油橄欖提取物復(fù)配左旋肉堿酒石酸鹽抗疲勞功能及安全性評(píng)價(jià)

侯興琳，吳曉霞，蘭 瑩，*，劉皓淼，車佳行

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西師范大學(xué) 食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710062；3.西安交通大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，陜西 西安 710062)

機(jī)體在長時(shí)間持續(xù)運(yùn)動(dòng)或者高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)的情況下會(huì)產(chǎn)生疲勞現(xiàn)象。疲勞不僅會(huì)造成工作能力下降，同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生一系列繼發(fā)性問題，比如抑郁、焦慮、睡眠質(zhì)量差、能量失衡等。長期處于疲勞狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致內(nèi)分泌紊亂和免疫力下降，從而引發(fā)疾病、危害健康[1]。隨著人們生活節(jié)奏的加快，疲勞引發(fā)的健康問題也越來越顯著，研究具有抗疲勞功能的保健產(chǎn)品可以幫助預(yù)防和改善由于疲勞而引發(fā)的一系列健康問題。

油橄欖(Oleaeuropaea)為木犀科木犀欖屬喬木，是世界著名的優(yōu)質(zhì)油料植物[2]。研究發(fā)現(xiàn)：油橄欖提取物中富含橄欖苦苷、黃酮類物質(zhì)和羥基酪醇等多酚類物質(zhì)[3]，具有多種藥理活性，如抗氧化、降血糖、抗菌抗炎、保護(hù)器官和骨骼等；油橄欖還具有促進(jìn)血液循環(huán)、促進(jìn)消化吸收、加快內(nèi)分泌、清除自由基等功能[4-5]。自由基增多造成的氧化應(yīng)激是引發(fā)疲勞的主要原因之一[6]。研究表明，清除自由基、抗氧化是某些天然物質(zhì)發(fā)揮其抗疲勞功能的有效機(jī)制[7-8]。油橄欖中的羥基酪醇等多酚類物質(zhì)具有很好的抗氧化效果，可以增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力[9]，說明油橄欖具有延緩疲勞的潛力。近年來，與油橄欖功能有關(guān)的研究主要集中在抗氧化、抗菌抗炎等方面，與抗疲勞功能相關(guān)的研究鮮有報(bào)道。左旋肉堿又稱維生素BT，是一種類維生素樣營養(yǎng)素，具有減肥、延緩衰老、消除脂肪肝、促進(jìn)嬰兒生長發(fā)育等多種生理功能[10]，除此之外，研究表明，左旋肉堿也具有一定的抗疲勞作用[11]。左旋肉堿酒石酸鹽是左旋肉堿的穩(wěn)定形式和理想應(yīng)用形式，尤其適用于膠囊劑和片劑。本研究擬將油橄欖提取物和左旋肉堿酒石酸鹽復(fù)配，并根據(jù)我國《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(衛(wèi)生部2003年版)[12]的規(guī)定進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，通過小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)及小鼠血尿素氮、肝糖原、血乳酸含量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)，考察復(fù)配物的抗疲勞功能；對(duì)油橄欖復(fù)配物進(jìn)行毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)，研究油橄欖復(fù)配物的安全性，希望為開發(fā)抗疲勞功能相關(guān)產(chǎn)品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油橄欖提取物(羥基酪醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.2%，總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.1%，總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11.5%，水分及揮發(fā)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.3%，灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.3%)、左旋肉堿酒石酸鹽，江蘇奧福生物科技有限公司；玉米淀粉，河南省新鄉(xiāng)市新良食品公司。鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株TA97、TA98、TA100和TA102及大鼠肝S9代謝活化系統(tǒng)，美國Moltox公司；敵克松、2-氨基芴、疊氮化鈉、1,8-二羥基蒽醌，美國Sigma公司；柔毛霉素、絲裂霉素C，上海源葉生物科技有限公司；環(huán)磷酰胺，山西普德藥業(yè)有限公司。肝糖原檢測(cè)試劑盒、血乳酸檢測(cè)試劑盒，南京建成賽浩科技有限公司；血液生化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)試劑盒，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。實(shí)驗(yàn)采用的試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明種小鼠和SD大鼠，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(陜)2012-003。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房為屏障系統(tǒng)，使用許可證號(hào)：SYXK(陜)2012-006，溫度20～25℃，相對(duì)濕度45%～65%。動(dòng)物飼料使用標(biāo)準(zhǔn)飼料(LAD3001M)，購于南通特洛菲飼料科技有限公司。

1.3 主要儀器及設(shè)備

自制游泳箱(50 cm×50 cm×50 cm)；JD500-2型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；UV-7504型紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；BC-2800vet型血細(xì)胞分析儀、BS-420型全自動(dòng)生化分析儀，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；LW200LT型顯微鏡，德國Leica公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市城西春蘭實(shí)驗(yàn)儀器廠；BF240型恒溫培養(yǎng)箱，德國Binder公司；TGL-16C型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；MS-3型旋渦振蕩混合器，德國IKA公司。

1.4 油橄欖復(fù)配物的制備

為了便于在實(shí)驗(yàn)過程中定量給小鼠灌胃受試物，先將受試物制作成固定質(zhì)量的膠囊。每粒膠囊的質(zhì)量為0.35 g，其中油橄欖提取物質(zhì)量占36%，左旋肉堿酒石酸鹽質(zhì)量占20%，玉米淀粉質(zhì)量占44%。

1.5 抗疲勞功能實(shí)驗(yàn)

1.5.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取游泳姿勢(shì)正確的雄性小鼠160只，分為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組40只小鼠，并隨機(jī)分為4小組。油橄欖復(fù)配物灌胃劑量(以體重計(jì))設(shè)計(jì)為高(1.05 g/kg)、中(0.70 g/kg)、低(0.35 g/kg)3個(gè)劑量組[13](低劑量組相當(dāng)于人體攝入28 mg/kg[14])，另設(shè)陰性對(duì)照組(蒸餾水)。每小組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)為10只。4個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別進(jìn)行負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)、血尿素氮實(shí)驗(yàn)、肝糖原實(shí)驗(yàn)、血乳酸實(shí)驗(yàn)。將油橄欖復(fù)配物與蒸餾水混合制成混懸液，按設(shè)定的劑量每天灌胃一次，灌胃體積(以體重計(jì))為20 mL/kg；陰性對(duì)照組給予等體積蒸餾水，連續(xù)灌胃30 d后，分別進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。

1.5.2小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)

對(duì)小鼠連續(xù)灌胃30 d，于末次灌胃30 min后，在小鼠尾根部負(fù)荷相當(dāng)于其5%體重的鉛皮。將小鼠置于水溫25 ℃、水深35 cm的游泳箱中游泳，小鼠負(fù)重游泳時(shí)間為小鼠入水至力竭而沉入水中并持續(xù)8 s不能浮出水面的時(shí)間。

1.5.3小鼠血尿素氮含量測(cè)定

對(duì)小鼠連續(xù)灌胃30 d，于末次灌胃30 min后，讓小鼠在溫度為30 ℃的水中不負(fù)重游泳90 min。讓小鼠休息60 min后，拔眼球采全血約0.5 mL(不加抗凝劑)，2 000 r/min離心15 min，取血清，用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行血尿素氮測(cè)定。

1.5.4小鼠肝糖原含量測(cè)定

對(duì)小鼠連續(xù)灌胃30 d，于末次灌胃30 min后，頸椎脫臼處死動(dòng)物，解剖取出肝臟，生理鹽水清洗，濾紙吸干后，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書測(cè)定肝糖原含量。

1.5.5小鼠血乳酸含量測(cè)定

對(duì)小鼠連續(xù)灌胃30 d，于末次灌胃30 min后，小鼠不負(fù)重在溫度30 ℃的水中游泳10 min后停止。分別于游泳前、游泳后0 min和游泳后20 min，眼眶靜脈叢采全血20 μL。采用試劑盒測(cè)定血乳酸含量，計(jì)算3個(gè)時(shí)間點(diǎn)血乳酸曲線下面積。

1.6 油橄欖復(fù)配物的安全性評(píng)價(jià)方法

1.6.1大鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)

選用SD大鼠20只，雌雄各半，體重為180～220 g。根據(jù)最大耐受劑量法[12]確定灌胃劑量為16.0 g/kg(相當(dāng)于人體攝入2.6 g/kg[14])，灌胃體積為20 mL/kg。對(duì)大鼠按一次經(jīng)口灌胃給予樣品，灌胃前16 h禁食，不限飲水。觀察14 d內(nèi)大鼠的中毒癥狀及死亡情況，實(shí)驗(yàn)第1天、第7天、第14天稱量質(zhì)量，最后處死動(dòng)物作大體解剖。

1.6.2遺傳毒性實(shí)驗(yàn)

1.6.2.1 Ames實(shí)驗(yàn)

采用鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株TA97、TA98、TA100和TA102，進(jìn)行加與不加S9的標(biāo)準(zhǔn)平皿滲入法實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)5個(gè)油橄欖復(fù)配物劑量組：5 000、1 000、200、40、8 μg/皿，同時(shí)設(shè)自發(fā)對(duì)照、溶劑對(duì)照(蒸餾水)和陽性對(duì)照組。不加S9實(shí)驗(yàn)的陽性對(duì)照物為50.0 μg/皿的敵克松(TA97)、6.0 μg/皿的柔毛霉素(TA98)、1.5 μg/皿的疊氮化鈉(TA100)、0.5 μg/皿的絲裂霉素C(TA102)；加S9實(shí)驗(yàn)陽性對(duì)照物為50 μg/皿的1,8-二羥基蒽醌(TA102)和10 μg/皿的2-氨基芴(TA97、TA98、TA100)。每皿加入陽性對(duì)照物的體積為0.1 mL，每個(gè)實(shí)驗(yàn)劑量做3個(gè)平行皿，重復(fù)實(shí)驗(yàn)1次。

1.6.2.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核率的計(jì)算

選取雌雄各半、體重為25～30 g的昆明種小鼠50只，將小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)設(shè)高(10.0 g/kg)、中(5.0 g/kg)、低(2.5 g/kg)3個(gè)油橄欖復(fù)配物劑量組，另設(shè)溶劑對(duì)照組(蒸餾水)和環(huán)磷酰胺陽性對(duì)照組(CP，40 mg/kg)。采用30 h給受試物法對(duì)小鼠經(jīng)口灌胃，首次灌胃后間隔24 h進(jìn)行第2次灌胃，6 h后處死動(dòng)物，取股骨骨髓進(jìn)行制片，Giemsa染色后鏡檢。每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞(PCE)，觀察含有微核的嗜多染紅細(xì)胞數(shù)，計(jì)算微核率；同時(shí)觀察200個(gè)紅細(xì)胞中PCE和成熟紅細(xì)胞(NCE)所占數(shù)目，并計(jì)算PCE/NCE值。

1.6.2.3 小鼠精子畸形率的計(jì)算

選取體重為25～35 g雄性昆明種小鼠50只，分組及劑量設(shè)計(jì)同小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)。各組均按灌胃體積為20 mL/kg經(jīng)口灌胃，每日1次，連續(xù)5 d。首次灌胃后第35天頸椎脫臼法處死小鼠，制備精子標(biāo)本，1%伊紅染色。高倍鏡下觀察，每只動(dòng)物計(jì)數(shù)1 000個(gè)精子，記錄精子畸形數(shù)、畸形類型，并計(jì)算精子畸形率。

1.6.3大鼠中毒情況監(jiān)測(cè)和組織病理學(xué)檢查

選用雌雄各半、體重為65～92 g的SD大鼠80只，隨機(jī)分為4組，每組20只，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)設(shè)高(3.50 g/kg)、中(1.75 g/kg)、低(0.88 g/kg)3個(gè)油橄欖復(fù)配物劑量組，另設(shè)溶劑對(duì)照組(蒸餾水)。灌胃體積為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)灌胃30 d。觀察動(dòng)物的一般表現(xiàn)、行為、中毒癥狀及死亡情況。每周稱量1次大鼠體重和2次進(jìn)食量，計(jì)算食物利用率。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，摘眼球取血，用血細(xì)胞分析儀測(cè)定血液學(xué)指標(biāo)，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血液生化學(xué)指標(biāo)。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脫頸椎處死，進(jìn)行大體解剖，觀察內(nèi)臟改變，稱量肝、腎、脾、睪丸濕重，計(jì)算其臟體比，取肝、腎、脾、胃腸、睪丸(卵巢)作組織病理學(xué)檢查。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水。

1.7 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和兩兩比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 油橄欖復(fù)配物抗疲勞功能分析

2.1.1油橄欖復(fù)配物對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響

運(yùn)動(dòng)耐力的高低是機(jī)體抗疲勞能力最直接且客觀的表現(xiàn)，小鼠負(fù)重游泳時(shí)間越長表明小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力越強(qiáng)[15]。小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1，由圖1可知，與陰性對(duì)照組相比，油橄欖復(fù)配物各劑量組小鼠的平均負(fù)重游泳時(shí)間均延長，且高劑量組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間顯著延長(P<0.05)，表明了油橄欖復(fù)配物能夠顯著延長小鼠的負(fù)重游泳時(shí)間，具有抗疲勞功效，并且抗疲勞作用會(huì)隨著油橄欖復(fù)配物劑量增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。

2.1.2油橄欖復(fù)配物對(duì)小鼠血尿素氮含量的影響

*表示與陰性對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05)。圖1 油橄欖復(fù)配物對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響Fig.1 Effect of Olea europaea compounds on weight loading swimming time of mice

小鼠血尿素氮含量測(cè)定結(jié)果見圖2，圖2顯示，小鼠無負(fù)重游泳90 min后，與陰性對(duì)照組相比，油橄欖復(fù)配物各劑量組小鼠血尿素氮含量均降低，其中高劑量組血尿素氮含量顯著降低(P<0.05)，中劑量組血尿素氮含量極顯著降低(P<0.01)。機(jī)體劇烈運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致肌糖原和脂肪供應(yīng)不足，從而增強(qiáng)蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝，產(chǎn)生血尿素氮，血尿素氮含量與疲勞程度呈現(xiàn)正相關(guān)[16]，圖2說明油橄欖復(fù)配物可以通過降低血尿素氮含量發(fā)揮抗疲勞作用。

*表示與陰性對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05)；**表示與陰性對(duì)照組相比有極顯著性差異(P<0.01)。圖2 油橄欖復(fù)配物對(duì)小鼠血尿素氮含量的影響Fig.2 Effect of Olea europaea compounds on blood urea nitrogen content in mice

2.1.3油橄欖復(fù)配物對(duì)小鼠肝糖原含量的影響

運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間影響著機(jī)體中肝糖原的分解速度，當(dāng)機(jī)體長時(shí)間劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，血糖會(huì)大量消耗，中樞神經(jīng)供能不足，從而引起疲勞；而同時(shí)機(jī)體為了平衡血糖，會(huì)加快肝糖原的分解，所以肝糖原的儲(chǔ)備量可以間接反映機(jī)體的疲勞程度[17]。小鼠肝糖原含量測(cè)定結(jié)果見圖3，圖3顯示，與陰性對(duì)照組相比，油橄欖復(fù)配物各劑量組小鼠肝糖原的儲(chǔ)備量均增加，說明油橄欖復(fù)配物有通過增加肝糖原儲(chǔ)備量發(fā)揮抗疲勞作用的趨勢(shì)，但差異未達(dá)到顯著(P>0.05)。

圖3 油橄欖復(fù)配物對(duì)小鼠肝糖原含量的影響Fig.3 Effect of Olea europaea compounds on hepatic glycogen content in mice

2.1.4油橄欖復(fù)配物對(duì)小鼠血乳酸含量的影響

機(jī)體過度運(yùn)動(dòng)時(shí)，缺氧會(huì)引起無氧酵解，乳酸含量增加，使機(jī)體產(chǎn)生疲勞感，因此血乳酸含量是反映機(jī)體疲勞程度的重要指標(biāo)之一[18]。小鼠血乳酸含量測(cè)定結(jié)果見表1，表1顯示，小鼠無負(fù)重游泳10 min后，與陰性對(duì)照組相比，油橄欖復(fù)配物各劑量組小鼠血乳酸含量均降低，且高劑量組血乳酸含量顯著降低(P<0.05)，說明油橄欖復(fù)配物可以通過降低血乳酸含量來延緩疲勞的產(chǎn)生。

表1 油橄欖復(fù)配物對(duì)小鼠血乳酸含量的影響Tab.1 Effect of Olea europaea compounds on blood lactic acid content in mice

2.2 油橄欖復(fù)配物毒理學(xué)安全性分析

2.2.1油橄欖復(fù)配物急性毒性分析

急性毒性實(shí)驗(yàn)過程中大鼠體重變化見圖4，由圖4可見，以16.0 g/kg劑量的油橄欖復(fù)配物灌胃后，大鼠體重未受到影響，生長狀況良好。實(shí)驗(yàn)中未見動(dòng)物有明顯中毒癥狀，觀察14 d動(dòng)物無死亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)束對(duì)動(dòng)物進(jìn)行大體解剖，觀察心、肝、肺、腎、脾、胃等主要臟器均未見明顯異常改變。結(jié)果表明，油橄欖復(fù)配物對(duì)大鼠無急性毒性。

圖4 大鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Results of acute toxicity test in rat

2.2.2油橄欖復(fù)配物遺傳毒性分析

2.2.2.1 油橄欖復(fù)配物對(duì)Ames實(shí)驗(yàn)的影響

油橄欖復(fù)配物Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2、表3。由表2、表3可知，對(duì)鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株TA97、TA98、TA100和TA102，無論S9是否加入，油橄欖復(fù)配物各劑量組的平均回變菌落數(shù)均未超過自發(fā)回變菌落數(shù)的2倍，也未呈現(xiàn)劑量相關(guān)性，表明油橄欖復(fù)配物對(duì)鼠傷寒沙門氏菌組氨酸缺陷型菌株TA97、TA98、TA100、TA102不具有致突變作用。

表2 第1次Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of the first Ames test

表3 第2次Ames實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of the second Ames test

2.2.2.2 油橄欖復(fù)配物對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核的影響

小鼠骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，由表4可見，油橄欖復(fù)配物各劑量組的PCE/NCE值與溶劑對(duì)照組相比均沒有顯著差異(P>0.05)，而且PCE占紅細(xì)胞總數(shù)的比例均不少于溶劑對(duì)照組的20%，表明油橄欖復(fù)配物未對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞分裂產(chǎn)生抑制。與溶劑對(duì)照組相比，陽性對(duì)照組的微核率有極顯著差異(P<0.01)，表明陽性對(duì)照物具有明顯的致突變作用；而油橄欖復(fù)配物各劑量組小鼠的骨髓細(xì)胞微核率均沒有顯著變化(P>0.05)，且無劑量相關(guān)性。結(jié)果表明，油橄欖復(fù)配物對(duì)兩性小鼠的骨髓細(xì)胞微核發(fā)生率無明顯影響，未見致突變作用。

表4 油橄欖復(fù)配物對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核的影響Tab.4 Effect of Olea europaea compounds on micronucleus of bone marrow cells in mice

2.2.2.3 油橄欖復(fù)配物對(duì)小鼠精子畸形的影響

小鼠精子畸形實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5，由表5可見，油橄欖復(fù)配物未改變小鼠精子畸形發(fā)生率，與溶劑對(duì)照組相比，油橄欖復(fù)配物各劑量組小鼠的精子畸形率均無顯著差異(P>0.05)，而陽性對(duì)照組與溶劑對(duì)照組的差異極顯著(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，油橄欖復(fù)配物對(duì)雄性小鼠的精子沒有致畸作用。

表5 油橄欖復(fù)配物對(duì)小鼠精子畸形的影響Tab.5 Effect of Olea europaea compounds on sperm abnormality in mice

2.2.3油橄欖復(fù)配物30 d喂養(yǎng)安全性分析

實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物健康狀況良好，體重持續(xù)增長，油橄欖復(fù)配物各劑量組動(dòng)物未出現(xiàn)中毒癥狀，均未發(fā)生死亡。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(衛(wèi)生部2003年版)[12]中的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)30 d喂養(yǎng)過程中大鼠體重、進(jìn)食量、食物利用率以及30 d喂養(yǎng)結(jié)束后大鼠血液學(xué)、血液生化學(xué)、臟器質(zhì)量及臟器/體重比值、組織病理學(xué)等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

2.2.3.1 油橄欖復(fù)配物對(duì)大鼠體重、進(jìn)食量及食物利用率的影響

30 d喂養(yǎng)期間大鼠體重、進(jìn)食量及食物利用率見表6至表8。由表6至表8可見，以高(3.50 g/kg)、中(1.75 g/kg)、低(0.88 g/kg)劑量的油橄欖復(fù)配物連續(xù)灌胃30 d，油橄欖復(fù)配物各劑量組與溶劑對(duì)照組比較，雌雄大鼠每周的體重、進(jìn)食量、食物利用率，總進(jìn)食量、總食物利用率均無顯著差異(P>0.05)，表明油橄欖復(fù)配物對(duì)大鼠的體重增長、進(jìn)食量和食物利用率無明顯影響。

表6 油橄欖復(fù)配物對(duì)大鼠1～4周體重的影響Tab.6 Effect of Olea europaea compounds on weight of rat at 1-4 weeks g

2.2.3.2 油橄欖復(fù)配物對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

大鼠血液學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見表9。由表9可見，以高(3.50 g/kg)、中(1.75 g/kg)、低(0.88 g/kg)劑量的油橄欖復(fù)配物連續(xù)灌胃30 d，油橄欖復(fù)配物各劑量組雌雄大鼠的白細(xì)胞總數(shù)、紅細(xì)胞總數(shù)、血紅蛋白含量、粒細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比、單核細(xì)胞百分比等指標(biāo)與溶劑對(duì)照組比較，均無顯著性差異(P>0.05)，表明油橄欖復(fù)配物對(duì)大鼠的血液學(xué)指標(biāo)無明顯影響。

表9 油橄欖復(fù)配物對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響Tab.9 Effect of Olea europaea compounds on hematology indexes in rat

2.2.3.3 油橄欖復(fù)配物對(duì)大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)的影響

大鼠血液生化學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見表10、表11。由表10、表11可見，以高(3.50 g/kg)、中(1.75 g/kg)、低(0.88 g/kg)劑量的油橄欖復(fù)配物連續(xù)灌胃30 d，油橄欖復(fù)配物各劑量組雌雄大鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、總蛋白、白蛋白、肌酐、尿素氮、膽固醇、血糖、甘油三酯等指標(biāo)與溶劑對(duì)照組比較，均無顯著性差異(P>0.05)，表明油橄欖復(fù)配物對(duì)大鼠的血液生化指標(biāo)無明顯影響。

表10 油橄欖復(fù)配物對(duì)大鼠血液中轉(zhuǎn)氨酶和蛋白含量的影響Tab.10 Effect of Olea europaea compounds on transaminase and protein content in blood of rat

表11 油橄欖復(fù)配物對(duì)大鼠血液中糖、肌酐、尿素氮、膽固醇、甘油三酯含量的影響Tab.11 Effect of Olea europaea compounds on sugar,creatinine,urea nitrogen,cholesterol and triglyceride content in blood of rat mmol/L

2.2.3.4 油橄欖復(fù)配物對(duì)大鼠臟器質(zhì)量及臟器/體重比值的影響

大鼠臟器質(zhì)量及臟器/體重比值測(cè)定結(jié)果見表12、表13。由表12、表13可見，以高(3.50 g/kg)、中(1.75 g/kg)、低(0.88 g/kg)劑量的油橄欖復(fù)配物連續(xù)灌胃30 d，油橄欖復(fù)配物各劑量組大鼠的肝、腎、脾質(zhì)量、雄鼠睪丸質(zhì)量和肝/體重比值、腎/體重比值、脾/體重比值、雄鼠睪丸/體重比值與溶劑對(duì)照組比較，均無顯著差異(P>0.05)，表明油橄欖復(fù)配物對(duì)大鼠的臟器質(zhì)量及臟器/體重比值無明顯影響。

表12 油橄欖復(fù)配物對(duì)大鼠臟器質(zhì)量的影響Tab.12 Effect of Olea europaea compounds on viscera weight in rat g

表13 油橄欖復(fù)配物對(duì)大鼠臟器/體重比值的影響Tab.13 Effect of Olea europaea compounds on ratio of viscera to body weight in rat %

2.2.3.5 油橄欖復(fù)配物對(duì)大鼠組織病理狀態(tài)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死動(dòng)物，進(jìn)行大體解剖，觀察結(jié)果顯示，大鼠組織器官發(fā)育良好，外觀顏色和臟器大小正常，無滲出、增生、水腫、萎縮等病變。對(duì)高劑量組和溶劑對(duì)照組主要臟器肝、脾、腎、胃、腸、睪丸、卵巢等取材做組織病理檢查，結(jié)果見圖5。圖5(c)、(d)顯示，溶劑對(duì)照組雌鼠共有2例輕度肝小葉空泡變；圖5(e)、(f)顯示，溶劑對(duì)照組雄鼠共有2例輕度肝小葉空泡變；圖5(g)、(h)顯示，高劑量組雌鼠共有2例輕度肝小葉空泡變；圖5(i)顯示，高劑量組雄鼠共有1例輕度肝小葉空泡變；其余組織均未見異常，變化均在正常形態(tài)學(xué)范圍內(nèi)。

(a)、(b)為正常大鼠肝臟切片；(c)、(d)為溶劑對(duì)照組雌鼠2例輕度空泡變；(e)、(f)為溶劑對(duì)照組雄鼠2例輕度空泡變；(g)、(h)為高劑量組雌鼠2例輕度空泡變；(i)為高劑量組雄鼠1例輕度空泡變。圖片中箭頭指向的是輕度肝小葉空泡變。圖5 油橄欖復(fù)配物對(duì)大鼠肝臟組織病理狀態(tài)的影響Fig.5 Effect of Olea europaea compounds on histology of liver in rat

3 結(jié) 論

本研究連續(xù)30 d采用油橄欖復(fù)配物樣品對(duì)小鼠灌胃，并進(jìn)行小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)，對(duì)小鼠的血尿素氮、肝糖原、血乳酸含量進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：油橄欖復(fù)配物可以顯著延長高劑量組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間(P<0.05)，顯著降低其血乳酸含量和血尿素氮含量(高劑量組P<0.05，中劑量組P<0.01)。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(衛(wèi)生部2003年版)[12]可以判定，油橄欖復(fù)配物具有明顯的抗疲勞功能。本研究與已有研究(左旋肉堿灌胃劑量為600 mg/kg)[19]相比，無論是在動(dòng)物行為學(xué)(負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn))還是血液生化學(xué)(血尿素氮含量)方面，油橄欖提取物與左旋肉堿酒石酸鹽復(fù)配之后的抗疲勞效果都要優(yōu)于左旋肉堿的單獨(dú)作用，說明油橄欖提取物可以取代部分左旋肉堿發(fā)揮抗疲勞作用并且效果更佳。通過急性毒性實(shí)驗(yàn)、遺傳毒性實(shí)驗(yàn)、大鼠30 d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)對(duì)油橄欖復(fù)配物進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示：油橄欖復(fù)配物無急性毒性和遺傳毒性；30 d喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)期間油橄欖復(fù)配物各劑量組動(dòng)物的體重、進(jìn)食量、食物利用率、血液學(xué)指標(biāo)、血液生化學(xué)指標(biāo)、臟器質(zhì)量及臟器/體重比值等均無顯著改變(P>0.05)；大體解剖觀察和組織病理學(xué)檢查均未見異常改變，并且在受試范圍內(nèi)未觀察到其他毒副作用。由此可見，油橄欖復(fù)配物無不良影響，具有較高的安全性。希望本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以為科學(xué)高效地利用油橄欖，開發(fā)具有抗疲勞功能的產(chǎn)品提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

除了氧化應(yīng)激之外，能量耗竭和代謝產(chǎn)物積累也是疲勞產(chǎn)生的可能機(jī)制[20-21]。本實(shí)驗(yàn)雖然驗(yàn)證了油橄欖復(fù)配物具有抗疲勞作用，但無法確定油橄欖提取物中抗疲勞成分是否為羥基酪醇，并且其分子機(jī)制尚不明確，這也為我們提供了更多的研究思路，比如提取油橄欖中的羥基酪醇，開展油橄欖抗疲勞的分子機(jī)制相關(guān)研究。