O.oeni糖苷酶活性對(duì)干白葡萄酒萜烯類香氣的影響

祝 霞 趙丹丹 李俊娥 毛亞玲 韓舜愈 楊學(xué)山

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院， 蘭州 730070； 2.甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘭州 730070)

0 引言

萜烯類化合物能夠賦予葡萄及葡萄酒典型的品種特征[1]，它們?cè)谄咸殉墒爝^(guò)程中逐漸積累，并且以糖苷配基的形式直接連接在β-D-葡萄糖上形成單糖苷，連接有單糖苷配基的葡萄糖可進(jìn)一步與α-L-呋喃阿拉伯糖、α-L-吡喃鼠李糖、β-D-呋喃芹菜糖等鍵合生成雙糖苷或三糖苷[2]。糖苷測(cè)定分析表明，葡萄中的雙糖苷鍵合態(tài)香氣前體物含量最高，單糖苷次之，三糖苷最低[3]，且鍵合態(tài)的糖苷類化合物只有轉(zhuǎn)化為游離態(tài)的香氣成分才會(huì)被消費(fèi)者感知。單糖苷類香氣前體物質(zhì)可由β-葡萄糖苷酶直接酶解；雙糖苷化合物首先在α-L-鼠李糖苷酶、α-L-阿拉伯糖苷酶等外切酶的作用下生成β-D-葡萄糖單糖苷，然后在β-D-葡萄糖苷酶作用下釋放出具有揮發(fā)性的糖苷配基[4-5]。因此，特異性的單糖苷酶和雙糖苷酶被認(rèn)為是釋放萜烯類化合物的有效工具。

釀酒酵母可以分泌糖苷酶，但在高糖、高酒精、高多酚以及低pH值的釀酒工藝條件下無(wú)法保持其高效的催化活性[6-7]。此外，一些非釀酒酵母也可以合成活力較高的β-葡萄糖苷酶，但其生長(zhǎng)僅局限于酒精發(fā)酵開(kāi)始階段，隨著酒精含量的增加，非釀酒酵母數(shù)量會(huì)急劇下降[8]。蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵(Malolactic fermentation，MLF)是釀造優(yōu)質(zhì)干紅和部分干白葡萄酒所必需的生產(chǎn)工藝[9]，O.oeni菌株在生物降酸的同時(shí)還可以合成釋放糖苷酶，從而豐富和提升酒體的香氣品質(zhì)[9-13]。文獻(xiàn)[12]提出，評(píng)價(jià)優(yōu)良O.oeni菌株發(fā)酵特性時(shí)，不能只局限于β-D-葡萄糖苷酶，還應(yīng)考慮α-L-阿拉伯糖苷酶和α-L-鼠李糖苷酶的活性。文獻(xiàn)[14]研究表明，O.oeni糖苷酶具有較強(qiáng)的菌株依賴性，供試菌株中90%的菌株具有活性較高的α-L-鼠李糖苷酶，50%左右的菌株α-L-阿拉伯糖苷酶活性較高。因此，有必要對(duì)菌株合成糖苷酶特性進(jìn)行系統(tǒng)分析，以便在用于發(fā)酵劑之前進(jìn)行合理選擇。

為了在日益全球化的葡萄酒市場(chǎng)中尋求獨(dú)特之處，分離篩選優(yōu)良本土O.oeni、釀造代表產(chǎn)區(qū)風(fēng)格的葡萄酒已成為研究者關(guān)注的焦點(diǎn)[15-21]。本文以分離篩選的本土O.oeni菌株為試驗(yàn)對(duì)象，以商業(yè)菌株VP41為對(duì)照，探討各釀造因子對(duì)供試菌株糖苷酶活性的影響，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程中菌株糖苷酶活性的變化，并在優(yōu)化后的釀造條件下進(jìn)行霞多麗干白葡萄酒MLF，分析比較MLF前后酒樣中萜烯類物質(zhì)的變化，以期為挖掘本土菌株釀造特性、生產(chǎn)代表河西走廊產(chǎn)區(qū)的葡萄酒提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本土酒酒球菌菌株：GF-2、ZX-1、QL-11、MG-1菌株分離自甘肅省河西走廊產(chǎn)區(qū)葡萄酒生產(chǎn)企業(yè)自然啟動(dòng)MLF酒樣，由北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行種屬鑒定。16S rDNA測(cè)序結(jié)果顯示，GF-2、ZX-1、QL-11、MG-1與模式菌株OenococcusoeniDSM 20252(T)相似度分別達(dá)到99.84%、99.34%、99.78%、99.58%。

商業(yè)酒酒球菌：VP41，購(gòu)自上海杰兔責(zé)任有限公司。

商業(yè)釀酒酵母：ES488，購(gòu)自意大利Enartis公司。

釀酒葡萄：選用2019年產(chǎn)自甘肅省莫高葡萄種植基地的霞多麗葡萄，含糖量約為21.3°Brix，總酸質(zhì)量濃度6.87 g/L(以酒石酸計(jì))，pH值3.36。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

酸性番茄培養(yǎng)基(ATB)配制參照文獻(xiàn)[16]的方法。

參照文獻(xiàn)[18]的方法進(jìn)行模擬汁培養(yǎng)基的配制：葡萄糖1 g/L、果糖1 g/L、L-蘋(píng)果酸2 g/L、海藻糖1 g/L、酒石酸1 g/L、檸檬酸1 g/L、乙酸鈉0.14 g/L、酵母浸粉4.0 g/L、水解酪蛋白2.5 g/L、KH2PO40.3 g/L、KCl 0.22 g/L、L-型半胱氨酸鹽酸0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.065 g/L、MnSO4·4H2O 0.015 g/L、CaCl20.065 g/L、甘油3 mL/L。

香氣標(biāo)準(zhǔn)品：香茅醇、橙花醇、芳樟醇、α-松油醇、β-紫羅蘭酮、反式橙花叔醇等香氣化合物和內(nèi)標(biāo)物2-辛醇標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)Sigma公司)。

其他試劑：L-蘋(píng)果酸檢測(cè)試劑盒(愛(ài)爾蘭Megazyme公司)；對(duì)硝基苯酚(p-NP)、對(duì)硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷(p-NPG)、4-硝基苯基-α-L-吡喃鼠李糖苷、4-硝基苯基-α-L-吡喃阿拉伯糖苷(上海源葉有限責(zé)任公司)；氫氧化鈉、檸檬酸、磷酸二氫鉀、碳酸鈉，均為分析純?cè)噭?天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)。

1.3 儀器與設(shè)備

SPX-150-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；pHS-3C型pH計(jì)(上海雷磁責(zé)任有限公司)；TU-1810型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)； SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；LDZX-50KBS型高壓蒸汽滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)；GZX-GF101-Ⅱ型恒溫干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)；H2050R型高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀儀器有限公司)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

參照文獻(xiàn)[22]的方法并略作修改。當(dāng)p-NP濃度在10～80 μmol/L范圍時(shí)，400 nm處OD值與濃度回歸方程為：y=0.007 6x+0.019 9，R2=0.997 4，線性關(guān)系良好，可用作后續(xù)試驗(yàn)中糖苷酶活性的計(jì)算。

1.4.2菌種活化

參照文獻(xiàn)[20]的方法挑取斜面上保存的菌種置于滅菌后的ATB培養(yǎng)基內(nèi)，在28℃下培養(yǎng)，待生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)(600 nm處OD值約1.1)，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)接種。

1.4.3糖苷酶活性測(cè)定方法

(1)β-D-葡萄糖苷酶活力

參照文獻(xiàn)[14]的方法并略作修改。以對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷為底物，反應(yīng)體系(2.5 mL)為：從模擬汁培養(yǎng)基中取1 mL的培養(yǎng)液，加1 mL檸檬酸-磷酸緩沖溶液(pH值5.0)和0.5 mLp-NPG溶液，混合后于50℃條件反應(yīng)30 min，然后8 000 r/min離心15 min，取上清液，加入2 mL的1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)。在400 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

酶活力單位(U)定義為：每1 min每1 mL菌體細(xì)胞水解相應(yīng)底物生成p-NP所需要的酶量(μmol)。

(2)α-L-鼠李糖苷酶活力

參照文獻(xiàn)[23]的方法。以4-硝基苯基-α-L-吡喃鼠李糖苷為底物，反應(yīng)體系(3.5 mL)為：取0.4 mL的培養(yǎng)液，加1 mL檸檬酸-磷酸緩沖溶液(pH值5.0)和0.1 mL底物(1.5 mmol/L)溶液，混合后于50℃條件下反應(yīng)30 min后8 000 r/min離心15 min，取上清液，加入2 mL 0.5 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)。在400 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

(3)α-L-阿拉伯糖苷酶活力

參照文獻(xiàn)[24]的方法。以4-硝基苯基-α-L-吡喃阿拉伯糖苷為底物，反應(yīng)體系(2.1 mL)為：取0.4 mL的培養(yǎng)液，加1 mL檸檬酸-磷酸緩沖溶液(pH值5.0)和0.1 mL底物(1.5 mmol/L)溶液，混合后于50℃條件下反應(yīng)30 min，然后8 000 r/min離心15 min，取上清液，加入0.6 mL飽和硼砂溶液終止反應(yīng)。在400 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.4.4本土酒酒球菌菌株酶活力評(píng)價(jià)

利用模擬汁體系對(duì)4株本土O.oeni及1株商業(yè)O.oeni菌株的3種糖苷酶(β-D-葡萄糖苷酶、α-L-鼠李糖苷酶和α-L-阿拉伯糖苷酶)活力進(jìn)行測(cè)定，分析比較供試菌株酶活性變化規(guī)律，篩選產(chǎn)酶活性較高的菌株。試驗(yàn)平行重復(fù)3次。

1.4.5各釀造因子對(duì)菌株糖苷酶活性的影響

(1)初始pH值

將鑒定所得O.oeni菌株經(jīng)ATB斜面培養(yǎng)、ATB液體培養(yǎng)基活化后，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的供試菌株以1×107CFU/mL的接種量，分別接種于pH值為3.0、3.2、3.4、3.6、3.8的模擬汁培養(yǎng)基中(HCl或NaOH調(diào)整pH值)，28℃靜置培養(yǎng)，每隔48 h測(cè)定發(fā)酵液中糖苷酶活性。試驗(yàn)重復(fù)3次，下同。

(2)乙醇體積分?jǐn)?shù)

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的O.oeni菌株，以1×107CFU/mL的接種量分別接種于乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%、8%、10%、12%、14%的模擬汁培養(yǎng)基中，28℃靜置培養(yǎng)，每隔48 h測(cè)定發(fā)酵液中糖苷酶的活性。

(3)發(fā)酵溫度

待O.oeni菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以1×107CFU/mL的接種量接種于模擬汁培養(yǎng)基中，分別置于18、20、22、25、28℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，每隔48 h測(cè)定發(fā)酵液中糖苷酶的活性。

(4)SO2添加量

以1×107CFU/mL的接種量，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的O.oeni菌株，分別接種于SO2添加量(亞硫酸鈉調(diào)節(jié))為15、30、45、60、75 mg/L的模擬汁培養(yǎng)基中，28℃靜置培養(yǎng)，每隔48 h測(cè)定發(fā)酵液中糖苷酶的活性。

1.4.6復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)pH值、乙醇體積分?jǐn)?shù)、發(fā)酵溫度、SO2添加量4個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.4.7微釀試驗(yàn)

菌株活化：參考廠家說(shuō)明書(shū)推薦方法進(jìn)行釀酒酵母菌株活化。按推薦用量(0.2 g/L)將ES488干酵母菌粉溶于10倍體積無(wú)菌水中，37℃靜置溶解20 min，再加入等體積的葡萄汁于28℃活化25 min。酒酒球菌菌株活化參照1.4.2節(jié)的方法進(jìn)行。

葡萄酒微釀試驗(yàn)：參照文獻(xiàn)[25]完成霞多麗干白葡萄酒酒精發(fā)酵后，選擇產(chǎn)酶性能優(yōu)良的O.oeni菌株，按1×107CFU/mL的接種量進(jìn)行接種，以商業(yè)菌VP41作為對(duì)照。自接入菌株開(kāi)始，每隔48 h取樣，測(cè)定L-蘋(píng)果酸質(zhì)量濃度，小于0.2 g/L時(shí)結(jié)束MLF。取樣測(cè)定理化指標(biāo)和萜烯類香氣化合物。

理化指標(biāo)測(cè)定：酒精度、殘?zhí)呛?、pH值、總酸含量、揮發(fā)酸含量和總SO2含量檢測(cè)均參照文獻(xiàn)[26]中的試驗(yàn)方法進(jìn)行。L-蘋(píng)果酸含量測(cè)定參考L-蘋(píng)果酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

揮發(fā)性香氣化合物含量的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[25]的香氣物質(zhì)萃取方法及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Gas chromatography and mass spectrometry，GC-MS)條件，進(jìn)行香氣成分富集和定性定量分析。于15 mL的頂空瓶中加入2.5 g氯化鈉、8 mL酒樣、20 μL 2-辛醇(質(zhì)量濃度81.06 mg/L)，加磁力攪拌轉(zhuǎn)子后封口，放入恒溫加熱磁力攪拌器中，40℃水浴平衡30 min，然后插入萃取針頂空萃取30 min。

(1)GC-MS條件

GC條件：色譜柱DB-WAX 60 m×2.5 mm×0.25 μm，不分流進(jìn)樣；載氣(He)流速1 mL/min；進(jìn)樣口溫度240℃，解析時(shí)間5 min；柱溫升溫程序：50℃保持5 min，以3.5℃/min升至180℃，保持15 min。

MS條件：電子轟擊離子源(EI)；電子能量70 eV；傳輸線溫度180℃；離子源溫度200℃；質(zhì)譜掃描范圍50～350(質(zhì)荷比)。

(2)定性與定量分析

定性分析：采用與標(biāo)準(zhǔn)香氣成分保留時(shí)間(RT)對(duì)比的方法結(jié)合NIST-11、Wiley及香精香料標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索比對(duì)結(jié)果進(jìn)行揮發(fā)性香氣化合物定性分析。

定量分析：對(duì)于已有標(biāo)準(zhǔn)品的香氣化合物通過(guò)內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析，其他香氣化合物含量利用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行相對(duì)定量分析，內(nèi)標(biāo)物為2-辛醇。

1.4.8試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2010、Origin 2018進(jìn)行基本處理和制圖，IBM SPSS Statistics 19.0 軟件進(jìn)行多重比較(Duncan法，P<0.05)及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 本土酒酒球菌菌株糖苷酶活性測(cè)定

分別將供試菌株接種于模擬汁培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，每隔48 h取樣，測(cè)定酶活力。由于MLF在14 d時(shí)基本結(jié)束，發(fā)酵過(guò)程中共需取樣7次，且所測(cè)酶種類較多(3種)，為便于直觀比較各菌株的酶活性，參照文獻(xiàn)[27]的方法，采用酶活力累積量(mU/mL)，即同一菌株、同一種酶的7次測(cè)定結(jié)果逐次相加，表征分析不同菌株之間的差異(表1)，下同。

表1 5株O.oeni糖苷酶活性測(cè)定

由表1可知，對(duì)4株供試本土O.oeni的3種糖苷酶活性比較發(fā)現(xiàn)，菌株GF-2、ZX-1的β-D-葡萄糖苷酶、α-L-鼠李糖苷酶活性最高值都分別顯著高于菌株QL-11、MG-1的最大酶活性(P<0.05)。QL-11、MG-1的3種酶活性測(cè)定值都低于菌株VP41的酶活性。因此，選擇菌株GF-2、ZX-1為后續(xù)的測(cè)試菌株。

2.2 各發(fā)酵條件對(duì)本土酒酒球菌菌株糖苷酶活性的影響

結(jié)合態(tài)香氣雙糖苷酶解時(shí)，首先由雙糖苷酶作用于相應(yīng)的阿拉伯糖、鼠李糖基等糖基配體，使雙糖苷變?yōu)閱翁擒?；然后再由?D-葡萄糖苷酶斷裂糖苷鍵，生成游離芳香苷元和葡萄糖[28]。因此采用雙糖苷酶活力累積量(mU/mL)(α-L-鼠李糖苷酶和α-L-阿拉伯糖苷酶活力累積量之和)和β-D-葡萄糖苷酶活力累積量(mU/mL)，分別直觀表征在不同發(fā)酵條件下供試菌株之間的糖苷酶活性差異。

2.2.1初始pH值

由圖1(圖中不同小寫(xiě)字母表示在P<0.05水平下組內(nèi)(相同橫坐標(biāo)、不同圖例)差異顯著，不同大寫(xiě)字母表示在P<0.05水平下組間(相同圖例、不同橫坐標(biāo))差異顯著，下同)所示，隨著pH值的增加，供試菌株的β-D-葡萄糖苷酶和雙糖苷酶活力累積量都呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，且菌株VP41的2種酶活性低于菌株ZX-1、GF-2的酶活性。供試菌株在pH值為3.6或3.8時(shí)具有最大的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量，且在不同的pH值梯度下，菌株GF-2的β-D-葡萄糖苷酶活力比ZX-1和VP41的酶活性顯著較高。VP41的最大雙糖苷酶活力累積量(19.440 mU/mL)出現(xiàn)在pH值為3.8，ZX-1、GF-2的最大雙糖苷酶活力累積量則是在pH值為3.6時(shí)產(chǎn)生(32.964、22.718 mU/mL)。當(dāng)初始pH值為3.0時(shí)，VP41比ZX-1表現(xiàn)出更強(qiáng)的酶活特性；除pH值3.0以外，菌株ZX-1的雙糖苷酶活性在不同pH值下都顯著高于其它供試菌株(P<0.05)。

2.2.2乙醇體積分?jǐn)?shù)

由圖2可知，不同菌株在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)影響下的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量不同。本土O.oeni菌株ZX-1、GF-2在乙醇體積分?jǐn)?shù)為8%時(shí)產(chǎn)生最大β-D-葡萄糖苷酶活力累積量(24.570、30.166 mU/mL)，對(duì)照菌株VP41的最大β-D-葡萄糖苷酶活力累積量在乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%時(shí)產(chǎn)生(17.202 mU/mL)，且在乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%～8%時(shí)，VP41的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量顯著低于本土O.oeni的酶活力累積量(P<0.05)。乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%～12%時(shí)，菌株GF-2的雙糖苷酶活力累積量均高于菌株ZX-1和VP41的酶活力累積量，但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到14%時(shí)，VP41的雙糖苷酶活力累積量顯著高于2株本土O.oeni，表明商業(yè)菌株VP41在較高乙醇體積分?jǐn)?shù)的葡萄酒中更有利于品種香的釋放。此時(shí)，GF-2的雙糖苷酶活力累積量顯著下降，與ZX-1無(wú)顯著差異(P<0.05)。

2.2.3SO2添加量

圖3為SO2添加量對(duì)供試菌株糖苷酶活力的影響。供試菌株在SO2添加量為30 mg/L時(shí)有最大β-D-葡萄糖苷酶活力累積量，且GF-2的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量(30.933 mU/mL)顯著高于ZX-1和VP41菌株；SO2添加量為45～75 mg/L時(shí)，ZX-1與VP41的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量差異不顯著(P<0.05)。在SO2添加量為15～45 mg/L時(shí)，ZX-1的雙糖苷酶活力累積量顯著高于GF-2和VP41，當(dāng)SO2添加量為60～75 mg/L時(shí)，商業(yè)菌株VP41的雙糖苷酶活力累積量顯著高于本土O.oeni。

2.2.4發(fā)酵溫度

發(fā)酵溫度是葡萄酒釀造過(guò)程中最可控的因素之一，不適宜的發(fā)酵溫度會(huì)導(dǎo)致雜菌的生長(zhǎng)，從而破壞葡萄酒的感官質(zhì)量[10]。O.oeni的最適生長(zhǎng)溫度是25～28℃，而葡萄酒的MLF溫度為18～22℃，綜合考慮，選擇在18～28℃不同的溫度下，對(duì)菌株酶活性變化情況進(jìn)行測(cè)定分析。

由圖4可知，在不同發(fā)酵溫度下，本土O.oeni菌株與商業(yè)菌株的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量不同。菌株VP41在22℃時(shí)有最大β-D-葡萄糖苷酶活力累積量(60.637 mU/mL)，而本土O.oeni菌株的最大酶活性則是在20℃產(chǎn)生，且菌株ZX-1和GF-2的最大酶活性沒(méi)有顯著性差異(P<0.05)。雖有研究證明28℃為O.oeni菌株較適宜的生長(zhǎng)溫度，但28℃時(shí)本土O.oeni菌株與商業(yè)菌株的β-D-葡萄糖苷酶活性較低。菌株VP41的最大雙糖苷酶活性在28℃產(chǎn)生(29.695 mU/mL)。本土O.oeni菌株在22℃時(shí)雙糖苷酶活力累積量最小，最大酶活性在18℃時(shí)產(chǎn)生。

2.3 復(fù)合發(fā)酵條件下菌株酶活性的測(cè)定

葡萄酒釀造過(guò)程中，多個(gè)發(fā)酵參數(shù)會(huì)協(xié)同影響O.oeni的生長(zhǎng)，O.oeni對(duì)葡萄酒生境的耐受能力決定著MLF的進(jìn)展程度。因此，在復(fù)合發(fā)酵條件下測(cè)定供試菌株的酶活性，對(duì)依據(jù)釀造風(fēng)格選擇MLF菌株更具有參考價(jià)值[28]。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，pH值選取3.4、3.6、3.8共3個(gè)水平，雖然較高濃度的乙醇會(huì)抑制O.oeni的生長(zhǎng)，但大部分干型葡萄酒的酒精度在10～15%vol之間，為了模擬真實(shí)的葡萄酒環(huán)境，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)10%、12%和14%共3個(gè)水平進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。結(jié)合干型葡萄酒釀造工藝的要求，選擇SO2添加量為30、45、60 mg/L進(jìn)行復(fù)合因子發(fā)酵試驗(yàn)。28℃是O.oeni菌株生長(zhǎng)的較佳培養(yǎng)溫度，但過(guò)高的發(fā)酵溫度存在揮發(fā)酸過(guò)量的風(fēng)險(xiǎn)[15]。因此，結(jié)合葡萄酒MLF的實(shí)際情況，在復(fù)合發(fā)酵試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)選擇發(fā)酵溫度為18、20、22℃。

2.3.1β-D-葡萄糖苷酶活性

由表2可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為12%時(shí)，供試菌株有最大的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量，分別為22.716 mU/mL(ZX-1)、23.990 mU/mL(GF-2)、23.506 mU/mL(VP41)；當(dāng)SO2添加量為30 mg/L時(shí)，ZX-1的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量為25.507 mU/mL，GF-2的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量為27.914 mU/mL，VP41的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量為29.529 mU/mL；與pH值3.4、3.8相比，pH值為3.6時(shí)，供試菌株的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量達(dá)到最大值，且在發(fā)酵溫度22℃時(shí)，菌株的酶活性也較好。

表2 β-D-葡萄糖苷酶活性測(cè)定正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析

從極差R可以看出，不同發(fā)酵因素對(duì)菌株ZX-1的β-D-葡萄糖苷酶活性影響從大到小依次為：SO2添加量、發(fā)酵溫度、pH值、乙醇體積分?jǐn)?shù)；對(duì)菌株GF-2的β-D-葡萄糖苷酶活性影響從大到小依次為：SO2添加量、pH值、乙醇體積分?jǐn)?shù)、發(fā)酵溫度；對(duì)VP41菌株β-D-葡萄糖苷酶活性影響從大到小依次為：SO2添加量、發(fā)酵溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)、pH值。

由表3可知，SO2添加量對(duì)供試菌株的β-D-葡萄糖苷酶活性有極顯著影響(P<0.01)。pH值、發(fā)酵溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株ZX-1和VP41的β-D-葡萄糖苷酶活性有顯著影響(P<0.05)；pH值、乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株GF-2的β-D-葡萄糖苷酶活性有顯著影響(P<0.05)。

表3 β-D-葡萄糖苷酶活性測(cè)定正交試驗(yàn)方差分析

2.3.2雙糖苷酶活性

在復(fù)合發(fā)酵條件下，菌株的雙糖苷酶活性表現(xiàn)出相似性，即在乙醇體積分?jǐn)?shù)為12%、SO2添加量為30 mg/L、pH值3.6、發(fā)酵溫度22℃的條件下，具有最大的雙糖苷酶活力累積量。由表4可知，供試菌株的雙糖苷酶活力累積量有差異，從大到小依次為GF-2(46.576 mU/mL)、ZX-1(46.806 mU/mL)、VP41(36.774 mU/mL)。

表4 雙糖苷酶活性測(cè)定正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析

從極差R可以看出，不同發(fā)酵因素對(duì)菌株ZX-1雙糖苷酶活性影響從大到小依次為：SO2添加量、pH值、乙醇體積分?jǐn)?shù)、發(fā)酵溫度；對(duì)菌株GF-2雙糖苷酶活性影響從大到小依次為：SO2添加量、pH值、乙醇體積分?jǐn)?shù)、發(fā)酵溫度；對(duì)菌株VP41雙糖苷酶活性影響從大到小依次為：SO2添加量、乙醇體積分?jǐn)?shù)、發(fā)酵溫度、pH值。

由表5可知，SO2添加量對(duì)供試菌株的雙糖苷酶活性影響極顯著(P<0.01)。pH值、乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株ZX-1和GF-2的雙糖苷酶活性有顯著影響(P<0.05)；發(fā)酵溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)菌株VP41的雙糖苷酶活性有顯著影響(P<0.05)。

表5 雙糖苷酶活性測(cè)定正交試驗(yàn)方差分析

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，選擇受試組中β-D-葡萄糖苷酶活性和雙糖苷酶活性最高的發(fā)酵條件，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為12%、pH值為3.6、SO2添加量為30 mg/L、發(fā)酵溫度為22℃的復(fù)合條件下，將發(fā)酵菌株分別接種于模擬汁中，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平行重復(fù)3次。結(jié)果表明ZX-1、 GF-2和VP41的β-D-葡萄糖苷酶活力累積量平均值分別為30.020、29.884、33.032 mU/mL，雙糖苷酶活力累積量平均值分別為45.932、46.137、37.011 mU/mL，均高于正交試驗(yàn)其他處理組。由此確定在該條件下進(jìn)行霞多麗干白葡萄酒MLF，并進(jìn)行萜烯類物質(zhì)檢測(cè)分析。

2.5 微釀試驗(yàn)

2.5.1MLF后葡萄酒理化指標(biāo)

霞多麗干白葡萄酒的基本理化指標(biāo)見(jiàn)表6。由表6可知，各酒樣中L-蘋(píng)果酸質(zhì)量濃度均小于0.2 g/L，表明MLF成功完成。pH值升高0.11～0.16，總酸質(zhì)量濃度降低2.48～2.62 g/L。揮發(fā)酸含量雖然有所升高，但質(zhì)量濃度最大值為0.42 g/L(<1.2 g/L)，均符合GB/T 15037—2006的要求。供試本土O.oeni菌株在第12天完成MLF，商業(yè)菌株VP41則在第14天完成MLF。

表6 蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵前后干白葡萄酒樣理化指標(biāo)

2.5.2萜烯類化合物GC-MS檢測(cè)

不同處理?xiàng)l件下，各處理組中萜烯類化合物含量的變化情況見(jiàn)表7。ZX-1處理組中萜烯類物質(zhì)的總含量最高，質(zhì)量濃度為515.897 μg/L，而VP41處理組中的萜烯類物質(zhì)種類最多(11種)。2.3節(jié)的研究表明，雖然在不同復(fù)合條件下，菌株VP41的雙糖苷酶活力累積量顯著低于本土O.oeni(P<0.05)，但其β-D-葡萄糖苷酶在最優(yōu)復(fù)合條件下顯著高于本土O.oeni的酶活力累積量(P<0.05)。萜烯類物質(zhì)在葡萄果實(shí)中主要以雙糖苷的形式存在，在葡萄酒中雙糖苷酶作用生成的單糖苷物質(zhì)由β-D-葡萄糖苷酶進(jìn)一步水解，生成游離態(tài)的萜烯類物質(zhì)。本土O.oeni發(fā)酵后的酒樣中雖然萜烯類物質(zhì)種類僅次于VP41處理后的酒樣，但酒樣中的總含量卻較高，α-松油醇、香茅醇、大馬士酮、芳樟醇等萜烯類物質(zhì)的質(zhì)量濃度高于其閾值，具有潛在的花香味。

表7 各處理酒樣中萜烯類物質(zhì)含量的變化

3 討論

3.1 釀造因子對(duì)O.oeni糖苷酶活性的影響

一些葡萄酒成分，如糖和乙醇，或釀酒過(guò)程中的溫度和pH值等因素均會(huì)影響糖苷的活性[14]。本試驗(yàn)選擇糖苷酶活性表現(xiàn)較好的2株本土O.oeni(GF-2、ZX-1)和商業(yè)菌株VP41，分析初始pH值、乙醇體積分?jǐn)?shù)、SO2添加量、發(fā)酵溫度等對(duì)菌株的糖苷酶活特性進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同釀造因子對(duì)同一菌株的糖苷酶活性影響不同，且存在著顯著差異(P<0.05)。文獻(xiàn)[2]研究表明，pH值是抑制O.oeni菌株酶活性的重要因子，與菌株酶活性呈正相關(guān)，這與本試驗(yàn)中供試菌株在pH值為3.6～3.8時(shí)，菌株的酶活力累積量最高的結(jié)果相一致。同時(shí)在本試驗(yàn)中當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為6%～8%時(shí)，菌株糖苷酶活性最大；乙醇體積分?jǐn)?shù)為10%～14%時(shí)，糖苷酶活性緩慢下降，與文獻(xiàn)[29]中乙醇影響O.oeni菌株的生長(zhǎng)參數(shù)，卻不影響酶活性的研究結(jié)果存在差異?？赡苁且?yàn)橐掖几淖兞思?xì)胞膜的通透性，從而使胞內(nèi)酶和底物之間更容易接觸[14]。同時(shí)酶活性的降低可以解釋為蛋白質(zhì)變性的結(jié)果。文獻(xiàn)[16]的研究強(qiáng)調(diào)了添加SO2可能有助于調(diào)節(jié)MLF期間O.oeni的糖苷酶活性，本研究發(fā)現(xiàn)菌株在30 mg/L時(shí)有最大酶活性，得到了類似的結(jié)果。發(fā)酵溫度是葡萄酒釀造過(guò)程中最可控的因素之一，菌株VP41在22℃時(shí)有最大β-D-葡萄糖苷酶活性，而本土O.oeni菌株的最大酶活性則是在20℃產(chǎn)生，雖有研究證明28℃為O.oeni菌株較適宜的生長(zhǎng)溫度，但本土O.oeni菌株與商業(yè)菌株的β-D-葡萄糖苷酶活性較低；菌株VP41的最大雙糖苷酶活性在28℃產(chǎn)生，本土O.oeni菌株最大雙糖苷酶活性在18℃產(chǎn)生，這提示在葡萄酒實(shí)際生產(chǎn)中，應(yīng)根據(jù)發(fā)酵菌株特點(diǎn)選擇最適宜的發(fā)酵溫度。

3.2 O.oeni對(duì)葡萄酒萜烯類物質(zhì)的影響

萜烯類化合物氣味閾值低、風(fēng)味強(qiáng)烈、感官特征明顯，主要以糖苷態(tài)的形式存在于葡萄果皮中。O.oeni在MLF過(guò)程中降低葡萄酒酸度的同時(shí)伴隨著一系列的代謝活動(dòng)，其中大量的酶代謝使得產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物濃度遠(yuǎn)超過(guò)其閾值，致使葡萄酒香氣濃郁度增加。本試驗(yàn)接種不同O.oeni菌株分別對(duì)霞多麗干白葡萄酒進(jìn)行MLF，結(jié)果表明本土菌株處理的酒樣雖然萜烯類物質(zhì)種類僅次于VP41處理后的酒樣，但酒樣中的總含量卻較高，α-松油醇、香茅醇、大馬士酮、芳樟醇等萜烯類物質(zhì)的含量高于其閾值，這與菌株具有的糖苷酶活性及類型有關(guān)。文獻(xiàn)[30]發(fā)現(xiàn)，MLF后酒樣中β-大馬士酮的濃度明顯增加，表明該化合物的形成可能與參與的菌株的水解活性有關(guān)。文獻(xiàn)[15]發(fā)現(xiàn)接種O.oeniMS46的葡萄酒MLF后的酒樣中形成了β-香茅醇(柑橘香味)，可能是經(jīng)菌株MS46的糖苷酶對(duì)底物釋放后合成。本研究正如預(yù)期，MLF后萜烯類化合物質(zhì)量濃度明顯增加，與文獻(xiàn)[11]的結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

(1)在單因素條件下，供試菌株糖苷酶活性變化趨勢(shì)具有菌株相似性，在不同梯度條件下產(chǎn)酶活性具有一定的菌株差異性。當(dāng)pH值為3.6時(shí)本土O.oeni菌株的糖苷酶活性均具有最大酶活性，且菌株ZX-1、GF-2的兩種酶活性高于商業(yè)菌株VP41的酶活性；乙醇體積分?jǐn)?shù)在6%～8%時(shí)，供試菌株的糖苷酶都有最大酶活性；SO2添加量為30 mg/L時(shí)，供試菌株的β-D-葡萄糖苷酶和雙糖苷酶的酶活性均達(dá)到峰值；本土O.oeni的β-D-葡萄糖苷酶在20℃時(shí)產(chǎn)生的酶活性最高，菌株VP41在22℃下酶活性有最大值。復(fù)合釀造因子試驗(yàn)結(jié)果表明，在pH值3.6、乙醇體積分?jǐn)?shù)為12%、SO2添加量為30 mg/L、發(fā)酵溫度為22℃的發(fā)酵條件下，供試菌株均有最大酶活力累積量，但本土O.oeni菌株的糖苷酶活力累積量高于商業(yè)菌株VP41。

(2)霞多麗干白葡萄酒微釀試驗(yàn)結(jié)果表明，供試本土菌株具有良好的L-蘋(píng)果酸降解能力。萜烯類化合物GC-MS分析結(jié)果顯示，本土O.oeniZX-1發(fā)酵后的酒樣中雖然萜烯類物質(zhì)種類僅次于VP41處理后的酒樣，但酒樣中的總含量卻最高(質(zhì)量濃度515.897 μg/L)，α-松油醇、香茅醇、大馬士酮、芳樟醇等萜烯類物質(zhì)的質(zhì)量濃度高于其閾值，具有潛在的花香味，這與供試菌株的風(fēng)味酶活性累積量變化規(guī)律相一致。