成熟期施氮對富士蘋果糖含量及相關(guān)基因表達(dá)的影響

李 凡，魏 樺，戚建國，孫思敏，鄒養(yǎng)軍，李明軍

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

可溶性糖(主要包括果糖、蔗糖和葡萄糖)是評價(jià)果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)，其含量和組成是控制果實(shí)甜度與風(fēng)味的關(guān)鍵，可溶性糖在果實(shí)細(xì)胞中的大量積累促使果實(shí)成熟變甜[1]?？扇苄蕴堑姆e累受糖代謝轉(zhuǎn)運(yùn)的高度調(diào)控：一方面受胞質(zhì)中糖代謝利用能力的高度調(diào)控[2-3]，如蔗糖磷酸合酶可調(diào)控蔗糖的合成能力，己糖激酶和果糖激酶可調(diào)控葡萄糖和蔗糖的含量[3-4]；另一方面受定位于液泡膜的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的高度調(diào)控，如液泡糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TST)控制著西瓜[5]、甜菜[6]糖的含量等。同時(shí)，果實(shí)中的糖含量也受環(huán)境和栽培技術(shù)的顯著影響，如氮肥施用過量會導(dǎo)致果實(shí)糖含量降低，果實(shí)風(fēng)味變淡[7-8]。近年來，對植物細(xì)胞中糖的代謝轉(zhuǎn)運(yùn)途徑已經(jīng)有了全面認(rèn)識，但對栽培和管理技術(shù)影響糖代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)能力進(jìn)而調(diào)控果實(shí)糖含量的機(jī)制尚不清楚。探明施氮等管理技術(shù)對果實(shí)中糖含量的調(diào)控機(jī)制，既是果實(shí)品質(zhì)改良的基礎(chǔ)，也對栽培技術(shù)改良和科學(xué)管理有重要意義。

作為果樹必需的營養(yǎng)元素，氮素對樹體營養(yǎng)和生殖生長、生理生化過程有著重要影響[9-10]。不同時(shí)期施氮對果樹生長發(fā)育和果實(shí)品質(zhì)的影響不同，陜西省蘋果園基肥中氮肥用量占施氮總量的71.5%，追肥僅占施氮總量的28.5%[11]，生產(chǎn)中常因氮肥施用不當(dāng)而影響果實(shí)的含糖量[12-13]。研究表明，施氮不足會降低蘋果葉片的碳同化能力，改變糖代謝，降低山梨醇、蔗糖、果糖和葡萄糖含量[14]；高氮則不利于果實(shí)糖的積累，尤其在成熟期施用氮肥會降低蘋果等果實(shí)的含糖量[13]。但對氮肥如何影響果實(shí)中的可溶性糖含量、組成及其代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)尚不清楚。為此，本試驗(yàn)以陜西楊凌地區(qū)栽培的富士蘋果(Malusdomestica)為材料，研究成熟期施氮對蘋果果實(shí)可溶性糖含量及糖代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)量的影響，以期為科學(xué)施用氮肥和調(diào)控果實(shí)品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2016年9-10月在陜西省楊凌示范區(qū)五泉鎮(zhèn)絳中村農(nóng)戶果園進(jìn)行，其地理位置為東經(jīng)107°97′，北緯34°29′，屬大陸性季風(fēng)氣候，年均氣溫12.9 ℃，無霜期211 d，年均日照時(shí)數(shù)2 163.8 h，年均降水量635.1 mm，土壤為土婁土。

1.2 試驗(yàn)儀器及試劑

1.2.1 儀 器 TP-A1000電子天平(精確到0.01 g)，華志科學(xué)儀器有限公司；XMTD-8222烘箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BJ-150自動研磨儀，拜杰公司；Auto Analyzer 3-AA3連續(xù)流動分析儀，SEAL公司；PAL-1手持式數(shù)顯糖度計(jì)，ATAGO公司；A11 basic S025型液氮冷凍研磨機(jī)，IKA公司；API 2000液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，AB Sciex公司；iQ5.0定量PCR儀，美國Bio-Rad公司。

1.2.2 試 劑 主要包括H2SO4、體積分?jǐn)?shù)30% H2O2、甲醇、核糖醇、甲氧、CTAB、Tris、EDTA-2Na·2H2O等，均為分析純試劑。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在試驗(yàn)地農(nóng)戶果園中，選取長勢基本一致、無病蟲害的15年生富士果樹12株，彼此之間互不相鄰。試驗(yàn)設(shè)置施氮和對照2組處理，每組6株樹。施氮處理是以尿素(陜西渭河重化工有限責(zé)任公司產(chǎn)品)為氮源，于成熟期(09-19)在每株果樹環(huán)狀施肥溝內(nèi)均勻施入尿素1 kg，施肥后立即澆水并覆土，施肥溝距離果樹1.5 m；對照不施氮肥，只澆灌與施氮處理相同水量并覆土。試驗(yàn)期間果樹不再施肥，其他管理按照當(dāng)?shù)毓麍@生產(chǎn)規(guī)范統(tǒng)一進(jìn)行。

于試驗(yàn)處理后6，13，20 d，選擇無病蟲害、無裂果、大小基本一致的蘋果，每株樹隨機(jī)采取10個(gè)，分裝標(biāo)記后帶回實(shí)驗(yàn)室。其中6個(gè)果實(shí)切碎后放入液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?；另?個(gè)果實(shí)進(jìn)行含水量、全氮和可溶性固形物含量測定。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 果實(shí)可溶性固形物含量 每株樹取2個(gè)鮮果，用榨汁鉗壓榨取汁，采用手持式數(shù)顯糖度計(jì)測定可溶性固形物含量，單株作為1次重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.4.2 果實(shí)含水量 每株樹取2個(gè)鮮果用電子天平稱取質(zhì)量后，切薄片并置于厚信封中，于105 ℃烘箱殺青30 min，80 ℃烘至恒質(zhì)量，再次稱質(zhì)量并計(jì)算果實(shí)含水量。單株為1次重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.4.3 果實(shí)全氮含量 將1.4.2節(jié)中烘干的施氮處理和對照樣品分別混合，采用自動研磨儀粉碎后過0.25 mm篩。稱取0.30 g粉末，采用H2SO4-H2O2消解法[15]制成待測液，用AA3連續(xù)流動分析儀測定全氮含量。重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.4.4 果實(shí)糖酸含量 將各處理蘋果速凍樣品分別混合，采用液氮冷凍研磨機(jī)粉碎，取0.10 g粉末，參考Zhang等[16]的方法，以體積分?jǐn)?shù)75%甲醇和400 mg/L核糖醇為提取液，5 mg/mL甲氧為延伸液進(jìn)行提取，利用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定并計(jì)算果糖、葡萄糖、蔗糖、半乳糖、山梨醇和蘋果酸含量，各可溶性糖含量相加得到總糖含量，總糖與蘋果酸含量的比值為糖酸比。重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.4.5 果實(shí)糖代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá) 稱取0.20 g施氮處理和對照果實(shí)速凍樣品，采用改良CTAB法[17]提取蘋果總RNA，以SYBR?Prime ScriptTMRT-PCR Kit Ⅱ(TaKaRa)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用Primer 5.0設(shè)計(jì)基因特異引物(表1)，定量PCR儀進(jìn)行熒光定量測定。

表1 供試的qRT-PCR引物Table 1 Primers used for qRT-PCR analyses

qRT-PCR的體系為20 μL，其中SYBR 10 μL，上、下游引物各 0.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 8.0 μL。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性20 s，52 ℃低溫退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。以對照處理為標(biāo)準(zhǔn)，用2-ΔΔCt法計(jì)算施氮處理果實(shí)液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(MdTST1、MdTST2)、蔗糖磷酸合成酶基因(MdSPS1、MdSPS6)、果糖激酶基因(MdFK2、MdFK4)和己糖激酶基因(MdHK1)的相對表達(dá)量。重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用SPSS Statistics 16.0分析差異顯著性(P<0.05)，采用Microsoft Excel 2010制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 成熟期施氮對蘋果氮含量的影響

成熟期施氮對富士蘋果果實(shí)氮含量的影響如圖1所示。

圖柱上標(biāo)不同小寫字母表示同一采樣時(shí)間不同處理間差異顯著(P<0.05)，下圖同Different lowercase letters indicate significant differences between treatments at same sampling time (P<0.05).The same below

圖1顯示，與對照相比，成熟期樹體根施尿素后，富士蘋果含氮量顯著增加。處理后6，13，20 d，對照組果實(shí)氮含量分別為3.76，3.26，3.51 mg/g，施氮處理果實(shí)氮含量分別顯著增加了27.35%，34.90%和13.72%。

2.2 成熟期施氮對蘋果可溶性固形物含量及含水量的影響

可溶性固形物含量是評價(jià)蘋果果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)。圖2顯示，與對照相比，在施氮處理后6，13，20 d，富士蘋果可溶性固形物分別顯著降低1.03%，1.20%和0.72%。為了進(jìn)一步確定可溶性固形物含量的降低與果實(shí)含水量的關(guān)系，圖2還分析了施氮對含水量的影響。由圖2可以看出，施氮對蘋果果實(shí)的含水量無顯著影響。上述結(jié)果表明，成熟期施用氮肥后蘋果可溶性固形物含量的降低并不是果實(shí)含水量的變化所致。

圖2 成熟期施氮對蘋果可溶性固形物含量及含水量的影響Fig.2 Effects of nitrogen application on the soluble solids and water content of apple in ripening period

2.3 成熟期施氮對蘋果主要糖酸含量的影響

果實(shí)中的糖酸含量和組成不僅直接影響可溶性固形物含量，也會影響果實(shí)的風(fēng)味品質(zhì)。圖3顯示，與對照相比，成熟期施氮可顯著影響富士蘋果主要糖酸含量和組成，果實(shí)中果糖、葡萄糖、半乳糖和山梨醇含量幾乎均顯著降低，而蔗糖和蘋果酸含量均顯著增加。與對照相比，施氮處理6 d后，蘋果果糖、葡萄糖和山梨醇含量分別顯著降低了23.12%，10.11%和34.64%，蔗糖和蘋果酸含量分別顯著增加了70.22%和71.73%；施氮處理13 d后，果糖、葡萄糖、半乳糖和山梨醇含量分別顯著降低了13.71%，13.06%，14.24%和32.08%，蔗糖和蘋果酸分別顯著增加11.47%和34.92%；施氮處理20 d后，果糖、葡萄糖、半乳糖和山梨醇含量分別顯著降低了12.07%，28.38%，31.47%和25.91%，蔗糖和蘋果酸含量則分別顯著增加22.76%和48.37%。

圖3 成熟期施氮對蘋果主要糖酸含量的影響Fig.3 Effects of nitrogen application on main sugar and acid contents of apple in ripening period

從圖4可以看出，與對照相比，成熟期施氮蘋果的總糖含量和糖酸比顯著降低，施氮后6，13，20 d其含量分別降低了11.59%，11.12%，15.01%和48.52%，34.13%，42.72%。

圖4 成熟期施氮對蘋果總糖含量和糖酸比的影響Fig.4 Effects of nitrogen application on total sugar content and sugar-acid ratio of apple in ripening period

以上結(jié)果表明，成熟期施氮可使富士蘋果果糖、葡萄糖、半乳糖等己糖含量降低，蘋果酸含量提高，從而影響了果實(shí)的可溶性固形物含量和風(fēng)味，導(dǎo)致果實(shí)品質(zhì)下降。

2.4 成熟期施氮對蘋果糖代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖5～8顯示，與對照相比，成熟期施氮對蘋果部分糖代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)具有較大影響。與對照相比，施氮處理富士果實(shí)液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(MdTST1、MdTST2)表達(dá)量總體降低，其中MdTST1表達(dá)量在施氮后20 d顯著低于對照，下調(diào)了75%；MdTST2表達(dá)量在施氮后6，13，20 d均顯著下調(diào)近50%，導(dǎo)致果糖、葡萄糖、半乳糖等在液泡中的積累減少。與對照相比，施氮處理蔗糖磷酸合成酶基因MdSPS1、MdSPS6表達(dá)量增加，其中在處理20 d后分別上調(diào)了247%和404%，故果實(shí)中的蔗糖含量有所升高。果糖激酶基因(MdFK2、MdFK4)和己糖激酶基因(MdHK1)的表達(dá)量在施氮后6，13，20 d均顯著高于對照，其中MdFK2表達(dá)量在施氮后20 d上調(diào)303%，MdFK4表達(dá)量在施氮后6 d上調(diào)399%，MdHK1表達(dá)量在施氮后6，20 d上調(diào)150%左右，因果糖、葡萄糖被磷酸化，故其含量降低。

圖5 成熟期施氮對蘋果液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因相對表達(dá)量的影響Fig.5 Effects of nitrogen application on relative expression of tonoplast sugar transporter genes in ripening period

圖6 成熟期施氮對蘋果蔗糖磷酸合成酶基因相對表達(dá)量的影響Fig.6 Effects of nitrogen application on relative expression of sucrose phosphate synthase genes in ripening period

圖7 成熟期施氮對蘋果果糖激酶基因相對表達(dá)量的影響Fig.7 Effects of nitrogen application on relative expression of fructokinase genes in ripening period

圖8 成熟期施氮對蘋果己糖激酶基因相對表達(dá)量的影響Fig.8 Effects of nitrogen application on relative expression of hexokinase genes in ripening period

3 討 論

蘋果可溶性糖含量不僅與遺傳特性相關(guān)，也受施肥管理等因素的影響[18-19]。氮素作為果樹生長發(fā)育的必需元素，與果實(shí)糖含量密切相關(guān)，適期、適量施氮有利于提高果實(shí)的產(chǎn)量與品質(zhì)。曾艷娟[20]研究表明，施用氮肥能提高蘋果樹枝、葉、果的全氮含量，且全氮含量與施氮量呈正相關(guān)。本試驗(yàn)中，與對照相比，成熟期施氮后果實(shí)氮素含量也顯著增加。但Quartieri等[21]的研究表明，采收前對果樹進(jìn)行有限氮供應(yīng)后樹體氮素貯藏增加，而果實(shí)含氮量增加不顯著。這與以上結(jié)果存在差異，可能與氮肥施用量和果樹品種不同有關(guān)。

在果實(shí)成熟過程中，果實(shí)的可溶性固形物含量呈逐漸增加趨勢[22]。彭福田[23]研究表明，蘋果可溶性糖含量以不施氮處理最高，高氮處理(1.0 kg/株)較低。而曾艷娟[20]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)施氮量為0.2 kg/株時(shí)，果實(shí)可溶性固形物含量較不施氮處理提高了1.7%。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對照相比，成熟期施氮后蘋果可溶性固形物含量顯著降低，但果實(shí)含水量并無顯著變化，說明可溶性固形物含量降低并非果實(shí)中水的稀釋作用所致?？扇苄怨绦挝锏闹饕煞质强扇苄蕴?，因此其含量降低與果實(shí)中可溶性糖含量變化相關(guān)。富士蘋果作為己糖積累型果實(shí)，成熟期以積累果糖和葡萄糖為主，蔗糖次之[24]，半乳糖和山梨醇含量較低。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比，成熟期施氮蘋果果實(shí)中的果糖、葡萄糖、半乳糖及山梨醇含量均明顯降低，蔗糖含量明顯增加，這與魏建梅等[24]的研究結(jié)果相近。陳磊等[25]的研究也表明，成熟期高氮處理后豐水梨果實(shí)葡萄糖和果糖含量顯著下降，蔗糖含量迅速上升，但山梨醇含量變化不顯著，這可能是富士蘋果與豐水梨的屬間差異所致。本研究還發(fā)現(xiàn)，與對照相比，成熟期施氮后果實(shí)總糖含量顯著降低，尤其是甜度最高的果糖含量顯著下降，從而導(dǎo)致果實(shí)甜度降低；同時(shí)蘋果酸含量顯著增加，從而導(dǎo)致糖酸比降低，果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)下降。這與彭福田[23]在紅富士上的研究結(jié)論相一致。但丁寧等[26]的研究卻發(fā)現(xiàn)，晚秋葉面追氮可以提高矮化蘋果果實(shí)可溶性固形物、可溶性糖含量和糖酸比，顯著改善果實(shí)品質(zhì)。分析以上差異的原因，可能與施肥方法的差異或本試驗(yàn)中氮肥施用過量有關(guān)。

蘋果果實(shí)可溶性糖含量受糖代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的調(diào)控。糖主要在液泡中積累，液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白負(fù)責(zé)糖在液泡和胞質(zhì)間的轉(zhuǎn)運(yùn)[27]。成熟期蘋果液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白高度表達(dá)，將果糖、葡萄糖等已糖由胞質(zhì)向液泡運(yùn)輸，其部分家族成員還可運(yùn)輸蔗糖[28]。果糖激酶和己糖激酶會催化果糖和葡萄糖進(jìn)行磷酸化，生成果糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸，進(jìn)入糖酵解途徑和氧化戊糖磷酸途徑，也可用于淀粉合成[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比，成熟期施氮處理后，富士蘋果液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因MdTST1、MdTST2表達(dá)量降低，果糖、葡萄糖在液泡中的積累受到抑制；同時(shí)，果糖激酶基因MdFK2、MdFK4和己糖激酶基因MdHK1的表達(dá)量均顯著上調(diào)，促進(jìn)了果糖、葡萄糖的轉(zhuǎn)化；MdSPS1、MdSPS6表達(dá)量上調(diào)，蔗糖含量隨之增加，果糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸可以作為底物在蔗糖磷酸合酶的催化下生成蔗糖。說明成熟期施氮后果實(shí)的糖代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)量發(fā)生了變化，表現(xiàn)為己糖含量降低，蔗糖含量增加，從而改變了果實(shí)可溶性糖的組成。

4 結(jié) 論

對成熟期富士蘋果進(jìn)行施氮處理后，蘋果氮素含量顯著增加，果實(shí)中蔗糖磷酸合成酶基因(MdSPS1、MdSPS6)、果糖激酶基因(MdFK2、MdFK4)和己糖激酶基因(MdHK1)表達(dá)量幾乎均顯著上調(diào)，液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(MdTST1、MdTST2)表達(dá)量總體下調(diào)，總糖含量和可溶性固形物含量均顯著降低；同時(shí)，施氮處理后果實(shí)中的蘋果酸含量顯著提高，糖酸比顯著降低，從而導(dǎo)致果實(shí)品質(zhì)下降，因此蘋果成熟期采果前不宜施氮。