伊伐布雷定通過(guò)調(diào)控TIMP-1表達(dá)對(duì)冠心病大鼠抗心肌纖維化和心肌保護(hù)作用的機(jī)制*

白延平 陳俊民 劉智娜

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院 1.心內(nèi)科；2.麻醉科，陜西 延安 716000)

心血管疾病是全球范圍內(nèi)引發(fā)死亡和殘疾的主要原因，冠心病(Coronary Heart Disease)為心血管疾病之一，嚴(yán)重危害人類健康，其導(dǎo)致的死亡約占心血管疾病的一半[1]。冠心病的主要特征是動(dòng)脈粥樣硬化，可能致使血管腔狹窄或發(fā)生阻塞，從而導(dǎo)致缺血性心臟疾病的發(fā)生，如心絞痛和心肌梗塞[2-4]。伊伐布雷定(Ivabradine)是一種特殊的降低心率藥物，可選擇性地抑制竇房結(jié)細(xì)胞中的If電流，而不影響心肌收縮功能和血管以及房室、心室內(nèi)的傳導(dǎo)功能[5]。研究表明，伊伐布雷定具有縮小梗死面積、改善心功能、減輕心室重塑和延緩心力衰竭等作用，并且可以減輕心肌細(xì)胞凋亡和心臟功能障礙，發(fā)揮多效的心臟保護(hù)作用[6-7]。然而其在冠心病心肌纖維化過(guò)程中的作用與分子機(jī)制的相關(guān)研究報(bào)道卻相對(duì)較少。本研究通過(guò)構(gòu)建冠心病大鼠模型，探討伊伐布雷定對(duì)冠心病大鼠抗心肌纖維化及心肌損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)，雄性SD大鼠60只，鼠齡7～8周，體重180～220 g，購(gòu)自延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。本研究經(jīng)延安大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 伊伐布雷定(法國(guó)Servier公司)；維生素 D3注射液(江蘇吳中醫(yī)藥集團(tuán)有限公司)；胎牛血清(美國(guó) Gibco公司)；超氧化物歧化酶試劑盒和總丙二醛劑盒(南京建成生物工程研究所)；腦鈉肽檢測(cè)試劑盒(上海百沃科技有限公司)；蘇木精-伊紅染色試劑(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司)；Masson 染色試劑盒(北京世洛合力試劑公司)；抗體TIMP-1、collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、Cleaved-Caspase3、Bcl-2、Bax(北京中杉金橋生物有限公司)；抗體GAPDH和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(美國(guó)Abcam公司)；免疫組化染色試劑(上海古朵生物科技有限公司)；RIPA 裂解緩沖液、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組、造模及給藥 將SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，按照隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠隨機(jī)分為4組，包括對(duì)照組、模型組和伊伐布雷定低、高劑量組，每組15只。對(duì)照組大鼠給予基礎(chǔ)飼料(配方：玉米73.5%、麥麩20%、魚(yú)粉5%、谷粉1%、食鹽0.5%)喂養(yǎng)。其他3組大鼠參照文獻(xiàn)[8]方法構(gòu)建冠心病大鼠模型：大鼠每日給予高脂食物(配方：基礎(chǔ)飼料78.8%、膽固醇1%、牛膽鹽0.2%、蛋黃粉10%、豬油10%)連續(xù)喂養(yǎng)，腹腔注射維生素D3 (0.7 mL/kg)，連續(xù)注射 3 d。12 周后，檢測(cè)大鼠心電圖，T 波抬高則表示冠心病模型建立成功。造模成功后，參考文獻(xiàn)給藥劑量[9]，伊伐布雷定低、高劑量組大鼠分別按照10 mg/kg、20 mg/kg的伊伐布雷定灌胃給藥，對(duì)照組和模型組大鼠同時(shí)給予等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)給藥4 周后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 超聲成像系統(tǒng)檢測(cè)心功能指標(biāo) 末次給藥后第2 d，使用 20%氨基甲酸乙酯腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定，采用小動(dòng)物超聲成像Vevo2100系統(tǒng)(Visual Sonics公司)檢測(cè)大鼠的超聲心動(dòng)圖，測(cè)定指標(biāo)包括射血分?jǐn)?shù)(Ejection Fraction，EF)、左心室縮短分?jǐn)?shù)(Fraction Shortening，F(xiàn)S)、左心室舒張期內(nèi)徑(Left Ventricular End-Diastolic Dimension，LVDD)和左心室收縮期內(nèi)徑(Left Ventricular Internal Dimension Systole，LVDS)。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 心功能檢測(cè)結(jié)束后，打開(kāi)大鼠腹腔，腹主動(dòng)脈采集血液，在4 ℃低速離心機(jī)中以 4000 r/min 離心 5 min，取上層血清，用酶聯(lián)免疫分析儀測(cè)定丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)和腦鈉肽(BNP)水平，操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.4 HE 染色 將大鼠主動(dòng)脈弓和心肌組織用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，修剪包埋，浸于梯度乙醇進(jìn)行脫水，二甲苯透明，常規(guī)石蠟包埋，制成4 μm 的石蠟組織切片，蘇木精染色 5 min，流水沖洗后，伊紅染色液染色3 min，無(wú)水乙醇脫水，二甲苯中透明，中性樹(shù)膠封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖片，觀察斑塊橫截面和心肌組織的病理特征。

1.3.5 Masson 染色 將心肌組織石蠟切片脫蠟至水，用weigert氏蘇木溶液染處理10 min，1%鹽酸乙醇分化1 min，蒸餾水沖洗25 min，麗春紅酸性品紅液染色10 min，l%磷鉬酸水溶液分化5 min，2%亮綠染液染5 min，1%冰醋酸水溶液浸洗1 min。隨后分別用95%乙醇、無(wú)水乙醇脫水，二甲苯中透明，中性樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌間質(zhì)膠原纖維的表達(dá)情況，紅色為心肌組織，藍(lán)色為膠原纖維組織。

1.3.6 免疫組化染色 將心肌組織石蠟切片脫蠟至水，采用0.01 mol/L枸椽酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，3% H2O2溶液去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，10%羊血清室溫封閉30 min，分別滴加一抗抗體TIMP-1(1∶100)、collagen Ⅰ(1∶200)和collagen Ⅲ(1∶200)，在4℃下孵育過(guò)夜。次日，PBS 沖洗，滴加對(duì)應(yīng)的二抗抗體室溫孵育30 min。PBS 再次沖洗，滴加DAB 顯色，經(jīng)復(fù)染、脫水、透明后，中性樹(shù)膠封片，在電子顯微鏡下觀察并進(jìn)行圖像采集，免疫組化染色后陽(yáng)性細(xì)胞呈棕色至棕褐色著色。

1.3.7 Western blot檢測(cè) 將心肌組織剪碎并加入RIPA 裂解緩沖液進(jìn)行裂解，提取組織總蛋白，BCA 法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，電泳。10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，切膠并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗抗體TIMP-1(1∶1000)、Cleaved-Caspase3(1∶1000)、Bcl-2(1∶500)和Bax(1∶500)，以GAPDH(1∶5000)抗體為內(nèi)參，在4℃下孵育過(guò)夜。次日，TBST 漂洗 PVDF膜，將PVDF膜與HRP 標(biāo)記的二抗常溫孵育 1 h，TBST 洗膜后，滴 ECL 發(fā)光液進(jìn)行曝光，使用Image-Pro Plus 6.0分析蛋白質(zhì)灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較 造模12周后，對(duì)照組大鼠表現(xiàn)出規(guī)則的竇性心律，見(jiàn)圖1。與對(duì)照組比較，模型組大鼠的心電圖中觀察到不規(guī)則的竇性心律，ST段明顯升高，說(shuō)明造模成功。在藥物治療后，各組大鼠超聲心動(dòng)圖檢測(cè)結(jié)果，見(jiàn)圖2A。與對(duì)照組比較，模型組大鼠EF、FS均顯著下降，LVDD和LVSD顯著增加(P<0.05)；經(jīng)過(guò)高、低劑量伊伐布雷定作用的大鼠，EF和FS較模型組顯著升高，LVDD和LVSD較模型組顯著減小(P<0.05)，見(jiàn)圖2B。

圖1 兩組大鼠心電圖檢測(cè)結(jié)果

圖2 超聲成像系統(tǒng)檢測(cè)各組大鼠心功能相關(guān)指標(biāo)

2.2 各組大鼠血清MDA、SOD、BNP水平比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清MDA濃度顯著升高，SOD活性顯著降低，BNP水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，伊伐布雷定低劑量組和伊伐布雷定高劑量組大鼠血清MDA濃度顯著降低，SOD活性顯著升高，BNP水平顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清MDA、SOD、BNP水平比較

2.3 各組大鼠主動(dòng)脈弓與心肌組織HE染色結(jié)果 對(duì)照組大鼠的血管內(nèi)膜中沒(méi)有形成斑塊，而模型組斑塊面積較大，所占比例較高；伊伐布雷定低、高劑量組中斑塊面積比例較模型組顯著下降，見(jiàn)圖3。

圖3 HE染色檢測(cè)各組大鼠主動(dòng)脈中的病理學(xué)變化(20×)

心肌組織HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠心肌纖維緊密、有序排列，心肌細(xì)胞大小均勻，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象；模型組大鼠心肌纖維較大，排列紊亂，心肌細(xì)胞肥大、變性和壞死，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)；伊伐布雷定低、高劑量組大鼠經(jīng)伊伐布雷定給藥后，大鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)完整，心肌細(xì)胞排列較為規(guī)則，病變現(xiàn)象得到明顯的改善，見(jiàn)圖4。

圖4 HE染色檢測(cè)各組大鼠心肌組織病理學(xué)變化(200×)

2.4 各組大鼠心肌組織Masson染色結(jié)果 Masson染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，間質(zhì)有少量的膠原纖維；模型組大鼠心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂，數(shù)目減少，并出現(xiàn)大量的藍(lán)色膠原纖維；伊伐布雷定低、高劑量組大鼠心肌細(xì)胞較為完整，有較少的藍(lán)色膠原纖維，且高劑量組比低劑量組的膠原纖維化程度輕，見(jiàn)圖5。

圖5 Masson 染色檢測(cè)各組大鼠心肌組織膠原纖維化程度(200×)

2.5 各組大鼠心肌組織TIMP-1免疫組化染色結(jié)果 免疫組化染色檢測(cè)TIMP-1表達(dá)的結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織有大量棕褐色著色，TIMP-1陽(yáng)性表達(dá)率顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，經(jīng)過(guò)伊伐布雷定低、高劑量治療后，兩組大鼠心肌組織中棕褐色著色減少，TIMP-1陽(yáng)性表達(dá)率顯著減少(P<0.05)，見(jiàn)圖6、表2。

圖6 免疫組化染色檢測(cè)各組大鼠心肌組織TIMP-1表達(dá)(100×)

2.6 各組大鼠心肌組織collagen Ⅰ和collagen Ⅲ免疫組化染色結(jié)果 免疫組化染色檢測(cè)collagen Ⅰ和collagen Ⅲ表達(dá)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織出現(xiàn)較深的棕褐色染色，collagen Ⅰ和collagen Ⅲ陽(yáng)性表達(dá)率均顯著增加(P<0.05)；伊伐布雷定低、高劑量組大鼠心肌組織中染色變淺，collagen Ⅰ和collagen Ⅲ 陽(yáng)性表達(dá)率較模型組顯著減少(P<0.05)，見(jiàn)圖7、表2。

圖7 免疫組化染色檢測(cè)各組大鼠心肌組織collagen Ⅰ和collagen Ⅲ表達(dá)(200×)

表2 各組大鼠心肌組織TIMP-1、collagen Ⅰ和collagen Ⅲ 陽(yáng)性表達(dá)率

2.7 各組大鼠心肌組織TIMP-1、Cleaved-Caspase3、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織中TIMP-1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高，而經(jīng)伊伐布雷定低、高劑量治療的兩組大鼠心肌組織中，TIMP-1蛋白相對(duì)表達(dá)量較模型組顯著降低(均P<0.05)；與對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織中Cleaved-Caspase3和Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高，而 Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，伊伐布雷定低、高劑量組心肌組織中Cleaved-Caspase3和Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下降，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，見(jiàn)圖8。

圖8 Western blot檢測(cè)各組大鼠心肌組織TIMP-1、Cleaved-Caspase3、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)

3 討論

冠心病作為典型的復(fù)雜疾病，發(fā)生、發(fā)展主要在于遺傳和環(huán)境因素的失調(diào)。高脂肪、高熱量、高血壓和高膽固醇以及糖尿病、吸煙、缺乏體育鍛煉、飲食不良以及精神緊張等都可能導(dǎo)致冠心病的發(fā)生[10-12]。伊伐布雷定作為一種抗心律失常的藥物，目前的研究已顯示，其治療后可降低因心臟癥狀而導(dǎo)致的死亡現(xiàn)象。Chen等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，伊伐布雷定可明顯減輕糖尿病小鼠的心肌細(xì)胞凋亡和心臟功能障礙。Zuo等[14]的報(bào)道指出伊伐布雷定通過(guò)抑制JNK/p38 MAPK通路介導(dǎo)的炎癥和凋亡，從而發(fā)揮在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠心臟功能中的保護(hù)作用。本研究通過(guò)高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合注射維生素 D3構(gòu)建冠心病大鼠模型，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)造模大鼠出現(xiàn)EF和FS下降、LVDD和LVSD增加的現(xiàn)象，并且心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂，心肌細(xì)胞肥大、變性及壞死，以上結(jié)果均說(shuō)明冠心病大鼠模型構(gòu)建成功，大鼠心肌組織受到了一定程度的損傷。而經(jīng)過(guò)伊伐布雷定治療后，大鼠EF和FS升高，LVDD和LVSD減小，心肌組織損傷情況得到了明顯的改善。

心肌纖維化是指冠狀動(dòng)脈長(zhǎng)期狹窄后，導(dǎo)致的心肌缺血缺氧、心肌細(xì)胞肥大或萎縮，以及間質(zhì)纖維增生的現(xiàn)象[15-17]。研究表明，心肌纖維化程度是預(yù)測(cè)不良心臟預(yù)后的重要指標(biāo)。冠心病動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重的心肌損傷過(guò)程是心肌纖維化和心肌細(xì)胞凋亡兩者結(jié)合的作用結(jié)果[18]。心肌細(xì)胞的凋亡會(huì)導(dǎo)致心肌收縮功能喪失，在冠心病進(jìn)展中具有至關(guān)重要的作用，抗心肌細(xì)胞凋亡也是冠心病潛在的治療策略之一。已報(bào)道指出細(xì)胞凋亡會(huì)導(dǎo)致纖維化現(xiàn)象的發(fā)生[19]。因此誘導(dǎo)心肌再生、逆轉(zhuǎn)心肌組織纖維化和促進(jìn)受損心臟功能恢復(fù)成為冠心病治療的重要目標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)伊伐布雷定治療的大鼠心肌組織纖維化程度明顯減小，同時(shí)，心肌組織內(nèi)collagen Ⅰ和collagen Ⅲ表達(dá)減少，促凋亡蛋白Cleaved-Caspase3和Bax的表達(dá)量下降，抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量增加，說(shuō)明伊伐布雷定能夠抑制心肌組織纖維化和心肌細(xì)胞凋亡，從而起到心肌保護(hù)的作用。

TIMP-1作為基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)的抑制劑，由多種類型的細(xì)胞表達(dá)，并存在于大多人體組織和體液中[20-21]。MMP1和TIMP1之間的水平平衡控制著細(xì)胞周?chē)植考?xì)胞外基質(zhì)降解的程度，從而影響細(xì)胞的遷移、增殖和存活等過(guò)程[22]。此外，TIMP-1具有獨(dú)特的腫瘤刺激功能，如TIMP-1過(guò)表達(dá)可能通過(guò)VEGF促進(jìn)腫瘤血管發(fā)生，促進(jìn)浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，乳腺癌中TIMP-1過(guò)表達(dá)和預(yù)后不良相關(guān)[23-25]。在本研究中，冠心病大鼠心肌組織中TIMP1出現(xiàn)異常高表達(dá)，經(jīng)過(guò)伊伐布雷定治療后抑制了 TIMP1的表達(dá)，這可能是其作用機(jī)制之一。

4 結(jié)論

伊伐布雷定對(duì)冠心病大鼠的心臟保護(hù)作用可能與抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善組織學(xué)異常和組織纖維化，抑制TIMP-1的異常高表達(dá)等相關(guān)。