黑安格斯牛CEBPA基因的克隆及生物信息學(xué)分析

周子航，封 元，王 瑜，蔣秋斐，張 娟，馬正旭，黃增文，馮小芳，郭 菊，王 影，禹保軍，王衛(wèi)振，顧亞玲

(1 寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2 寧夏畜牧工作站，寧夏 銀川 750001)

黑安格斯肉牛品種優(yōu)良，原產(chǎn)地為英國，由于其適應(yīng)能力較強、出肉率高、繁殖性能強、生長速度快、飼料利用率高、肉品質(zhì)好等特點被引入我國[1]，屬于專門化的肉牛品種[2]。研究表明，同月齡黑安格斯牛的體質(zhì)量和各項肉質(zhì)指標(biāo)均高于秦川牛[3]，利用黑安格斯牛與早勝牛雜交，其后代在早期強度育肥條件下肉用性能更強[4]。

CEBPA基因是C/EBPs家族的一員，可與脂肪細胞特定區(qū)域進行特異性結(jié)合，從而對葡萄糖攝取進行調(diào)節(jié)，這極大影響著脂肪細胞的分化完成，并起到促進作用[5]，該家族中所有基因具有相似的結(jié)構(gòu)特征，均含有一段保守的堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。C/EBPs家族基因包含多種亞型及異構(gòu)體，可對特定基因結(jié)構(gòu)進行激活，對脂肪細胞的分化起著關(guān)鍵作用，能在調(diào)控過程中使家族內(nèi)影響脂肪分化的基因于不同時期進行表達[6]，并在機體免疫反應(yīng)和損傷應(yīng)答過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。相關(guān)研究表明，牛的CEBPA基因定位在18號染色體上，僅有一個外顯子，無內(nèi)含子，主要分布在脂肪和膽固醇代謝相對較旺盛的組織，如脂肪、肝臟、肺、腎上腺等[8]。該基因參與著多個與脂肪相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達[9]，并受到多個基因的調(diào)節(jié)，影響該基因在脂肪細胞分化中的表達，其中與CEBPA基因同屬C/EBPs家族的C/EBP-δ和C/EBP-β基因?qū)ζ淦鹬{(diào)節(jié)作用[10]，PPAR-γ基因?qū)EBPA基因以正反饋作用影響著脂肪的生成[11-12]。CEBPA基因還與自身存在著作用機制，可以結(jié)合調(diào)控區(qū)位點，從而產(chǎn)生更多的CEBPA基因，若基因調(diào)控區(qū)CCAAT重復(fù)序列發(fā)生突變，那么基因的表達也隨之受阻[13]。目前國內(nèi)外關(guān)于CEBPA基因的研究多集中在人的急性髓系白血病(AML)中，有關(guān)CEBPA基因在黑安格斯牛上的基因編碼區(qū)序列結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測的研究尚鮮有報道。

本研究以寧夏地區(qū)24月齡健康黑安格斯牛背最長肌組織為材料，使用GenBank中公布的牛CEBPA基因序列，對其CDS區(qū)設(shè)計特異性引物，進行編碼區(qū)的擴增、基因克隆、測序，并對編碼區(qū)進行功能生物信息學(xué)分析，以期為后續(xù)深入研究CEBPA基因轉(zhuǎn)錄水平、蛋白質(zhì)水平、代謝水平細胞功能等的調(diào)控和表達機制，以及我國肉牛的分子育種研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗材料 在寧夏示范牛場固原富民農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，選取3頭24月齡健康的黑安格斯牛，屠宰采集背最長肌組織各100 g，剪碎后即刻裝入凍存管，標(biāo)記后置于液氮中，帶回實驗室于-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試驗試劑 RNA提取試劑盒、柱式DNA膠回收試劑盒、RNase-free water，均購于生工生物工程(上海)股份有限公司；氯仿、異丙醇，均購于徐州天鴻化工有限公司;固相RAase清除劑，購于北京天恩澤公司；RevertAid Premium Reverse Transcriptase，購自Thermo Fisher公司；LATaqDNA聚合酶，購自TaKaRa公司。

1.2 黑安格斯?？俁NA的提取及cDNA的合成

使用RNA提取試劑盒提取黑安格斯牛背最長肌組織樣總RNA，使用NANODROP核酸濃度檢測儀檢測總RNA的濃度和純度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測樣本總RNA的完整性及是否有污染。挑取完整度好的RNA用RevertAid Premium Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄為cDNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 CEBPA基因的引物設(shè)計及合成

根據(jù)NCBI所提供的牛CEBPA基因(登錄號：BC149006.1)的mRNA序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，上下游引物序列(5′-3′)分別為F：TCGCCATGCCGGGAGGACTTTA；R：GGTCCCAGCCGGCGACCA；產(chǎn)物長度為685 bp，并將引物序列送交生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 CEBPA基因CDS區(qū)的擴增、克隆和測序

以上述反轉(zhuǎn)錄的cDNA進行CDS區(qū)擴增，PCR擴增總體系為25 μL：cDNA模板1 μL，上游引物(10 μmol/L)0.5 μL，下游引物(10 μmol/L)0.5 μL，Taq酶(5 U/μL)0.2 μL，2×GC Buffer Ⅰ 12.5 μL，dNTP(10 mmol/L)0.2 μL，滅菌超純水10.1 μL。PCR擴增程序為：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共33個循環(huán)；72 ℃修復(fù)延伸7 min，4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，使用凝膠純化試劑盒純化回收目的片段。

將目的片段與pMD18-T載體在4 ℃連接過夜后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞(SK2301)，轉(zhuǎn)化步驟為：冰浴30 min，42 ℃水浴熱激60 s，冰上12 min，加入LB培養(yǎng)基混勻后放入搖床，于37 ℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)1 h，將細菌涂布于含有氨芐青霉素的平板上，倒置37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取菌落進行培養(yǎng)，并進行菌液PCR擴增，然后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.5 CEBPA基因的生物信息學(xué)分析

利用Seqman軟件完成黑安格斯牛CEBPA基因序列的校對、拼接；利用BioEdit[14]軟件完成核苷酸基本組成信息的分析及基因序列的比對。利用MEGA5[15]軟件進行核苷酸序列的多重比對，以鄰接法構(gòu)建不同物種的進化樹并進行遺傳距離分析；使用ProtParam軟件進行分子量、等電點等理化性質(zhì)分析(http://web.expasy.org/protparam/)；使用ExPASy軟件分析基因編碼蛋白質(zhì)的親水性(https://web.expasy.org/protscale/)；采用TMHMM Server 2.0 軟件分析基因編碼蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)；采用InterPro蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫預(yù)測蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)；利用SignalP-5.0軟件預(yù)測基因編碼蛋白的信號肽(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)：使用NetPhos 3.1軟件分析蛋白質(zhì)的磷酸化位點(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)[16]；采用 Immune Epitope Database (IEDB)數(shù)據(jù)庫預(yù)測B細胞抗原表位(http://tools.iedb.org/bcell/)；使用PSORT Ⅱ Prediction軟件預(yù)測亞細胞定位(https://psort.hgc.jp/form2.html)；利用MethPrimer 2.0軟件預(yù)測CpG島(http://www.urogene.org/methprimer/)；使用PSIPRED軟件分析預(yù)測基因編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)；通過SWISS-MODEL軟件對基因編碼蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)進行分析(http://swissmodel.expasy.org/)；通過String數(shù)據(jù)庫進行基因共表達分析；采用輪廓隱馬爾可夫模型(profile hidden Markov models, profile HMMs)軟件對蛋白數(shù)據(jù)庫進行生物序列分析與檢索(https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑安格斯牛肌肉組織總RNA的檢測及CEBPA基因CDS區(qū)擴增

黑安格斯牛背最長肌組織總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果(圖1)表明，提取的牛總RNA具有較好的完整性，無明顯的降解，OD260/OD280值為1.7～2.0，說明RNA純度較高，可滿足后續(xù)試驗的要求。將黑安格斯牛CEBPA基因序列的CDS區(qū)進行PCR擴增后，擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，結(jié)果表明擴增片段條帶較整齊，條帶明亮無引物二聚體等雜帶，說明引物特異性較好。該基因序列CDS區(qū)的擴增產(chǎn)物長度為685 bp，與預(yù)測目的條帶大小相符(圖2)，測序峰圖結(jié)果正常，說明可用于后續(xù)生物信息學(xué)分析。

1～3.3頭黑安格斯牛背最長肌總RNA1-3.Total RNA of longissimus dorsi muscle in 3 black Angus cattle

2.2 黑安格斯牛CEBPA基因CDS區(qū)生物信息學(xué)分析

2.2.1 CDS區(qū)堿基成分 對測序后的黑安格斯牛CEBPA基因序列進行校正、拼接，結(jié)果表明，CEBPA基因CDS區(qū)全長570 bp，編碼189個氨基酸(圖3)，與普通牛(登錄號：BC149006.1)的基因編碼區(qū)相比，克隆得到的基因序列缺失39 bp；核苷酸組成及序列結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，該基因CDS區(qū)胞嘧啶核苷酸數(shù)量比重最大(35.96%)，胸腺嘧啶核苷酸比重最小(10.53%)，G+C含量(68.60%)明顯高于A+T含量(31.40%)；編碼區(qū)DNA單鏈和雙鏈分子質(zhì)量分別為175.3和348.3 ku。

圖3 黑安格斯牛CEBPA基因編碼區(qū)全長序列與對應(yīng)的氨基酸序列Fig.3 Full length coding sequence and amino acids sequence of CEBPA gene of black Angus cattle

2.2.2CEBPA基因編碼氨基酸序列及蛋白的理化性質(zhì) 由表1可見，在黑安格斯牛CEBPA基因編碼蛋白質(zhì)的多種氨基酸中，以丙氨酸占比最大(12.63%)，其后依次為脯氨酸(8.95%)、絲氨酸(8.95%)、精氨酸(8.42%)和谷氨酸(7.89%)，半胱氨酸占比最小(1.05%)，無色氨酸的密碼子。氨基酸殘基中，正電荷殘基(Arg+Lys)總數(shù)為28個，較負電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)多3個。理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，黑安格斯牛CEBPA蛋白的總原子數(shù)為2 878，原子組成為C891H1 425N275O282S5，分子質(zhì)量為20.662 ku，理論等電點為8.90，估計半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為61.45，脂肪指數(shù)為60.58。

表1 黑安格斯牛CEBPA基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成Table 1 Amino acids composition of proteins encoded in CEBPA gene of black Angus cattle

2.2.3CEBPA基因編碼蛋白的親水性 使用ExPASy軟件，選擇Hphob./Kyte&Doolittle算法預(yù)測蛋白質(zhì)親水性，結(jié)果見圖4。由圖4可以看出，黑安格斯牛CEBPA基因編碼蛋白第64位異亮氨酸(Ile)和第185位蛋氨酸(Met)具最強的疏水性(分值均為0.911)，第132位天冬氨酸(Asp)具最強的親水性(分值為-2.967),親水性總均值小于0(-0.841)，說明該蛋白具有較強的親水區(qū)域。

正值表示疏水性，負值表示親水性 Positive value means hydrophobic and negative value means hydrophilic

2.2.4CEBPA基因編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域、保守結(jié)構(gòu)域及GO注釋 采用在線軟件TMHMM Server v. 2.0預(yù)測表明，黑安格斯牛CEBPA基因的編碼蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)域，不屬于跨膜蛋白。利用InterPro蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫預(yù)測黑安格斯牛CEBPA基因編碼蛋白質(zhì)序列的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果(圖5)表明，黑安格斯牛CEBPA蛋白存在4個保守結(jié)構(gòu)域，分別是第1～56位、第86～139位、第108～139位氨基酸殘基的無序區(qū)域(即表征內(nèi)在無序/非結(jié)構(gòu)化蛋白質(zhì))和第131～172位的氨基酸殘基盤繞線圈區(qū)域。黑安格斯牛CEBPA蛋白歸屬于脊索動物CCAAT/增強子結(jié)合蛋白，與數(shù)據(jù)庫中編號為IPR004827的堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域Basic-leucine zipper domain(bZIP)、PF07716堿性區(qū)域亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域Basic region leucine zipperPfam entry(bZIP_2)、PS50217基本-亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域Basic-leucine zipper domain profile (bZIP)、SM00338基本區(qū)域亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域basic region leucin zipper(BRLZNEU)重疊，分別位于第111～176、113～165、113～176和111～175位氨基酸殘基。

對結(jié)構(gòu)域進行的GO注釋表明，黑安格斯牛CEBPA基因所編碼的蛋白質(zhì)在生物過程中參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和DNA模板化，在分子功能中與脫氧核糖核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的活性相關(guān)。

mobidb-lite.氨基酸殘基無序區(qū)域；Coil.氨基酸殘基盤繞線圈區(qū)域mobidb-lite. Amino acid residue disorder region；Coil. Amino acid residue coiling region

2.2.5CEBPA基因編碼蛋白的信號肽預(yù)測 信號肽預(yù)測結(jié)果表明，黑安格斯牛CEBPA基因編碼蛋白檢測出SP(Sec/SPⅠ)型信號肽識別位點，可能性為0.000 9；未檢測出含有LIPO(Sec/SPⅡ)和TAT(Tat/SPⅠ)型的信號肽識別位點，表明CEBPA蛋白可能不存在信號肽剪切位點，為非分泌型蛋白。

2.2.6CEBPA基因編碼蛋白的磷酸化位點 圖6顯示，黑安格斯牛CEBPA蛋白存在12個絲氨酸(Ser)磷酸化位點，分別位于氨基酸序列第3，17，21，27，40，61，65，108，113，130，163和180位；3個蘇氨酸(Thr)磷酸化位點，分別位于第141，149和168位；2個酪氨酸(Tyr)磷酸化位點，分別位于第7，67位。

圖6 黑安格斯牛CEBPA蛋白的磷酸化位點Fig.6 Phosphorylation sites of CEBPA protein in black Angus cattle

2.2.7CEBPA基因編碼蛋白的B細胞抗原表位預(yù)測 采用Immune epitope 在線軟件預(yù)測黑安格斯牛CEBPA基因編碼蛋白的抗原表位，結(jié)果(圖7)發(fā)現(xiàn)，黑安格斯牛CEBPA蛋白存在7個B細胞抗原表位(圖中分數(shù)大于0.5部分)，分別位于氨基酸序列第5～125，132，135～147，150，153～154，157和174～185位氨基酸殘基。

2.2.8CEBPA基因編碼蛋白的亞細胞定位 采用在線工具PSORTⅡ Prediction對CEBPA基因編碼產(chǎn)物進行亞細胞定位，結(jié)果表明其分布在細胞核的可能性為56.5%，分布在線粒體的可能性為17.4%，分布在細胞質(zhì)的可能性為17.4%，分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的可能性為4.3%，分布在分泌系統(tǒng)小泡的可能性為4.3%。因此,CEBPA基因編碼產(chǎn)物可能主要在細胞核中發(fā)揮生物學(xué)作用。

2.2.9CEBPA基因CpG島的在線預(yù)測 通過MethPrimer 2.0在線軟件預(yù)測CpG島，結(jié)果(圖8)顯示，黑安格斯牛CEBPA基因編碼蛋白存在1個CpG島，大小為468 bp，位于該基因核苷酸序列的第47～514位，并含有5對亞硫酸氫鹽PCR引物。

圖8 黑安格斯牛CEBPA基因CpG島預(yù)測Fig.8 Prediction of CpG island of CEBPA gene in black Angus cattle

2.2.10CEBPA基因編碼蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過PSIPRED在線軟件對CEBPA基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果(圖9)表明，黑安格斯牛CEBPA 蛋白含有46%的α-螺旋(含87個氨基酸)和54%的無規(guī)則卷曲(含102個氨基酸)。通過SWISS-MODEL軟件對CEBPA基因編碼蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)進行分析，使用同源建模法建立三級結(jié)構(gòu)模型。結(jié)果(圖10)顯示，所建立三級結(jié)構(gòu)模型的目標(biāo)序列與模板序列一致度為100%，說明該三級結(jié)構(gòu)模型可用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的預(yù)測。三級結(jié)構(gòu)模型預(yù)測與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果有部分差異，但仍可以確定其含有大量α-螺旋結(jié)構(gòu)。

圖9 黑安格斯牛CEBPA基因編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.9 Prediction of secondary structure of protein encoded by CEBPA gene in black Angus cattle

圖10 黑安格斯牛CEBPA基因編碼蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.10 Prediction of tertiary structure of protein encoded by CEBPA gene in black Angus cattle

2.2.11 黑安格斯牛CEBPA基因共表達分析 利用String數(shù)據(jù)庫對CEBPA基因進行共表達分析，結(jié)果(圖11)發(fā)現(xiàn)，在黑安格斯牛中未發(fā)現(xiàn)與CEBPA共表達的基因存在，在其他生物有機體中,CEBPA與RUNX1、FLT3、TRIB1、RUNX1T1、RUNX2、TRIB2、MYB、PER2、MYBL2和MYBL1均存在共表達。

A.在黑安格斯牛中的共表達；B.在其他生物中的共表達A.Coexpression in black Angus cattle；B.Coexpression in other organisms

2.2.12CEBPA基因編碼蛋白的生物序列 使用輪廓隱馬爾可夫模型在線工具，在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中對CEBPA基因編碼氨基酸序列進行生物序列交互式搜索分析，結(jié)果表明，黑安格斯牛CEBPA基因編碼氨基酸序列與InterPro蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的同源序列共有1 025條，主要分布在真核生物中，涉及到不同種的牛、馬、駱駝、綿羊、野豬、大猩猩、熊、驢、大鼠等，與bZIP_2蛋白家族序列和物種的比對相符。

2.2.13CEBPA基因的系統(tǒng)進化樹 將黑安格斯牛CEBPA基因的核苷酸序列分別與GenBank中牦牛(XM_005893918.2)、野牛(XM_010849281.1)、白犀牛(XM_004439780.2)、馬(XM_023649498.1)、雙峰駝(XM_010950046.1)、綿羊(NM_001308574.1)、野豬(XM_003127015.4)、大猩猩(XM_031004588.1)、灰熊(XM_026484294.1)、驢(XM_014835803.1)、大鼠(X12752.1)共11個物種的核苷酸序列進行比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹并分析不同亞種及物種間的遺傳距離。結(jié)果(圖12)表明，黑安格斯牛與牦牛的遺傳距離為0.004，親緣關(guān)系最近;其次與黑安格斯牛親緣關(guān)系較近的是綿羊，遺傳距離是0.009;野牛與黑安格斯牛之間的遺傳距離較遠，遺傳距離為0.404。

圖12 黑安格斯牛與不同物種CEBPA基因編碼序列的系統(tǒng)進化樹分析Fig.12 Phylogenetic tree analysis of CEBPA gene coding sequences of black Angus cattle and different species

3 討 論

隨著科研水平的飛速發(fā)展，生物信息學(xué)方法和手段在動物遺傳育種領(lǐng)域發(fā)揮著關(guān)鍵作用[17-19]。CEBPA基因主要參與脂肪的生成以及機體的免疫應(yīng)答，相關(guān)報道在人的急性髓系白血病(AML)研究中較為常見。近年來,在秦川牛、豬、羊、小鼠、鴨、雞等研究中發(fā)現(xiàn)，該基因與脂肪分化相關(guān)，對改善肉品質(zhì)具有關(guān)鍵作用[20-22]。牛的CEBPA基因可激活脂肪細胞分化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達，促進脂肪的形成，主要分布在脂肪和膽固醇代謝相對較旺盛的組織中[7-8]。本研究結(jié)果表明，黑安格斯牛CEBPA基因的CDS區(qū)全長為570 bp，與NCBI上公布的普通牛(登錄號：BC149006.1)基因編碼區(qū)相比缺失39 bp，這可能是由于基因發(fā)生了可變剪接現(xiàn)象，對基因的表達及生物遺傳的多態(tài)性會產(chǎn)生一定影響。周揚[23]的研究證實，CEBPA基因存在可變剪接現(xiàn)象。本研究中，黑安格斯牛CEBPA基因CDS區(qū)G+C含量達68.60%，共編碼189個氨基酸，其中以丙氨酸占比最大(12.63%)，該氨基酸可以緩和血糖和調(diào)節(jié)能量，對脂肪的生成有一定促進作用。CEBPA蛋白理論等電點為8.90(>7)，估計半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為61.45(>40)，推斷該蛋白為堿性不穩(wěn)定蛋白[24]，可能會影響黑安格斯牛背最長肌細胞的周期及生命活動。CEBPA蛋白親水性的總平均值小于0(-0.841)，表明該蛋白是可溶性蛋白[25]，且預(yù)測發(fā)現(xiàn)該蛋白不存在信號肽，跨膜結(jié)構(gòu)域為非分泌型蛋白，這與相關(guān)研究結(jié)果“跨膜結(jié)構(gòu)域的疏水區(qū)和信號肽的疏水區(qū)高度相似”[26]一致。預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該編碼蛋白存在4個保守結(jié)構(gòu)域，含有無序區(qū)域(即表征內(nèi)在非結(jié)構(gòu)/無序蛋白質(zhì))和盤繞線圈區(qū)域，在生物發(fā)育過程中，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和DNA模板化，在分子功能中與脫氧核糖核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性相關(guān)。相關(guān)研究表明，這些固有的非結(jié)構(gòu)/無序蛋白(IUPS/IDPs)在生理條件下以快速相互轉(zhuǎn)換的構(gòu)象集合形式存在，在蛋白質(zhì)組中的預(yù)期高頻率也突顯了其重要性，估計30%～50%的真核蛋白至少含有一個長的無序片段，這些蛋白質(zhì)參與了重要的調(diào)節(jié)功能[27]。盤繞線圈區(qū)域的相關(guān)研究表明，盤繞線圈片段位于發(fā)揮重要功能的區(qū)域，并介導(dǎo)了許多不同類型的生物過程[28]。

蛋白質(zhì)磷酸化是一種較為重要的調(diào)節(jié)方式，參與多種生物學(xué)過程，磷酸化位點對推動蛋白質(zhì)的翻譯及細胞增殖等過程有一定作用[29]。本研究結(jié)果表明，黑安格斯牛CEBPA蛋白存在17個磷酸化位點，這些位點可能影響著安格斯牛背最長肌細胞的分化和生長，通過蛋白翻譯后的磷酸化和去磷酸化影響轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，黑安格斯牛CEBPA蛋白存在7個B細胞抗原表位。趙驍?shù)萚31]的研究表明，蛋白質(zhì)以β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲居多，則可能易與抗體結(jié)合成為表位。亞細胞定位表明，CEBPA基因編碼蛋白分布在細胞核的可能性為56.5%，說明CEBPA基因編碼產(chǎn)物可能主要在細胞核中發(fā)揮生物學(xué)作用，與GO注釋中脫氧核糖核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的分析結(jié)果一致。MethPrimer 2.0在線軟件預(yù)測表明，CEBPA基因編碼蛋白存在1個CpG島。CpG島多位于基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)附近，與GO注釋結(jié)果(即參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié))一致，但預(yù)測中并未發(fā)現(xiàn)CEBPA基因存在甲基化特異性，為后續(xù)CEBPA基因CpG島甲基化狀態(tài)的研究起到一定啟示作用。在CEBPA基因編碼蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測中發(fā)現(xiàn)，該蛋白以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，從而印證了B抗原表位的預(yù)測結(jié)果，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)特異功能有關(guān)[32]，通過蛋白質(zhì)肽鏈中配體和受體結(jié)合的活性影響著蛋白質(zhì)的功能[33-34]。利用String數(shù)據(jù)庫對CEBPA基因的共表達分析表明，其中并未發(fā)現(xiàn)與黑安格斯牛CEBPA共表達的基因，表明該數(shù)據(jù)庫不同品種牛中不含該基因的共表達信息，但在其他有機生物體中發(fā)現(xiàn)10個共表達基因，其RUNX1基因在人上被證實存在共表達的關(guān)系[35]。系統(tǒng)進化發(fā)育樹分析結(jié)果表明，黑安格斯牛和牦牛的親緣關(guān)系最近，與野牛的遺傳距離較遠。

本研究通過克隆發(fā)現(xiàn)，CEBPA基因存在可變剪接現(xiàn)象，進一步預(yù)測分析了黑安格斯牛CEBPA基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、空間結(jié)構(gòu)和功能，為后續(xù)深入研究CEBPA基因的可變剪接、轉(zhuǎn)錄水平、蛋白水平等機理提供了科學(xué)依據(jù)，并為黑安格斯肉牛的分子育種奠定了理論基礎(chǔ)。