仍有一定差距,隨著分離和鑒定技術(shù)的發(fā)展,研究人員逐漸發(fā)現(xiàn),食品中肽組分具有呈鮮或增強(qiáng)鮮味感知的能力。據(jù)Tamura等[57]發(fā)表于1989年的一份研究報(bào)告,從牛肉湯中分離鑒定得到一條呈鮮味的八肽Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala,在pH值6.5時(shí)其鮮味強(qiáng)度與谷氨酸鈉相當(dāng),然而后期Van Wassenaar等[58]和Hau[59]報(bào)道的結(jié)果與之有所矛盾。這些報(bào)道拉開(kāi)了呈味肽研究的序幕,2004年,Lioe等[38]研究了醬油中的呈味肽段,發(fā)現(xiàn)<500 Da的醬油組分鮮味最強(qiáng)。代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展解決了肽段結(jié)構(gòu)的解析難題,Yamamoto等[43]通過(guò)數(shù)學(xué)模型分析了醬油中237個(gè)二肽與滋味之間的相關(guān)性,得到5條與鮮味高度相關(guān)的二肽。本團(tuán)隊(duì)也采用不同的分離技術(shù)從醬油中分離出了鮮味肽,并分別鑒定了5條和10條鮮味肽結(jié)構(gòu)[49-50]。

    醬油的鮮味研究并不止步于此,還有更多的鮮味及鮮味增強(qiáng)物質(zhì)在不斷地被發(fā)現(xiàn)。2014年,Shiga等[45]在醬油中發(fā)現(xiàn)了一種美拉德反應(yīng)產(chǎn)物N-(1-deoxyfructos-1-yl)glutamic acid(Fru-Glu),其鮮味強(qiáng)度高于對(duì)應(yīng)濃度的谷氨酸。此外,F(xiàn)ru-pGlu、Fru-Val、pGlu-Gln、pGlu-Val、Lac-Glu、Lac-Leu等一系列氨基酸衍生物的新發(fā)現(xiàn)為醬油研究打開(kāi)了新方向,部分物質(zhì)已經(jīng)被驗(yàn)證具有鮮味增強(qiáng)作用[44,60-61]。由此可見(jiàn),醬油鮮味的秘密還未完全解開(kāi),仍值得深入探索。

    2.2.6濃厚味物質(zhì)

    酸甜苦咸鮮五種基本滋味無(wú)法全面概括醬油的滋味特征。Ueda等[62]在1990提出了一種新的滋味屬性 “kokumi”(濃厚味),是一種綿延感、飽滿感和厚重感的綜合味感,他們的研究表明:大蒜水提取物中的含硫化合物,特別是谷胱甘肽(γ-Glu-Cys-Gly)能夠增強(qiáng) kokumi 味。2013年,Kuroda等[46]首次證實(shí)醬油中存在γ-Glu-Val-Gly,說(shuō)明醬油的kokumi味可能與其肽及相關(guān)衍生物關(guān)系密切。

    2.3 香氣與滋味的交互作用研究

    風(fēng)味物質(zhì)的組成及其之間的相互作用共同決定了醬油的風(fēng)味效果。近些年來(lái),研究人員關(guān)注到醬油的香氣對(duì)滋味感知也有影響。Onuma等[63]和Chokumnoyporn等[64]研究發(fā)現(xiàn)將醬油香氣添加到NaCl溶液和食品體系中可以增強(qiáng)其咸味感知。為了進(jìn)一步探明互作的物質(zhì)基礎(chǔ),本團(tuán)隊(duì)采用氣相色譜-嗅聞/與滋味相關(guān)(GC-O/AT)技術(shù)明確了醬油中與咸/鮮味相關(guān)的香氣化合物,發(fā)現(xiàn)香氣與滋味特征存在一致性,并且3-甲硫基丙醛具有最強(qiáng)的增咸和增鮮作用[33]。醬油的滋味與滋味之間也存在交互作用。Imamura等[65]研究發(fā)現(xiàn)醬油中一種多糖能夠抑制鮮味回味,Kim等[66]在韓國(guó)醬油中分離得到的F05鮮味活性組分,能夠掩蔽部分苦味。未來(lái),食品的風(fēng)味交互作用仍有大量的空白區(qū)域值得深入探索。

    3 醬油的生理活性物質(zhì)及功能特性

    醬油中富含諸如類(lèi)黑精、呋喃類(lèi)化合物、異黃酮類(lèi)化合物、大豆多肽等生理活性物質(zhì),使得醬油在起到調(diào)味作用的同時(shí)也具有較好的功能特性,如抗氧化、抗癌、降血壓、降尿酸、抗過(guò)敏、抗血小板產(chǎn)生、抗白內(nèi)障等,其中前3種活性物質(zhì)的功能研究較為深入,甚至在臨床中已有應(yīng)用?,F(xiàn)將研究中發(fā)現(xiàn)的醬油生理活性物質(zhì)及功能特性歸納于表2。

    表2 醬油生理活性物質(zhì)及功能研究總結(jié)Tab.2 Summary of researches on physiological active substances and their functions in soy sauce

    3.1 抗氧化方面的作用

    通過(guò)體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,醬油是一種極為有效的抗氧化劑[6,80],新加坡國(guó)立大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn)醬油相對(duì)于咖喱醬、料酒等多種亞洲調(diào)味料,其抗氧化活性具有明顯優(yōu)勢(shì),特別是老抽,約為紅酒抗氧化活力的10倍左右。這與Li等[5]的研究結(jié)果相符,通過(guò)對(duì)41種市售醬油的基本成分和抗氧化活性分析,也發(fā)現(xiàn)老抽具有最高的抗氧化活性,PLS回歸分析表明醬油的抗氧化活性與褐變指數(shù)密切相關(guān);Wang等[67]發(fā)現(xiàn)麥芽酚和類(lèi)黑精等含碳水化合物的色素是醬油具有高抗氧化能力的主要原因。

    此外,大豆異黃酮的抗氧化活性也常常被關(guān)注,其可作用于氧自由基和脂過(guò)氧化物以預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等疾病[81]。Kinoshita等[71]利用HPLC從發(fā)酵醬油中分離得到了3種異黃酮衍生物,鑒定為大豆素、染料木素與8-羥基染料木素的衍生物;本團(tuán)隊(duì)采用UPLC-MS/MS揭示了15種大豆異黃酮在醬油制曲和醬醪發(fā)酵全過(guò)程的變化規(guī)律,發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵的進(jìn)行,大豆異黃酮從苷類(lèi)異黃酮逐漸轉(zhuǎn)化為高活性的苷元類(lèi)黃酮以及羥基異黃酮,且在發(fā)酵過(guò)程中,羥基大豆苷元的抗氧化活力貢獻(xiàn)約為大豆苷元的100~500倍,屬于“少量關(guān)鍵”的功能性物質(zhì)。Kataoka等[68]的實(shí)驗(yàn)表明HEMF、HDMF、HMF這類(lèi)呋喃酮類(lèi)化合物具有抗氧化作用,且發(fā)現(xiàn)HEMF、HDMF比抗壞血酸的抗氧化效果更好,其活性分別為抗壞血酸的1.52倍和1.28倍;Chen等[69]通過(guò)分離純化大豆蛋白水解物和硫氰酸鐵法將多肽Leu-Leu-Pro-His-His判定為抗氧化肽;Yang等[70]發(fā)現(xiàn)醬糟蛋白水解物的抗氧化活性較佳,可能與其抗氧化氨基酸Try、Met、His、Lys和Trp含量較高有關(guān)。

    3.2 抗癌方面的作用

    醬油中活性成分的抗癌作用與抗氧化作用具有相關(guān)性[82],如異黃酮和呋喃酮等。大豆苷被發(fā)現(xiàn)對(duì)ZR-75-1乳癌具有抗增殖的作用,而染料木苷與哺乳動(dòng)物腫瘤減少有著極大的相關(guān)性[83];醬油中含有的呋喃酮類(lèi)化合物也具有抗癌作用,Nagahara等[8]早在1991年便驗(yàn)證了HEMF能抑制BP 誘導(dǎo)老鼠胃瘤形成,此后Kataoka等[68]在1997年證實(shí)了HMF和HDMF具有同樣的效果,其中HDMF是抗癌能力最強(qiáng)的成分。此外,威斯康星大學(xué)食品研究所發(fā)現(xiàn)醬油中含有的綴合亞油酸能有效地抑制皮膚癌和胃癌[84];李瑩等[7]采用柱層析色譜分離技術(shù)從發(fā)酵醬油弱極性部分中分離鑒定出了4種具有醌還原酶(QR)誘導(dǎo)活性的化合物,進(jìn)而誘導(dǎo)Ⅱ相酶從而實(shí)現(xiàn)對(duì)癌癥的預(yù)防作用[85],主要包括兒茶酚、大豆苷元、flazin和perlolyrin。

    3.3 降血壓方面的作用

    對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)的抑制效果為評(píng)估降血壓活性的常用指標(biāo)。黃驪虹[72]研究表明大豆多肽可抑制ACE的作用;Hata等[86]和Kawasaki等[73]陸續(xù)發(fā)現(xiàn)無(wú)鹽醬油中部分肽段如Ile-Pro-Pro、Val-Pro-Pro和Val-Tyr對(duì)于輕度高血壓患者具有降壓作用。此外,Kinoshita等[9]在醬油中發(fā)現(xiàn)了具有ACE抑制活性的成分——煙酰胺。

    3.4 降尿酸方面的作用

    Li等[74]發(fā)現(xiàn)醬油(1.8 mL/kg)可以有效降低氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥大鼠血清中的尿酸水平,并認(rèn)為降低血清尿酸水平的機(jī)制之一可能是抑制了血清黃嘌呤氧化酶(XOD)的活性。隨后其以XOD抑制活性為導(dǎo)向,通過(guò)硅膠柱層析、凝膠柱層析及半制備HPLC分離等一系列的方法從醬油中分離純化得到10種活性化合物,其中flazin的XOD抑制活性最強(qiáng),且為首次報(bào)道,IC50值為0.51 mM,其次,鄰苯二酚、染料木素和3,4-二羥基肉桂酸乙酯均有較強(qiáng)的XOD抑制活性,作者還進(jìn)一步揭示了這些關(guān)鍵活性化合物的作用機(jī)制和相互作用。

    3.5 其他方面的作用

    Kobayashi[10]發(fā)現(xiàn)醬油多糖具有抗過(guò)敏的作用;Sasaki等[75]發(fā)現(xiàn)HEMF、HDMF和HMF在具有抗氧化和抗癌作用的同時(shí),還兼具抗白內(nèi)障的作用。除此之外,醬油中的活性成分還具有促進(jìn)胃液分泌、抗貧血及降血脂的作用。

    4 展 望

    整體而言,關(guān)于醬油的風(fēng)味物質(zhì)和功能活性已有大量研究報(bào)道,關(guān)鍵物質(zhì)的揭示將為其品質(zhì)調(diào)控提供明確的目標(biāo)和方向,如何全面地解析這些成分、確定關(guān)鍵活性化合物,并對(duì)其進(jìn)行有效的調(diào)控,一直是調(diào)味品行業(yè)的研究熱點(diǎn)。同時(shí),未來(lái)仍有許多值得深入探索的地方,如醬油鮮味的秘密,如何進(jìn)一步挖掘增鮮肽等鮮味物質(zhì)基礎(chǔ)并定向調(diào)控富集,風(fēng)味的交互作用如何影響醬油的產(chǎn)品品質(zhì),以及醬油風(fēng)味功能菌的分離鑒定、交互研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用,都是醬油企業(yè)及傳統(tǒng)發(fā)酵行業(yè)需要繼續(xù)關(guān)注的研究方向。相信隨著檢測(cè)技術(shù)和分析方法的不斷發(fā)展,基于多組學(xué)技術(shù)聯(lián)合的釀造工藝升級(jí)和品質(zhì)定向調(diào)控將不斷突破,更有利于系統(tǒng)解密醬油釀造,進(jìn)一步增強(qiáng)發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)的調(diào)控效果。

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