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    H2S對(duì)Graves甲亢小鼠甲狀腺功能與甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制*

    2021-08-26 06:21:30歐慧婷汪新宇余懷新陳澤龍李明政
    西部醫(yī)學(xué) 2021年8期
    關(guān)鍵詞:濾泡咪唑染色

    歐慧婷 汪新宇 余懷新 陳澤龍 李明政

    (深圳市第二人民醫(yī)院內(nèi)分泌科,廣州 深圳 518035)

    Graves甲亢(Graves’disease,GD)是一種全身特異性自身免疫疾病,也是甲狀腺功能亢進(jìn)癥的最常見原因,占所有患者的50%~80%[1]。甲亢是由于甲狀腺受刺激后產(chǎn)生過多的甲狀腺激素引起內(nèi)分泌代謝性疾病,臨床主要表現(xiàn)為高代謝癥候群、交感神經(jīng)興奮癥候群及甲狀腺腫大,部分患者伴有突眼或脛前粘液性水腫[2]。目前,GD 甲亢的發(fā)病機(jī)制尚不明確,治療手段主要包括抗甲狀腺藥物、放射性碘和甲狀腺切除術(shù),但這3種治療手段均有利有弊。硫化氫(H2S)是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后發(fā)現(xiàn)的第三氣體調(diào)節(jié)分子,H2S 在機(jī)體大部分組織均可內(nèi)源性生成,其中以腦、心血管系統(tǒng)、肝臟、腎臟生成最多[3]。近些年來,研究證實(shí)H2S具有很好的抗氧化效應(yīng),可以有效地保護(hù)細(xì)胞免受氧化脅迫介導(dǎo)的損害[4-6]。但關(guān)于H2S在甲狀腺疾病中特別是Graves 甲亢中的研究報(bào)道卻相對(duì)較少。因此,本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建Graves甲亢小鼠模型來探討H2S對(duì)Graves甲亢小鼠甲狀腺功能的影響,以及對(duì)H2O2誘導(dǎo)甲狀腺細(xì)胞損傷是否具有保護(hù)作用。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)6~8 周雌性 BALB/c 小鼠45只,均購(gòu)自深圳大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。將小鼠飼養(yǎng)于溫度恒定在(20±3)℃,相對(duì)濕度為(40±5)%,每日光照:黑暗時(shí)間=12 h:12 h的飼養(yǎng)箱內(nèi),飼養(yǎng)環(huán)境符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施要求,期間小鼠自由飲水?dāng)z食。

    1.2 主要試劑 Ad-TSHR289重組腺病毒和空載體病毒由武漢維諾賽生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)構(gòu)建;NaHS、100 IU/mL青霉素與100 μg/mL 鏈霉素、胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;甲疏咪唑購(gòu)自德國(guó)默克公司;HE染色、RIPA裂解緩沖液和BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物研究所;免疫組織化學(xué)染色試劑購(gòu)自上海太陽(yáng)生物科技公司;抗體NIS、TPO、Tg購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;抗體PCNA、CyclinD1、GAPDH購(gòu)自美國(guó) Abcam 公司;HRP標(biāo)記的山羊抗兔購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司;CCK-8試劑盒和Annexin V-FITC/ PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;血清TRAb、T4 和 TSH ELISA測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司;其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.3 方法

    1.3.1 GD 動(dòng)物模型的建立 將45只BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、空載體病毒組和重組腺病毒組,每組15只。重組腺病毒組小鼠采用Ad-TSHR289重組腺病毒進(jìn)行脛前肌注射誘導(dǎo)GD小鼠模型,于實(shí)驗(yàn)第0、3、6周進(jìn)行注射,共注射三次。同時(shí),空載體病毒組小鼠注射空載體病毒,正常對(duì)照組小鼠注射等體積PBS溶液。飼養(yǎng)至第10 周時(shí)采集各組小鼠尾靜脈血,檢測(cè)血清促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)、甲狀腺素(T4)和促甲狀腺激素(TSH)濃度。

    將造模階段正常對(duì)照組和空載體病毒組小鼠繼續(xù)保留,將GD造模成功[7]的15只小鼠隨機(jī)分為3組:模型組(GD)、H2S組及甲疏咪唑組,每組5只。H2S組小鼠予以NaHS 溶液(56 μmol/kg/d)腹腔注射,甲疏咪唑組小鼠予以甲疏咪唑溶液腹腔注射(3.9 mg/kg/d),正常對(duì)照組和空載體病毒組小鼠予以等體積 0.9%Nacl 溶液腹腔注射,共干預(yù) 4 周。4周后,取各組小鼠血清、甲狀腺組織,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),符合善待動(dòng)物的倫理學(xué)要求。

    1.3.2 血清TRAb、T4 和 TSH測(cè)定水平 將采集的靜脈血在室溫下靜置待血液自然凝固分層后,析出少量血清,在離心機(jī)3000 rpm下離心10 min,取上清液,按照試劑盒說明書測(cè)定血清樣本中TRAb、T4 和 TSH濃度。

    1.3.3 甲狀腺組織病理學(xué)觀察 小鼠取血后處死,迅速解剖小鼠摘取甲狀腺組織,采用4%多聚甲醛固定甲狀腺組織。固定24 h后,經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明,浸蠟與包埋,使用切片機(jī)連續(xù)切成厚度為5 μm的切片,進(jìn)行HE染色,石蠟切片脫蠟水化后,用蘇木素染色5 min,自來水沖洗,1%鹽酸乙醇溶液中分化5 s,自來水沖洗,0.5%伊紅染色2 min,脫水與透明后,中性樹膠封片,在光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

    1.3.4 免疫組織化學(xué)染色 將甲狀腺組織石蠟切片二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后,在3% 過氧化氫中處理 30 min,高溫(98 ℃)下加熱5 min,加入山羊血清室溫孵育1 h,加入兔抗PCNA(1∶100)、CyclinD1(1∶250),4 ℃孵育過夜。PBS 液洗后,加二抗室溫孵育1 h。滴加 DAB 顯色,自來水洗滌,加蘇木素復(fù)染,二甲苯透明,中性樹膠封片,在光學(xué)顯微鏡下觀察圖像并拍照,通過ImageJ軟件對(duì)免疫組化染色結(jié)果圖片進(jìn)行分析。

    1.3.5 Western blot檢測(cè)NIS、TPO及Tg蛋白表達(dá) 將小鼠甲狀腺組織剪碎,加入RIPA裂解緩沖液進(jìn)行裂解,4 ℃下12000 r/min 離心20 min,取上清液,通過BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。以50 μg蛋白加樣并通過10% SDS-PAGE凝膠分離蛋白質(zhì),然后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,TBST洗膜后,加入稀釋后的兔抗NIS(1: 1000)、TPO(1∶1000)、Tg(1∶1000)抗體,以GAPDH(1∶1000)為內(nèi)參,4 ℃下孵育過夜。次日,TBST洗膜,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5000),室溫下孵育1 h,TBST洗膜后,滴加ECL化學(xué)發(fā)光液顯色曝光,凝膠成像系統(tǒng)拍照,使用Image Pro-Plus分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析。

    1.3.6 甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞分離與培養(yǎng) 將小鼠甲狀腺組織剪碎,D-Hanks 液洗滌后,加入含0.25% 胰蛋白酶、250 U/mL Ⅱ型膠原蛋白酶的消化液在37 ℃ 的水浴箱振蕩消化 60 min,以 1000 rpm離心 10 min,棄上清并加入DMEM培養(yǎng)基洗滌沉淀,將離心沉淀反復(fù)輕柔吹打均勻,培養(yǎng)于含有100 IU/mL青霉素和100 μg/mL 鏈霉素、100 mL/L 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,在37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中,次日換液,去除未貼壁的細(xì)胞,以后2~3 d 更換培養(yǎng)基 1 次,每 5 d 傳代 1 次。通過倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)與生長(zhǎng)狀況,培養(yǎng)第10 d時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行特異抗原NIS免疫熒光染色進(jìn)行鑒定。

    1.3.7 細(xì)胞分組與處理 將培養(yǎng)的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組、H2O2組及NaHS+H2O2組,并進(jìn)行不同處理:正常對(duì)照組甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞正常培養(yǎng),不進(jìn)行任何處理;H2O2組使用H2O2(400 μmol/L)溶液處理甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞24 h; NaHS+H2O2組先用 NaHS (400 μmol/L)預(yù)處理甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞 30 min,再用H2O2(400 μmol/L)溶液處理細(xì)胞24 h。

    1.3.8 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL,取100 μL接種于96 孔板培養(yǎng),在37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,按照1.3.7進(jìn)行分組處理后繼續(xù)培養(yǎng)至24、48、72 h時(shí),每孔加10 μL CCK-8溶液,再將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2 h,使用酶標(biāo)儀在450 nm 處檢測(cè)各組細(xì)胞吸光光度值。

    1.3.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞按照1.3.7進(jìn)行分組處理后,離心棄去培養(yǎng)基,用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次,加入500 μL 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞,在細(xì)胞懸浮液加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI混合均勻,室溫避光孵育30 min,立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

    2 結(jié)果

    2.1 各組小鼠血清中TRAb、T4 和 TSH水平比較 與正常對(duì)照組比較,重組腺病毒組小鼠血清中TRAb和T4的水平顯著上升,TSH水平顯著下降(均P<0.05),而空載體病毒組較正常對(duì)照組血清中TRAb、T4 和 TSH水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),這提示GD小鼠模型成功構(gòu)建,見表1。

    表1 造模第10 周各組小鼠血清中TRAb、T4 和 TSH水平比較

    藥物干預(yù)4 周后,檢測(cè)各組小鼠血清中TRAb、T4和TSH水平。與正常對(duì)照組比較,模型組、H2S組和甲疏咪唑組小鼠血清中TRAb和T4的水平顯著上升,TSH水平顯著下降(均P<0.05);與模型組比較,H2S組和甲疏咪唑組小鼠血清中TRAb和T4的水平顯著下降,TSH水平顯著升高(均P<0.05);H2S組和甲疏咪唑組血清中TRAb、T4 和 TSH水平比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表2。

    表2 藥物干預(yù)4 周各組小鼠血清中TRAb、T4 和 TSH水平比較

    2.2 各組小鼠甲狀腺組織病理學(xué)變化觀察 正常對(duì)照組和空載體病毒組小鼠甲狀腺組織中濾泡呈扁平狀,細(xì)胞排列整齊,濾泡腔光滑,可見紅色、均勻的膠質(zhì);模型組小鼠甲狀腺組織中濾泡大小不等,濾泡腔不光滑,腔內(nèi)膠質(zhì)明顯減少,并出現(xiàn)破裂的現(xiàn)象;H2S組和甲疏咪唑組小鼠甲狀腺組織較模型組甲狀腺組織細(xì)胞形態(tài)變化得到改善,細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù)扁平狀,濾泡腔內(nèi)的膠質(zhì)增加,見圖1。

    圖1 HE染色觀察各組小鼠甲狀腺組織病理學(xué)變化(400×)

    2.3 各組小鼠甲狀腺組織中PCNA與CyclinD1表達(dá)檢測(cè) 與正常對(duì)照組比較,模型組小鼠甲狀腺組織中PCNA與CyclinD1陽(yáng)性表達(dá)顯著增加(P<0.05),空載體病毒組較正常對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與模型組比較,H2S組和甲疏咪唑組小鼠PCNA與CyclinD1陽(yáng)性表達(dá)顯著減少(P<0.05),且H2S組和甲疏咪唑組PCNA與CyclinD1陽(yáng)性表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖2。

    圖2 免疫組化染色檢測(cè)各組小鼠甲狀腺組織PCNA與CyclinD1表達(dá)(400×)

    2.4 各組小鼠甲狀腺組織中NIS、TPO、Tg蛋白表達(dá)比較 與正常對(duì)照組比較,模型組小鼠甲狀腺組織中NIS、TPO與Tg蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05),而空載體病毒組較正常對(duì)照組NIS、TPO與Tg蛋白表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);與模型組比較,H2S組和甲疏咪唑組小鼠甲狀腺組織中NIS、TPO與Tg蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05),見圖3。

    圖3 Western blot檢測(cè)甲狀腺組織NIS、TPO、Tg蛋白表達(dá)

    2.5 光學(xué)顯微鏡觀察甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞 通過顯微鏡觀察從小鼠甲狀腺組織分離培養(yǎng)的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞,甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞貼壁式生長(zhǎng),呈梭形、多角形,形態(tài)較為均一。免疫熒光染色結(jié)果顯示,胞質(zhì)中可見較強(qiáng)的NIS熒光染色,見圖4。

    圖4 甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞觀察與鑒定

    2.6 各組甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞活力比較 與正常對(duì)照組比較,H2O2組甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞活性在培養(yǎng)24、48、72h顯著下降(均P<0.05);在培養(yǎng)48 h和72 h時(shí),NaHS+H2O2組甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞活性較H2O2組細(xì)胞活性顯著升高(P<0.05),見圖5。

    圖5 CCK-8檢測(cè)各組甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞活力

    2.7 各組甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞凋亡比較 與正常對(duì)照組比較,H2O2組甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05);NaHS+H2O2組甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞凋亡率較H2O2組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05),見圖6。

    圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞凋亡

    3 討論

    近年來,GD發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì),由于其具有病程長(zhǎng)、易復(fù)發(fā)的特點(diǎn),因此給患者帶來了極大痛苦,并給家庭和社會(huì)造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[8-9]。在 GD 發(fā)病過程中,免疫系統(tǒng)對(duì)甲狀腺正常組織成分的免疫耐受狀態(tài)被打破,免疫細(xì)胞被甲狀腺組織中的特異性抗原激活,產(chǎn)生抗甲狀腺組織的抗體,如針對(duì)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞 TSH 受體的特異性自身抗體,稱為TRAb[10-11],TRAb 含量的異常增高是GD 的發(fā)病關(guān)鍵,在發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。此外,T4是甲狀腺分泌的主要激素之一,其分泌量增多也是判斷甲亢發(fā)生的重要指標(biāo),TSH由垂體前葉嗜堿性細(xì)胞合成,是下丘腦-垂體-甲狀腺軸負(fù)反饋調(diào)節(jié)中的重要環(huán)節(jié),可調(diào)節(jié)甲狀腺激素的合成、分泌并促進(jìn)甲狀腺細(xì)胞的生長(zhǎng)[12-13]。研究表明,GD過程中,T4、T3過量分泌通過負(fù)反饋途徑抑制TSH的合成與分泌[14]。本研究中,通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)注射Ad-TSHR289重組腺病毒的小鼠血清中TRAb和T4的水平上升,且TSH水平下降,由此說明GD小鼠模型構(gòu)建成功。

    H2S是一種重要的氣體信號(hào)分子,與許多生理功能有密切的聯(lián)系,其可以通過影響一系列細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程以調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能,具有抗氧化、抗炎癥、降血壓、調(diào)節(jié)神經(jīng)功能以及促血管舒張等作用[15-17]。Chen等[18]發(fā)現(xiàn)在小鼠急性腎損傷后,H2S 能夠明顯降低細(xì)胞內(nèi) ROS 水平,抑制炎癥因子 TNF-α和 IL-1的產(chǎn)生。Kang等[19]的研究表明,當(dāng)大鼠肝臟缺血再灌注后肝臟組織受到氧化損傷,加入NaHS有效地降低組織內(nèi)炎癥因子 TNF-α和IL-10 分泌水平,同時(shí)抑制凋亡相關(guān)蛋白 caspase-3 的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)過NaHS干預(yù)后小鼠血清中TRAb和T4的水平顯著下降,TSH水平顯著升高,且小鼠甲狀腺組織病變得到明顯改善,組織中細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù),且濾泡腔內(nèi)的膠質(zhì)增加。同時(shí),通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NIS、TPO、Tg蛋白表達(dá)水平下降。甲狀腺功能失調(diào)是由于碘化物處理障礙導(dǎo)致甲狀腺激素的生物合成出現(xiàn)缺陷,繼而導(dǎo)致先天性甲狀腺功能減退,這也是常見的內(nèi)分泌疾病[20]。甲狀腺激素的生物合成需要碘化物的存在,NIS、TPO和Tg是甲狀腺素合成過程中的關(guān)鍵因子,而NIS、TPO及Tg增加是導(dǎo)致GD患者血清甲狀腺素升高的重要原因。

    CyclinD1是調(diào)節(jié)G1期細(xì)胞增殖的主要因子,PCNA是一種內(nèi)源性增殖細(xì)胞相關(guān)抗原,PCNA與CyclinD1作為細(xì)胞生長(zhǎng)的正性調(diào)節(jié)因子,PCNA羧基端通過與CyclinD1以及CDK結(jié)合成為具有活性的復(fù)合物,其之間相互協(xié)同對(duì)細(xì)胞由G1期過渡到S期起到了促進(jìn)作用[21-22]。CyclinD1在甲狀腺乳頭癌中表達(dá)增高,且在GD患者和小鼠甲狀腺組織中均發(fā)現(xiàn)PCNA表達(dá)的增加。本研究結(jié)果顯示,在NaHS作用下可抑制GD小鼠甲狀腺組織中PCNA與CyclinD1蛋白的陽(yáng)性表達(dá)。

    通過分離小鼠甲狀腺組織中甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),檢測(cè)H2S在H2O2誘導(dǎo)的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞損傷中的作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)過NaHS預(yù)處理后再經(jīng)過H2O2作用的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞,在培養(yǎng)48 h和72 h時(shí)細(xì)胞活性明顯高于H2O2組細(xì)胞活性,同時(shí)抑制了細(xì)胞的凋亡。因此,H2S對(duì)H2O2誘導(dǎo)的甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞損傷起到了保護(hù)作用。

    4 結(jié)論

    H2S能夠阻止GD小鼠血清中TRAb、T4水平升高及TSH水平下降,抑制甲狀腺組織中PCNA與CyclinD1陽(yáng)性表達(dá),同時(shí)下調(diào)NIS、TPO及Tg蛋白表達(dá),以改善甲狀腺組織病變。此外,H2S對(duì) H2O2誘導(dǎo)甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞氧化損傷具有一定的保護(hù)作用。但因GD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,H2S對(duì)甲狀腺功能與甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞的損傷的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入探討。

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