酶輔助乳化制備姜黃素脂肪乳研究

江連洲 孫銘悅 佟曉紅 成曉祎 崔文玉 王 歡

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030)

0 引言

姜黃素(Curcumin, CUR)是姜黃的天然多酚化合物，具有多種生物活性，例如抗氧化、抗增殖、抗炎和抗癌特性。姜黃素對(duì)pH值和溫度較敏感，故易于氧化和化學(xué)降解，其生物利用度較低，導(dǎo)致其應(yīng)用受到極大的限制[1]。因此，需要采取一些有效的手段將這種化合物應(yīng)用于食品中，并實(shí)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)遞送。文獻(xiàn)[2]制備了姜黃素納米乳液，研究表明納米乳液可以實(shí)現(xiàn)姜黃素的包埋和運(yùn)載，且穩(wěn)定性較好。文獻(xiàn)[3]研究表明，在140℃下將過量的姜黃素添加到一定量的香精油中溶解，不會(huì)引起姜黃素的降解。這些為酶法輔助制備負(fù)載姜黃素的新型大豆脂肪乳提供了基礎(chǔ)。

基于乳液的遞送系統(tǒng)在生物活性營(yíng)養(yǎng)素運(yùn)載中起著重要作用。常規(guī)乳液是熱力學(xué)不穩(wěn)定的體系，存在許多物理化學(xué)機(jī)制(如奧斯特瓦爾德熟化、絮凝、乳化和聚結(jié))，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，其穩(wěn)定性逐漸降低[4]。脂肪乳是一種將脂質(zhì)以小液滴狀分散在水中，形成非均相的水包油(O/W)型乳液，能夠明顯提高疏水生物活性物質(zhì)在水溶液中的溶解度和生物利用度[5]。近年來，研究表明，將脂肪乳作為溶劑與某些活性物質(zhì)組合能達(dá)到控釋的目的[6]。文獻(xiàn)[7]利用大豆卵磷脂作為乳化劑，以大豆油為油相，通過高速剪切和高壓均質(zhì)制備了姜黃素脂肪乳。

制備乳液低耗能方法之一的相轉(zhuǎn)變溫度法是利用體系內(nèi)部發(fā)生相變所釋放的化學(xué)能實(shí)現(xiàn)乳化，然而，相比于超聲、高壓均質(zhì)和研磨法，這種相轉(zhuǎn)變溫度法制備的乳液穩(wěn)定性差、使用局限性較大。文獻(xiàn)[8]利用生物酶酶解大豆粉過程中得到的優(yōu)質(zhì)組分蛋白(或肽)和磷脂作為天然乳化劑，吸附在油、水界面，并降低界面張力，可以形成天然且穩(wěn)定的水包油(O/W)型乳液體系，這種低能乳液即為相轉(zhuǎn)變溫度法產(chǎn)生的乳液。但有關(guān)利用生物酶輔助相轉(zhuǎn)變溫度法制備脂肪乳作為生物活性物質(zhì)遞送體系尚未見深入的研究。

本文選用姜黃素作為親脂性生物活性物質(zhì)，利用堿性蛋白酶輔助酶解膨化大豆，將姜黃素溶解在大豆酶解物中，利用水解后的蛋白、磷脂等作為天然乳化劑，制備自發(fā)形成、穩(wěn)定性更佳的新型脂肪乳。為解決姜黃素生物利用率低等問題，本文對(duì)以酶解制備大豆乳液為原料負(fù)載姜黃素的脂肪乳進(jìn)行評(píng)估，并對(duì)其包埋率隨儲(chǔ)存時(shí)間的變化進(jìn)行研究，以期實(shí)現(xiàn)姜黃素更高的穩(wěn)定性能和生物利用度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂膨化大豆(蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%、油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%)，山東高唐藍(lán)山集團(tuán)總公司；Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶，諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；姜黃素、胃蛋白酶、胰蛋白酶、豬膽酸鹽、尼羅藍(lán)、尼羅紅、1，1，3，3-四乙氧基丙烷，美國Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Mastersize2000型激光粒度分析儀，英國伍斯特郡馬爾文儀器有限公司；F-4500型熒光分光光度計(jì)，日本日立公司；722型可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；THZ-80型水浴恒溫振蕩器，天津常儀儀器設(shè)備有限公司；LGR20-W型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，北京京立離心機(jī)有限公司；TCS SP8型激光共聚焦顯微鏡，日本島津制作公司。

1.3 方法

1.3.1脂肪乳制備

參照文獻(xiàn)[9]的方法，全脂大豆經(jīng)擠壓膨化后按照液料比6 mL/g進(jìn)行水解，水浴55℃恒溫?cái)嚢?。? mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至9.0。通過Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%)酶解90 min。隨著酶解進(jìn)行，每9 min加入固定量的姜黃素，使添加的姜黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)到0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%。經(jīng)中性條件下滅酶5 min。冷卻，室溫(20℃)、9 000 r/min條件下離心20 min，分離得到負(fù)載姜黃素的膏狀脂肪乳，記為E0、E0.2、E0.4、E0.6、E0.8、E1.0。

1.3.2脂肪乳微觀結(jié)構(gòu)觀察

參照文獻(xiàn)[10]的方法，采用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)觀察，激發(fā)光的波長(zhǎng)分別是488 nm和633 nm。樣品稀釋至20 mg/mL。配制1 mg/mL的尼羅紅染液和10 mg/mL的尼羅藍(lán)染液(異丙醇作溶液)，分別對(duì)油脂和蛋白染色，時(shí)間為40 min。染色后的樣品置于載玻片，蓋上蓋玻片密封。用100倍油鏡采集樣品圖像。

1.3.3脂肪乳粒徑、電位分析

參照文獻(xiàn)[11]的方法，采用馬爾文激光粒度儀測(cè)定乳狀液體積平均粒徑及其分布情況，將乳狀液用去離子水稀釋1 000倍，充分振蕩，顆粒折射率為1.520，分散劑折射率為1.333，操作溫度為25℃。電位測(cè)定前采用蒸餾水將不同姜黃素添加量的脂肪乳稀釋1 000倍，混勻。稀釋后的樣品置于Zeta池中。平衡120 s后，在25℃下測(cè)定電位，每個(gè)樣品重復(fù)3次測(cè)量。

1.3.4乳化活性及乳化穩(wěn)定性

乳化活性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定參照文獻(xiàn)[12]的方法加以修改。將不同姜黃素添加量的脂肪乳用0.1% SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液稀釋到確定倍數(shù)，在波長(zhǎng)532 nm處用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，計(jì)算乳化活性指數(shù)(EAI)。靜置30 min后測(cè)定吸光度，計(jì)算乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI)，公式分別為

(1)

(2)

式中E——乳化活性指數(shù)，m2/g

S——乳化穩(wěn)定性指數(shù)，min

N——稀釋倍數(shù)，取250

C——乳化液形成前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，g/mL

φ——乳化液中油相體積分?jǐn)?shù)，%

A0——0 min時(shí)的吸光度

A30——30 min時(shí)的吸光度

1.3.5氧化穩(wěn)定性

(1)POV值

參照文獻(xiàn)[13]的方法，采用硫氰化鐵法測(cè)定過氧化值(POV值)，脂肪乳氫過氧化物含量的測(cè)定是將樣品置于45℃干燥箱中加速氧化，并于0、3、5、7、14、21 d取出分裝小樣進(jìn)行氧化實(shí)驗(yàn)的測(cè)定，以不添加乳液的一組為對(duì)照。

(2)TBARS值

次級(jí)氧化產(chǎn)物——丙二醛含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸反應(yīng)物(TBARS)法，由文獻(xiàn)[14]的方法稍作改動(dòng)。將2 mL樣品和4 mL硫代巴比妥酸試劑混合于試管中，混勻后沸水浴加熱15 min，冷卻至室溫，4 000 r/min離心20 min，經(jīng)0.22 μm水系微孔濾膜過濾，測(cè)定上清液在532 nm波長(zhǎng)處的吸光度。樣品中TBARS值可以通過1，1，3，3-四乙氧基丙烷標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

1.3.6熒光光譜分析

脂肪乳的熒光光譜分析根據(jù)文獻(xiàn)[15]方法并進(jìn)行了修改，將脂肪乳用PBS(10 mol/L磷酸鹽緩沖液、pH值7.0)稀釋至蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL，渦旋混合20 s后采用F-4500型熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光圖譜。設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為300～500 nm，狹縫寬度均為5 nm，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.3.7姜黃素包埋率

測(cè)定包埋率需對(duì)不同姜黃素添加量的脂肪乳總姜黃素含量和表面姜黃素含量進(jìn)行定量，本文分別對(duì)儲(chǔ)存第0天、第7天、第14天的脂肪乳姜黃素包埋率進(jìn)行測(cè)定。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(R2>0.999)，并計(jì)算對(duì)應(yīng)姜黃素含量。

根據(jù)文獻(xiàn)[16]進(jìn)行修改，測(cè)定脂肪乳中姜黃素包埋率：將定量脂肪乳分散在DMSO(二甲基亞砜)中，并渦旋振蕩2 min，靜置后在432 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出姜黃素的濃度和樣品的表面姜黃素含量。取適量脂肪乳溶解在DMSO中，渦旋振蕩2 min，在60 W條件下超聲振蕩萃取10 min后，以5 000 r/min離心5 min。收集上清液，洗滌沉淀3次。收集洗滌清液在432 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)姜黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中總姜黃素含量。脂肪乳的姜黃素包埋率計(jì)算公式為

(3)

式中E′——樣品的姜黃素包埋率，%

C0——表面姜黃素質(zhì)量濃度，mg/mL

C′——總姜黃素質(zhì)量濃度,mg/mL

1.3.8體外模擬消化分析

參照文獻(xiàn)[17]的方法，使用胃蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)脂肪乳進(jìn)行胃腸消化模擬。用磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L、pH值7.0)稀釋樣品至所需倍數(shù)，與模擬胃液(SGF)以體積比1∶1混合，并使用1 mol/L HCl將pH值調(diào)節(jié)至3.0，在消化混合物中加入胃蛋白酶使之活性達(dá)到2 000 U/mL，將混合物在水浴振蕩器(37℃、120 r/min)中反應(yīng)2 h。SGF消化2 h后，取出胃消化樣品與模擬腸液以體積比1∶1混合，用1 mol/L NaOH將pH值增加至7.0，添加胰蛋白酶(活性為100 U/mL)，混合物在相同條件下孵育2 h。調(diào)節(jié)體系pH值使之始終為6.9～7.0。分別收集胃消化和腸消化后消化樣品，以測(cè)定在體外消化后粒徑和姜黃素生物利用率。

1.3.9姜黃素生物利用率

參照文獻(xiàn)[1]的方法，測(cè)定經(jīng)體外模擬胃腸消化后的樣品中姜黃素含量來計(jì)算姜黃素生物利用率。分別取適量胃消化和腸消化結(jié)束后的消化液于4℃用5 000 r/min低溫離心10 min后取清液層。利用紫外分光光度法，測(cè)定姜黃素濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算出胃、腸消化后清液層的姜黃素含量。脂肪乳中姜黃素的生物利用率計(jì)算公式為

(4)

式中Y——姜黃素生物利用率，%

C1——清液層中姜黃素質(zhì)量濃度，mg/mL

C2——消化前樣品中姜黃素質(zhì)量濃度，mg/mL

1.3.10數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

所有數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果，表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用Origin 2019軟件進(jìn)行圖表繪制，SPSS 23.0用于數(shù)據(jù)分析，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 脂肪乳微觀結(jié)構(gòu)觀察

激光共聚焦顯微鏡可觀察乳液中油脂和蛋白的分布情況，形成O/W乳液后可觀察到圓形液滴，如圖1所示。結(jié)果表明，添加姜黃素后，脂肪乳液滴變小。添加量為0.6%時(shí)，乳液中油滴和蛋白分布比較均勻，且蛋白包裹在油滴外側(cè)，信號(hào)較強(qiáng)。姜黃素添加量在0.8%和1.0%時(shí)，脂肪乳平均液滴大小沒有顯著變化，但液滴分布不均勻，少量的油滴變大，游離在外側(cè)，可能的原因是蛋白有少量聚集或吸附到乳液界面，影響乳液界面蛋白油脂分布情況。文獻(xiàn)[18]的研究結(jié)果表明，蛋白質(zhì)分子之間的疏水相互作用導(dǎo)致其他蛋白質(zhì)(在水相中未吸附的)遷移到O/W界面，影響乳液界面組成。

2.2 脂肪乳粒徑、電位分析

流體動(dòng)力學(xué)半徑分布是評(píng)價(jià)乳液穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，可以直觀地評(píng)價(jià)液滴的分散狀態(tài)。本文利用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)探究不同姜黃素添加量下脂肪乳液滴分布情況及體積平均粒徑D4,3。酶法輔助制備的大豆脂肪乳粒徑分布如圖2a所示。結(jié)果表明，脂肪乳粒徑主要呈現(xiàn)單峰分布，分布較為均勻。從圖2b(圖中不同字母表示數(shù)據(jù)之間差異顯著(P<0.05))可知，未添加姜黃素的脂肪乳粒徑最大，添加姜黃素后，隨添加量的增加，粒徑逐漸增大，這可能是因?yàn)樵谟拖嘀兴慕S素導(dǎo)致乳液粒徑變大[19]。同時(shí)，在添加量為0.6%時(shí)脂肪乳平均粒徑顯著增加，達(dá)到1 127.42 nm。此添加量下峰寬較窄，表明此時(shí)脂肪乳中顆粒大小均勻。姜黃素添加量0.8%和1.0%的脂肪乳平均粒徑增加不顯著，分別為1 145.29 nm和1 159.23 nm，峰寬較大，脂肪乳顆粒大小不均一。文獻(xiàn)[19]的研究也發(fā)現(xiàn)，包埋姜黃素的乳液粒徑隨著姜黃素含量的增加而增加，達(dá)到一定濃度時(shí)乳液平均粒徑逐漸趨于穩(wěn)定。

電位絕對(duì)值可間接評(píng)價(jià)乳液的穩(wěn)定程度。由圖2c可知，在添加姜黃素后，電位絕對(duì)值隨著姜黃素添加量增加先增加再減小。其中，在添加量為0.6%時(shí)達(dá)到38.67 mV，此時(shí)乳液分子間靜電斥力較大，更易保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[20]。

2.3 乳化活性及乳化穩(wěn)定性

乳化活性及乳化穩(wěn)定性可評(píng)價(jià)乳液的乳化性能[21]，結(jié)果表明，由于蛋白(多肽)和磷脂的共存體系作為乳化劑形成的液滴較穩(wěn)定，利用酶輔助法制備大豆脂肪乳的乳化穩(wěn)定性較高。如圖3(圖中不同大寫字母表示脂肪乳乳化活性指數(shù)之間差異顯著(P<0.05)，不同小寫字母表示脂肪乳乳化穩(wěn)定性指數(shù)之間差異顯著(P<0.05))所示，隨著姜黃素添加量的增加，乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)均呈顯著降低的趨勢(shì)，可能的原因是加入姜黃素會(huì)對(duì)乳化劑吸附到O/W界面的能力產(chǎn)生負(fù)面影響。在添加量為0.6%時(shí)，EAI和ESI分別為92.39 m2/g和189.54 min，當(dāng)添加量在0.8%和1.0%時(shí)乳化穩(wěn)定性指數(shù)和乳化活性指數(shù)有顯著降低(P<0.05)，表明添加過多的姜黃素會(huì)影響乳液的乳化性能，可能的原因是其他蛋白質(zhì)遷移到O/W界面，與CLSM觀察到的現(xiàn)象相吻合。文獻(xiàn)[22]指出，在弱酸性或接近中性pH值條件下，過量蛋白質(zhì)吸附在界面層會(huì)導(dǎo)致乳化活性的降低。

2.4 氧化穩(wěn)定性分析

本文采用測(cè)定乳液在45℃干燥箱中經(jīng)0、3、5、7、14、21 d儲(chǔ)存后的氧化產(chǎn)物含量來評(píng)價(jià)不同姜黃素添加量脂肪乳的氧化穩(wěn)定性，分別測(cè)定了脂肪乳的初級(jí)氧化產(chǎn)物含量(POV值)和次級(jí)氧化產(chǎn)物含量(TBARS值)。

由圖4a可知，所有樣品在第0天至第7天時(shí)的POV值沒有顯著增加，且不同姜黃素添加量的脂肪乳之間沒有顯著差異。第7天后，所有樣品POV值顯著增加，第14天添加姜黃素0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%的乳液POV值分別增加至6.215、5.56、3.99、3.15、2.71、3.05 mmol/kg。添加量為0.6%的脂肪乳在第14天時(shí)的POV值較低，僅為3.15 mmol/kg，表明此條件下脂肪乳穩(wěn)定性好，氧化產(chǎn)物較少，不易受到氧氣的破壞。姜黃素添加量達(dá)到0.8%和1.0%時(shí)與0.6%樣品相比POV值差異不顯著，表明較高姜黃素添加量脂肪乳氧化程度均較低，且隨著儲(chǔ)藏時(shí)間增加，受到姜黃素添加量的影響較小。

次級(jí)氧化產(chǎn)物丙二醛生成物(TBARS值)的結(jié)果如圖4b所示，在氧化初期所有樣品的TBARS值沒有顯著差異。在經(jīng)過7 d后，部分初級(jí)氧化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為次級(jí)氧化產(chǎn)物，乳液的TBARS值有所增加，但均不超過0.50 mmol/kg。文獻(xiàn)[23]采用高速剪切制備姜黃素MCT/Pickering乳劑，在第7天的TBARS值約為0.65 mmol/kg，由此可見，酶法輔助制備的大豆姜黃素乳液具有較傳統(tǒng)高速剪切制備的乳液更好的氧化穩(wěn)定性。酶法輔助制備過程中蛋白質(zhì)(多肽)吸附在油滴表面后形成一層黏彈性蛋白膜，可以有效阻止脂質(zhì)氧化的引發(fā)劑擴(kuò)散到油滴內(nèi)部，同時(shí)限制水相中的過渡金屬與油相相互作用，從而起到抑制油脂氧化的作用[13]。脂肪乳E0、E0.2、E0.4、E0.6、E0.8和E1.0在第14天的TBARS值分別增加至0.70、0.55、0.45、0.32、0.43、0.37 mmol/kg，表明在姜黃素添加量較少時(shí)，乳液的氧化穩(wěn)定性受到姜黃素添加量的影響，且添加量為0.6%的脂肪乳TBARS值最低，與POV值的結(jié)果一致。在儲(chǔ)存21 d時(shí)，姜黃素添加量為0.6%脂肪乳的TBARS值僅為0.56 mmol/kg，產(chǎn)生較少的次級(jí)氧化產(chǎn)物。當(dāng)姜黃素添加量在0.6%以上時(shí)，脂肪乳的TBARS值沒有明顯變化，表明過多的姜黃素添加量不會(huì)顯著抑制脂肪乳的次級(jí)氧化產(chǎn)物的生成。

2.5 熒光光譜分析

脂肪乳外層水相中的大豆蛋白含有疏水性氨基酸殘基(色氨酸和酪氨酸)，是蛋白質(zhì)的主要熒光基團(tuán)，蛋白質(zhì)具有的內(nèi)源熒光對(duì)疏水性的色氨酸和酪氨酸極性變化敏感[24]。本研究測(cè)定了姜黃素添加量在0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%的脂肪乳內(nèi)源熒光光譜。

如圖5所示，脂肪乳水相中的大豆蛋白在發(fā)射波長(zhǎng)332 nm處具有最大熒光強(qiáng)度，說明色氨酸所處的微環(huán)境具有較高的疏水性。由圖5可知，未添加姜黃素的脂肪乳熒光強(qiáng)度達(dá)到3 300.32，加入姜黃素后，E0.2、E0.4和E0.6的最大熒光強(qiáng)度分別為2 880.85、2 514.10和2 013.24，表明姜黃素的添加使蛋白質(zhì)的色氨酸微環(huán)境疏水性增加，此時(shí)熒光強(qiáng)度稍有降低。然而，姜黃素添加量增加至0.8%和1.0%時(shí)，脂肪乳水相中的蛋白質(zhì)最大熒光強(qiáng)度顯著降低至1 787.17和1 710.64，表明姜黃素含量的增加使大豆蛋白發(fā)生內(nèi)源熒光猝滅現(xiàn)象。文獻(xiàn)[25]的研究結(jié)果表明，熒光光譜顯示蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)的相互作用可導(dǎo)致熒光猝滅。同樣地，文獻(xiàn)[26]的研究表明，姜黃素添加量的增加會(huì)促進(jìn)大豆蛋白與姜黃素的相互作用，發(fā)生靜態(tài)熒光淬滅。因此，在姜黃素添加量大于0.6%時(shí)，未包埋在油相中的游離姜黃素可能會(huì)在酶法制備脂肪乳的過程中與大豆蛋白通過非共價(jià)作用相結(jié)合，從而間接降低其包埋率和生物利用率。

2.6 姜黃素包埋率

姜黃素的包埋率以及生物利用率是乳液作為生物活性物質(zhì)遞送體系的關(guān)鍵評(píng)價(jià)指標(biāo)。姜黃素的包埋率會(huì)隨著乳液的凝聚、聚集和氧化分解等因素發(fā)生變化。本研究測(cè)定了不同姜黃素添加量脂肪乳儲(chǔ)存第0天、第7天、第14天的姜黃素包埋率，如圖6(圖中不同大寫字母表示不同姜黃素添加量乳液原始包埋率之間的差異顯著(P<0.05)，不同小寫字母表示儲(chǔ)存過程中姜黃素包埋率之間的差異顯著(P<0.05))所示。

結(jié)果表明，原始(第0天)乳液E0.2、E0.4和E0.6的姜黃素包埋率分別為66.62%、68.30%和72.58%，表明酶法輔助制備的大豆脂肪乳可以較好地負(fù)載姜黃素，且隨著姜黃素的增加，包埋率增大。文獻(xiàn)[27]中開發(fā)了用于包裹姜黃素的羧甲基玉米醇溶蛋白納米粒子，包埋率為66.70%，可見酶法制備的大豆脂肪乳相較于傳統(tǒng)納米乳液體系有較高的包埋率。然而，當(dāng)繼續(xù)添加姜黃素至添加量0.8%和1.0%時(shí)，姜黃素包埋率顯著降低至56.70%和30.54%，表明過量添加姜黃素并不會(huì)使姜黃素包埋率增加，反而會(huì)對(duì)包埋效果產(chǎn)生較大負(fù)面影響。可能的原因是制備的大豆脂肪乳中蛋白和磷脂吸附的界面層十分穩(wěn)定，過量的游離姜黃素?zé)o法進(jìn)入并包埋在乳液的油相中。文獻(xiàn)[28]中表示，不同的芯壁比在固定的乳化體系中會(huì)造成表面電荷的變化，從而影響乳化體系中顆粒的大小和分布，間接影響包埋率和穩(wěn)定性，并推測(cè)在芯壁比增加到某一值后，乳化體系固定且表面電荷的變化不明顯。

在乳液儲(chǔ)存第7天時(shí)，E0.2、E0.4和E0.6的姜黃素包埋率由66.62%、68.30%和72.58%下降到65.87%、67.23%和70.34%，并沒有大幅度降低，表明此時(shí)乳液發(fā)生了輕微的氧化，間接影響了對(duì)姜黃素的包埋效果。而姜黃素添加量為0.8%和1.0%的乳液包埋率有顯著降低，可能的原因是在貯存過程中，脂肪乳內(nèi)部有少量姜黃素暴露于乳液表面，且游離姜黃素隨添加量的增加而增多，導(dǎo)致包埋率有顯著降低。

當(dāng)儲(chǔ)存第14天時(shí)，E0.2、E0.4和E0.6的姜黃素包埋率分別為63.56%、64.37%和68.45%，沒有顯著降低，且總體姜黃素包埋率均在60%以上；E0.8和E1.0的姜黃素包埋率分別降低至47.61%和20.60%，表明隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增加乳液發(fā)生的聚集、凝聚和氧化分解使姜黃素的包埋率顯著降低。因此，當(dāng)姜黃素添加量大于0.6%時(shí)，添加過量姜黃素的脂肪乳不能在儲(chǔ)存第14天后保留更多的姜黃素，反而會(huì)降低脂肪乳對(duì)姜黃素的保護(hù)作用。文獻(xiàn)[29]的研究表明，大豆蛋白-姜黃素-大豆多糖復(fù)合物中在20 h后有56%～60%的姜黃素釋放。同樣地，文獻(xiàn)[30]報(bào)道了隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)，姜黃素在蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物納米乳劑中的流失率達(dá)到36.26%～44.66%。對(duì)比可知，在姜黃素添加量合適的情況下，酶法輔助制備的大豆脂肪乳相比常規(guī)的姜黃素負(fù)載方法有較好的包埋效果。

2.7 姜黃素生物利用率

生物利用率可衡量乳液運(yùn)載體系經(jīng)胃腸消化后的遞送效果，生物活性物質(zhì)會(huì)不斷在胰脂肪酶和豬膽酸鹽作用下水解，并被載入到由膽鹽和脂肪酸組成的混合膠束中，進(jìn)而被小腸上皮細(xì)胞吸收[31]。因此可以通過測(cè)定膠束中姜黃素的濃度得到生物利用率。本文測(cè)定了不同姜黃素添加量脂肪乳在胃腸消化后的姜黃素生物利用率。由表1可知，姜黃素在胃腸消化后的生物利用率與脂肪乳粒徑呈負(fù)相關(guān)。

表1 不同姜黃素添加量脂肪乳經(jīng)胃腸消化后的粒徑、生物利用率

經(jīng)SGF消化2 h后，胃蛋白酶水解誘導(dǎo)疏水域的暴露，這可能導(dǎo)致脂肪乳聚集，平均液滴大小顯著增加[3]。未經(jīng)脂肪乳包裹的姜黃素釋放消化了42.73%，E0.2、E0.4和E1.0分別消化了23.23%、17.16%和14.76%的姜黃素，表明經(jīng)過脂肪乳包埋的姜黃素釋放量顯著降低。E0.6僅消化利用了9.05%的姜黃素，表明此姜黃素添加量可以將姜黃素在胃消化液中的釋放控制在較低水平。文獻(xiàn)[32]提出，當(dāng)在pH值7.2的PBS中孵育時(shí)，超過30%的游離姜黃素僅需30 min即可降解。

經(jīng)SIF(模擬腸液)孵育4 h，胰蛋白酶分解了來自胃消化液的大液滴導(dǎo)致粒徑減小。游離姜黃素在腸液中的生物利用率較低，僅為38.53%，而脂肪乳中的姜黃素利用率顯著增加，E0.2、E0.4、E0.6、E0.8和E1.0分別消化利用了剩余的59.35%、59.13%、55.22%、48.34%和48.69%的姜黃素，表明經(jīng)腸道消化液中胰蛋白酶的作用打破了原有的乳液結(jié)構(gòu)，消化了油相中的姜黃素。文獻(xiàn)[33]的研究結(jié)果也表明，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物乳化劑可以顯著促進(jìn)姜黃素在納米乳液中的釋放，生物利用率達(dá)到53.24%。綜合胃腸消化情況，姜黃素添加量在0.6%時(shí)，酶法制備的新型大豆脂肪乳可以較好地包埋姜黃素，且在SGF消化液中有較低的釋放量，在SIF中有較大的生物利用率，表明該包封達(dá)到了控制釋放的效果。

3 結(jié)束語

以膨化大豆為原料，利用酶法輔助制備了姜黃素添加量0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的脂肪乳。研究表明，添加姜黃素的脂肪乳粒徑隨著姜黃素含量增加而增大，添加量達(dá)到0.6%時(shí)乳液粒徑不再顯著增加，此時(shí)電位絕對(duì)值最大。乳液在姜黃素添加量達(dá)到0.6%時(shí)，乳液蛋白包裹油滴外側(cè)，沒有游離的油滴，此時(shí)脂肪乳的乳化穩(wěn)定性和乳化活性較高。姜黃素的添加會(huì)降低脂肪乳的氧化程度，在添加量大于0.6%時(shí)對(duì)脂肪乳的氧化程度影響微弱。熒光光譜結(jié)果表明，添加過量姜黃素會(huì)使未包埋的姜黃素以游離狀態(tài)與大豆蛋白結(jié)合，發(fā)生熒光淬滅，導(dǎo)致包埋率和生物利用率降低。在添加量為0.6%時(shí)，脂肪乳對(duì)姜黃素的包埋率高達(dá)72.58%，高于傳統(tǒng)納米乳液。體外消化實(shí)驗(yàn)表明，酶法輔助制備的姜黃素脂肪乳運(yùn)載體系具有高效的緩釋效果。因此，酶法輔助制備的大豆脂肪乳構(gòu)建的姜黃素運(yùn)載體系可實(shí)現(xiàn)對(duì)姜黃素更好的包埋及利用，具有廣闊的應(yīng)用前景。