食線蟲(chóng)性真菌Duddingtonia flagrans F088的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢特性

常凡凡，黃海巖，藺國(guó)珍，劉新宇，趙天宇，李鳳迪，蔡葵蒸

(西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

食線蟲(chóng)真菌是線蟲(chóng)的天敵，廣泛分布于土壤、動(dòng)物糞便及堆肥等各種基質(zhì)中。根據(jù)食線蟲(chóng)真菌殺蟲(chóng)機(jī)制的不同，將其劃分為捕食線蟲(chóng)性真菌(nematode-trapping fungi)、機(jī)會(huì)性真菌(opportunistic fungi)、內(nèi)寄生性真菌(endoparasitic fungi)和產(chǎn)毒性真菌(toxin-producing fungi)4種類(lèi)型[1]。其中捕食線蟲(chóng)性真菌是食線蟲(chóng)真菌中最常見(jiàn)且研究最多的一類(lèi)，其以形成各種捕食器為特征，如三維黏性網(wǎng)、黏性球、收縮性環(huán)以及非收縮性環(huán)等；其他類(lèi)型食線蟲(chóng)真菌通過(guò)內(nèi)寄生性孢子進(jìn)入線蟲(chóng)體內(nèi)或粘附在線蟲(chóng)卵上等方式發(fā)揮殺線蟲(chóng)作用。大多數(shù)食線蟲(chóng)真菌在有機(jī)物質(zhì)存在的情況下?tīng)I(yíng)腐生生活，一旦有線蟲(chóng)出現(xiàn)，它們即通過(guò)殺死線蟲(chóng)來(lái)提供自身生長(zhǎng)和繁殖所需營(yíng)養(yǎng)，因而食線蟲(chóng)真菌在調(diào)節(jié)土壤線蟲(chóng)動(dòng)態(tài)中發(fā)揮著重要的生態(tài)作用[2-3]。

Linford[4]于1937年首次利用食線蟲(chóng)真菌對(duì)植物根結(jié)線蟲(chóng)進(jìn)行了生物防治研究。此后隨著農(nóng)藥的大量使用，農(nóng)業(yè)線蟲(chóng)對(duì)藥物的耐藥性日益嚴(yán)重，人們對(duì)食線蟲(chóng)真菌的分離、篩選和培育進(jìn)行了大量研究，并應(yīng)用于植物寄生線蟲(chóng)的防治。目前，已有食線蟲(chóng)真菌厚垣孢普可尼亞菌(Pochoniachlamydosporia)和淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus)等菌株的商品化制劑用于植物寄生線蟲(chóng)的防治[5]。在動(dòng)物寄生線蟲(chóng)方面，曾將食線蟲(chóng)真菌制劑施用于牧場(chǎng)，但由于需用大量的生防制劑，極大地提高了應(yīng)用成本，使得食線蟲(chóng)真菌在動(dòng)物寄生線蟲(chóng)防治中的應(yīng)用遠(yuǎn)遲滯于農(nóng)業(yè)線蟲(chóng)。若能將食線蟲(chóng)真菌制劑作為動(dòng)物飼料添加劑使用，真菌則可通過(guò)動(dòng)物的消化道隨糞便排出，在糞便中萌發(fā)并殺死糞便中的幼蟲(chóng)，從而達(dá)到在生產(chǎn)中應(yīng)用的目標(biāo)。然而動(dòng)物消化道中蛋白質(zhì)酶和胃酸的存在，使得多數(shù)食線蟲(chóng)真菌孢子或菌絲體在通過(guò)消化道時(shí)被滅活，從而失去殺蟲(chóng)活性。Larsen等[6]發(fā)現(xiàn)，食線蟲(chóng)真菌Duddingtoniaflagrans能夠通過(guò)動(dòng)物消化道而不喪失活性。該菌的特征是能夠產(chǎn)生大量的雙層厚壁厚垣孢子，這種孢子是菌絲發(fā)育老化后由細(xì)胞內(nèi)的原生質(zhì)體濃縮所形成，對(duì)外界逆性環(huán)境及動(dòng)物的消化道有較強(qiáng)的抵抗力[7]。因此，厚垣孢子作為生防制劑的有效成分而使用在動(dòng)物飼料添加劑中。眾多研究表明，D.flagrans為動(dòng)物寄生線蟲(chóng)生物防治的菌種，無(wú)論是在實(shí)驗(yàn)室還是田間條件下，均能有效減少線蟲(chóng)感染性幼蟲(chóng)(L3)的數(shù)量[8-10]。用含有D.flagrans的制劑飼喂家養(yǎng)動(dòng)物(綿羊、山羊、牛、馬等)后，消化道線蟲(chóng)L3在牧場(chǎng)上的散播顯著減弱[11-12]；以高劑量制劑飼喂試驗(yàn)動(dòng)物，不但未見(jiàn)任何副作用，且有促進(jìn)生長(zhǎng)和增加體質(zhì)量的效果[13]。近年來(lái)，Healey等[14-15]注冊(cè)了用澳大利亞D.flagrans分離株(IAH1297)研制成的顆粒制劑，并對(duì)放牧動(dòng)物(綿羊、山羊、馬、牛)寄生線蟲(chóng)的防治效果分別進(jìn)行田間跟蹤，同時(shí)對(duì)牧場(chǎng)L3的減少進(jìn)行了田間評(píng)估。此外，人們對(duì)其他食線蟲(chóng)真菌，如奇妙節(jié)叢孢(Arthrobotrysthaumasia，同物異名Monacrosporiumthaumasium)亦進(jìn)行了較多的研究[16]，但與D.flagrans相比，其他真菌產(chǎn)生的厚垣孢子較少而難以進(jìn)行生產(chǎn)應(yīng)用。本課題組于2012年在國(guó)內(nèi)首次分離得到13株D.flagrans，對(duì)分離株進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、體內(nèi)外殺蟲(chóng)試驗(yàn)[7,10]，在此基礎(chǔ)上研制了海藻酸鈉包埋顆粒和粉劑，這些制劑在常溫下可以有較長(zhǎng)的貨架期[17]，且在3個(gè)地區(qū)的田間試驗(yàn)均表明，其對(duì)綿羊糞便和牧場(chǎng)上L3的減少是有效的[18]。

D.flagrans作為家養(yǎng)動(dòng)物寄生線蟲(chóng)生物防治中最有應(yīng)用前景的候選菌種，在固體培養(yǎng)基(如玉米、大麥)中能夠產(chǎn)生大量的厚垣孢子，但在實(shí)踐中難以大規(guī)模生產(chǎn)。液體發(fā)酵由于成本較低且易于操作，是生產(chǎn)生物制劑的主要方式之一，但該菌通過(guò)液體培養(yǎng)后產(chǎn)生厚垣孢子量少且不成熟，因此有必要對(duì)培養(yǎng)過(guò)程中的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行研究。有研究表明，溫度、pH及營(yíng)養(yǎng)要素對(duì)D.flagrans的生長(zhǎng)均有一定的影響[19-20]，但到目前為止，有關(guān)不同營(yíng)養(yǎng)要素及其比例對(duì)D.flagrans生長(zhǎng)和厚垣孢子形成的影響研究很少。為此，本研究通過(guò)監(jiān)測(cè)D.flagrans在液體培養(yǎng)中pH值、產(chǎn)孢量、菌絲干質(zhì)量及OD值的動(dòng)態(tài)變化，以及生產(chǎn)中常用的幾種碳源、氮源、維生素、無(wú)機(jī)鹽以及不同碳氮比對(duì)菌絲平均生長(zhǎng)速率和厚垣孢子產(chǎn)量的影響，以期確定最佳的菌絲生長(zhǎng)和厚垣孢子產(chǎn)量的營(yíng)養(yǎng)成分組合，為將來(lái)D.flagrans菌絲體和厚垣孢子的規(guī)模化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

D.flagransF088菌株(基因庫(kù)登錄號(hào)：KU881774.1)，分離自黑龍江省某羊群糞便，保存于玉米粉瓊脂(CMA)斜面培養(yǎng)基中，由西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院寄生蟲(chóng)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1D.flagransF088的液體培養(yǎng)及相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 稱(chēng)取紅糖30 g、蛋白胨2.5 g、KH2PO45 g、MgSO40.5 g，去離子水定容至1 000 mL，pH調(diào)至6.5，分裝入500 mL三角錐形瓶(100 mL/瓶)中，于121 ℃滅菌。待培養(yǎng)液溫度降至室溫后，將在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)皿上活化的D.flagransF088菌株，用直徑6 mm打孔器取末端菌塊8塊至每瓶培養(yǎng)液中，置于28 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)，培養(yǎng)2 d后，每天取樣1次，檢測(cè)各指標(biāo)，共測(cè)7次。設(shè)置3次重復(fù)。

pH采用pHS-3C數(shù)顯酸度計(jì)(上海宇隆儀器有限公司生產(chǎn))測(cè)定；厚垣孢子產(chǎn)量采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法測(cè)定；OD600采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定，波長(zhǎng)600 nm；測(cè)定菌絲干質(zhì)量時(shí)，每天每瓶取10 mL液體于5 000 r/min離心20 min，棄上清用濾紙過(guò)濾，無(wú)菌水清洗4次，置鼓風(fēng)干燥箱中于75 ℃干燥至恒質(zhì)量。

1.2.2 不同碳源對(duì)D.flagransF088厚垣孢子產(chǎn)量與菌絲平均生長(zhǎng)速率的影響 稱(chēng)取瓊脂粉20 g，蛋白胨4 g，加去離子水定容至1 000 mL，分別加入碳源葡萄糖、蔗糖、肌醇、可溶性淀粉、甘油、白糖、紅糖20 g(pH 6.5)，以不加碳源為對(duì)照，121 ℃ 滅菌后倒培養(yǎng)皿備用。試驗(yàn)時(shí)取在PDA培養(yǎng)皿中生長(zhǎng)時(shí)間和長(zhǎng)勢(shì)一致的菌種，用打孔器從菌落邊緣切下直徑6 mm的接種物，接種于各培養(yǎng)皿中央，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，相對(duì)濕度保持在95%。從接種后的第2 天起，每天定時(shí)用游標(biāo)卡尺從培養(yǎng)皿的背面十字交叉法測(cè)量菌落直徑，連續(xù)測(cè)定4 d(因第5 天時(shí)部分培養(yǎng)皿已鋪滿菌絲)，記錄和計(jì)算每個(gè)培養(yǎng)皿中菌絲的平均生長(zhǎng)速率，菌絲平均生長(zhǎng)速率=菌落半徑(mm)/生長(zhǎng)時(shí)間(d)。待菌生長(zhǎng)15 d后，將培養(yǎng)皿中的菌絲體輕輕用1 mL體積分?jǐn)?shù)0.05%吐溫-80洗下，移到1.5 mL塑料管中，在渦流混合器上振蕩15 min，使孢子充分分散在懸浮液中。將孢子懸液適當(dāng)稀釋后取1 μL滴入血球計(jì)數(shù)板凹槽中，400倍顯微鏡下對(duì)5個(gè)方格內(nèi)的厚垣孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)培養(yǎng)皿取3次計(jì)數(shù)平均值，計(jì)算厚垣孢子產(chǎn)量(厚垣孢子產(chǎn)量=每個(gè)培養(yǎng)皿中孢子總數(shù)/菌絲生長(zhǎng)面積)。每個(gè)處理設(shè)置3組重復(fù)。

1.2.3 不同氮源對(duì)D.flagransF088厚垣孢子產(chǎn)量與菌絲平均生長(zhǎng)速率的影響 稱(chēng)取瓊脂粉20 g，葡萄糖20 g，加去離子水定容至1 000 mL，分別加入氮源尿素、蛋白胨、大豆蛋白胨、干酪素、氯化銨、硝酸鉀4 g(pH 6.5)，以不加氮源為對(duì)照，按照1.2.2節(jié)方法測(cè)定各培養(yǎng)基中的菌絲平均生長(zhǎng)速率和厚垣孢子產(chǎn)量。每個(gè)處理設(shè)置3組重復(fù)。

1.2.4 不同碳氮比對(duì)D.flagransF088厚垣孢子產(chǎn)量與菌絲平均生長(zhǎng)速率的影響 稱(chēng)取瓊脂粉20 g，加去離子水定容至1 000 mL，加入葡萄糖作為唯一碳源，硝酸鉀為唯一氮源。在硝酸鉀(4 g/L)不變的基礎(chǔ)上，通過(guò)添加葡萄糖的量調(diào)整碳氮比分別為1∶40，1∶20，1∶10，1∶5，1∶1，5∶1，10∶1，20∶1和40∶1，按照1.2.2節(jié)方法測(cè)定菌絲平均生長(zhǎng)速率和厚垣孢子產(chǎn)量。每個(gè)處理設(shè)置3組重復(fù)。

1.2.5 不同維生素和無(wú)機(jī)鹽對(duì)D.flagransF088厚垣孢子產(chǎn)量與菌絲平均生長(zhǎng)速率的影響 稱(chēng)取瓊脂粉20 g，蛋白胨4 g，葡萄糖20 g，加去離子水定容至1 000 mL，分別添加 VB1、VB6、VB1210 mg，進(jìn)行維生素試驗(yàn)；分別添加無(wú)機(jī)鹽MgSO4、CaCl2、NaCl、KH2PO41 g，進(jìn)行無(wú)機(jī)鹽試驗(yàn)，以不加維生素和無(wú)機(jī)鹽為對(duì)照，按照1.2.2節(jié)方法測(cè)定菌絲平均生長(zhǎng)速率和厚垣孢子產(chǎn)量。每個(gè)處理設(shè)置3組重復(fù)。

1.2.6 不同營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)D.flagransF088厚垣孢子產(chǎn)量與菌絲平均生長(zhǎng)速率的正交試驗(yàn) 在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取最佳碳源(白糖)、氮源(大豆蛋白胨)、維生素(VB1)、無(wú)機(jī)鹽(MgSO4)作為自變量，設(shè)計(jì)4因素3水平的正交試驗(yàn)(表1)，以厚垣孢子產(chǎn)量和菌絲平均生長(zhǎng)速率為主要指標(biāo)，篩選各因子之間的最優(yōu)組合。按照1.2.2節(jié)方法測(cè)定厚垣孢子產(chǎn)量和菌絲平均生長(zhǎng)速率。每個(gè)處理設(shè)置3組重復(fù)。

表1 不同營(yíng)養(yǎng)元素對(duì)D.flagrans F088厚垣孢子產(chǎn)量和菌絲平均生長(zhǎng)速率影響的正交試驗(yàn)方案Table 1 Orthogonal test for effects of different nutritional factors on chlamydospores production and mycelial average growth rate of D. flagrans F088

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，用Excel 2010和GraphPad Prism 5進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 D.flagrans F088液體培養(yǎng)過(guò)程中相關(guān)指標(biāo)的變化

圖1-A顯示，在培養(yǎng)前4 d，D.flagransF088菌液pH值明顯下降，之后pH相對(duì)趨于穩(wěn)定并維持在4.4～4.5。圖1-B顯示，培養(yǎng)過(guò)程中菌液OD600值隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)不斷升高，接種2 d后OD600值為0.577，培養(yǎng)結(jié)束后OD600值升高為11.928，上升95.16%。在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，OD600值在2～4 d時(shí)屬于躍升期，在5～8 d時(shí)升高逐漸趨于平緩。圖1-C顯示，在菌絲培養(yǎng)過(guò)程中，前2 d之內(nèi)處于遲滯期，菌絲幾乎不生長(zhǎng)，2 d時(shí)僅有少量菌絲形成。4 d時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)菌絲干質(zhì)量達(dá)到最大，為12.07 g/L。培養(yǎng)5～8 d時(shí)菌絲生長(zhǎng)處于平穩(wěn)期，菌絲干質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。

圖1 D. flagrans F088菌株液體培養(yǎng)過(guò)程中相關(guān)指標(biāo)的變化Fig.1 Changes of indexes related to D. flagrans F088 in liquid culture

由圖1-D可知，處在生長(zhǎng)遲滯期的前2 d無(wú)厚垣孢子形成，3 d時(shí)開(kāi)始有少量厚垣孢子出現(xiàn)，4 d時(shí)達(dá)到爆發(fā)期，此時(shí)厚垣孢子量明顯增多，之后又逐漸下降；6 d后又有一個(gè)爆發(fā)期，培養(yǎng)8 d時(shí)厚垣孢子產(chǎn)量可達(dá)5.82×105mL-1。

上述4個(gè)指標(biāo)與培養(yǎng)時(shí)間之間的相關(guān)性分析結(jié)果(表2)顯示，培養(yǎng)時(shí)間與各指標(biāo)均極顯著相關(guān)，其中與OD600值和厚垣孢子產(chǎn)量的相關(guān)性最強(qiáng)，與pH值呈極顯著負(fù)相關(guān)。表明OD600值和厚垣孢子產(chǎn)量均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，pH則不斷變小。與pH值相關(guān)性較強(qiáng)的因子為OD600值和菌絲干質(zhì)量，且均呈極顯著負(fù)相關(guān)。厚垣孢子產(chǎn)量與OD600值和菌絲干質(zhì)量的相關(guān)系數(shù)較高，且均呈極顯著正相關(guān)，而菌絲干質(zhì)量與OD600值也呈極顯著正相關(guān)。

表2 D.flagrans F088菌株液體培養(yǎng)過(guò)程中各指標(biāo)間的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of indexes in culture process of D.flagrans F088

2.2 不同碳源、氮源對(duì)D.flagrans F088厚垣孢子產(chǎn)量與菌絲平均生長(zhǎng)速率的影響

不同碳源、氮源對(duì)捕食線蟲(chóng)真菌D.flagransF088厚垣孢子產(chǎn)量和菌絲平均生長(zhǎng)速率的影響分別如圖2和表3，4所示。由圖2-A可見(jiàn)，除甘油外，添加其他碳源對(duì)厚垣孢子產(chǎn)量的影響效果均明顯優(yōu)于不加碳源。其中以白糖為碳源時(shí)厚垣孢子產(chǎn)量最多，可達(dá)3.19×104cm-2；其次為蔗糖，與白糖差異不顯著(P>0.05)，以甘油為碳源時(shí)產(chǎn)生的孢子量最少。由表3的菌絲平均生長(zhǎng)速率可知，與對(duì)照相比，除甘油外添加其他碳源均可促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)，其中以紅糖效果最好，而甘油則對(duì)菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)出一定的抑制作用。

表3 不同碳源對(duì)D.flagrans F088菌絲平均生長(zhǎng)速率的影響Table 3 Mycelial average growth rate of D.flagrans F088 under different carbon sources mm/d

圖2-B顯示，以大豆蛋白胨作為氮源時(shí)，厚垣孢子產(chǎn)量最多，達(dá)6.15×104cm-2，且顯著高于其他處理(P<0.05)；蛋白胨和干酪素次之。而以氯化銨、尿素、硝酸鉀為氮源時(shí)，與對(duì)照相比，其厚垣孢子產(chǎn)量差異不顯著，且尿素、硝酸鉀對(duì)厚垣孢子的產(chǎn)生表現(xiàn)出一定的抑制作用。由表4可知，大豆蛋白胨是促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)的最佳氮源，蛋白胨次之；與對(duì)照相比，尿素、干酪素、氯化銨會(huì)抑制菌絲生長(zhǎng)，硝酸鉀的影響不顯著。

圖柱上標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示各處理間差異顯著(P<0.05)。下同Different lowercase letters mean significant difference among treatments (P<0.05). The same below

表4 不同氮源對(duì)D.flagrans F088菌絲平均生長(zhǎng)速率的影響Table 4 Mycelial average growth rate of D.flagrans F088 under different nitrogen sources mm/d

2.3 不同碳氮比對(duì)D.flagrans F088厚垣孢子產(chǎn)量與菌絲平均生長(zhǎng)速率的影響

不同碳氮比對(duì)D.flagransF088厚垣孢子產(chǎn)量與菌絲平均生長(zhǎng)速率的影響如圖3和表5所示。圖3顯示，產(chǎn)孢量最高的碳氮比為40∶1，孢子產(chǎn)量可達(dá)0.34×104cm-2，且與其他處理差異顯著(P<0.05)。由表5可知，碳氮比為40∶1時(shí)菌絲平均生長(zhǎng)速率最小，而其余碳氮比之間菌絲平均生長(zhǎng)速率無(wú)顯著差異。

圖3 不同碳氮比對(duì)D.flagrans厚垣孢子產(chǎn)量的影響 Fig.3 Effect of different C∶N ratios on chlamydospores production of D.flagrans F088

表5 不同碳氮比對(duì)D.flagrans F088菌絲平均生長(zhǎng)速率的影響

表5(續(xù)) Continued table 5

2.4 不同維生素和無(wú)機(jī)鹽對(duì)D.flagrans F088厚垣孢子產(chǎn)量與菌絲平均生長(zhǎng)速率的影響

不同維生素和無(wú)機(jī)鹽對(duì)D.flagransF088厚垣孢子產(chǎn)量和菌絲平均生長(zhǎng)速率的影響如圖4和表6所示。由圖4-A可知，與對(duì)照相比加入維生素后，D.flagransF088厚垣孢子產(chǎn)量均有所提高，其中以VB1最佳(3.93×104cm-2)(P<0.05)。由表6可知，與對(duì)照相比，3種維生素對(duì)D.flagransF088菌絲平均生長(zhǎng)速率無(wú)明顯促進(jìn)效果(P>0.05)。

圖4-B顯示，加入無(wú)機(jī)鹽MgSO4有利于厚垣孢子產(chǎn)量的提高(1.78×104cm-2)，且與其他處理差異顯著(P<0.05)。與對(duì)照相比，加入NaCl、KH2PO4對(duì)厚垣孢子的產(chǎn)生存在一定的抑制作用。表6顯示，與對(duì)照相比，加入MgSO4、NaCl、CaCl2對(duì)菌絲平均生長(zhǎng)速率均無(wú)顯著促進(jìn)作用(P>0.05)，而KH2PO4甚至延緩了菌絲的生長(zhǎng)。

圖4 不同維生素(A)和無(wú)機(jī)鹽(B)對(duì)D.flagrans F088厚垣孢子產(chǎn)量的影響

表6 不同維生素和無(wú)機(jī)鹽對(duì)D.flagrans F088菌絲平均生長(zhǎng)速率的影響Table 6 Mycelial average growth rate of D.flagrans F088 under different vitamins and inorganic salts mm/d

2.5 D.flagrans F088厚垣孢子產(chǎn)量和菌絲平均生長(zhǎng)速率培養(yǎng)配方的優(yōu)化

正交試驗(yàn)結(jié)果(表7)顯示，4個(gè)因子對(duì)D.flagransF088產(chǎn)孢量影響的大小排序?yàn)榘滋?大豆蛋白胨>VB1>MgSO4。厚垣孢子產(chǎn)量的最佳培養(yǎng)條件為A3B2C1D3，即白糖30 g/L、大豆蛋白胨4 g/L、MgSO41 g/L、VB130 mg/L，在此條件下厚垣孢子產(chǎn)量可達(dá)8.64×104cm-2。

表7 基于D.flagrans F088厚垣孢子產(chǎn)量的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 7 Orthogonal test results for chlamydospores production of D.flagrans F088

菌絲平均生長(zhǎng)速率的測(cè)定結(jié)果(表8)顯示，各試驗(yàn)組中的菌絲均生長(zhǎng)良好，相對(duì)而言，其中試驗(yàn)8(30 g/L白糖、4 g/L大豆蛋白胨、1 g/L MgSO4、30 mg/L VB1)的菌絲平均生長(zhǎng)速率最快，但與其他試驗(yàn)組并無(wú)顯著差異(P>0.05)。

表8 基于D.flagrans F088菌絲平均生長(zhǎng)速率的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 8 Orthogonal test results for mycelial average growth rate of D.flagrans F088

綜合以上結(jié)果，確定D.flagransF088厚垣孢子產(chǎn)量和菌絲生長(zhǎng)的最佳培養(yǎng)組合配方為白糖30 g/L、大豆蛋白胨4 g/L、MgSO41 g/L、VB130 mg/L。

3 討 論

環(huán)境pH是評(píng)價(jià)微生物活躍程度的一個(gè)重要參數(shù)。有研究表明，跟蹤分析發(fā)酵過(guò)程，監(jiān)測(cè)培養(yǎng)物中pH及菌體密度的變化，對(duì)其發(fā)酵工藝的制定非常重要[21-22]。本研究顯示，D.flagransF088的pH值與OD600值、菌絲干質(zhì)量及厚垣孢子產(chǎn)量均呈負(fù)相關(guān)，pH值在接種4 d內(nèi)急劇下降，之后趨于平緩；OD600在接種4 d內(nèi)急劇上升，之后緩慢增加；菌絲干質(zhì)量則在4 d內(nèi)急劇上升，而后趨于平緩；厚垣孢子產(chǎn)量在4 d時(shí)呈爆發(fā)式增加，此后仍一直緩慢增加。在菌體培養(yǎng)過(guò)程中，接種后4 d處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，由于菌體生長(zhǎng)快速、能量消耗迅速，導(dǎo)致pH快速下降，同時(shí)OD600值、菌絲干質(zhì)量、厚垣孢子產(chǎn)量快速上升。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)、次生代謝產(chǎn)物的形成影響了菌體的生長(zhǎng)，菌絲干質(zhì)量變化平穩(wěn)。由于厚垣孢子是在菌絲不斷老化的過(guò)程中形成的，因而在培養(yǎng)后期厚垣孢子產(chǎn)量仍然增加，OD600值也在緩慢上升。

許多微生物包括真菌的生長(zhǎng)發(fā)育都與碳源種類(lèi)有關(guān)。本研究表明，D.flagransF088菌株可利用幾種常見(jiàn)的碳源，但培養(yǎng)基中不同種類(lèi)的碳源,對(duì)厚垣孢子產(chǎn)量和菌絲生長(zhǎng)的影響也存在一定差異。白糖可促進(jìn)厚垣孢子的形成，紅糖則有利于菌絲的生長(zhǎng)。Liu等[23]報(bào)道，糖原可促進(jìn)食線蟲(chóng)真菌洛斯里被毛孢(Hirsutellarhossiliensis)的菌絲生長(zhǎng)，但其并不是產(chǎn)孢的最佳碳源，且該菌不同分離株間存在差異，如D-(+)-海藻糖有利于菌株ATCC46487產(chǎn)孢，而D-山梨醇和D-(+)-纖維二糖分別有助于菌株OWVT-1和菌株JA16-1產(chǎn)孢。Federica等[24]報(bào)道，向沙氏葡萄糖瓊脂中添加體積分?jǐn)?shù)0.5%的內(nèi)消旋肌醇能夠提高D.flagrans厚垣孢子的產(chǎn)量。然而本研究顯示，白糖、蔗糖、葡萄糖、紅糖較肌醇的產(chǎn)孢效果更好。Gardner等[25]報(bào)道，在Vogel’s mineral salt medium(VMSM) 培養(yǎng)基中加入淀粉或者甘油能夠顯著促進(jìn)D.flagrans產(chǎn)孢，而本研究中添加甘油不能增加產(chǎn)孢量。另有研究表明，3株厚垣孢普可尼亞菌在-10 MPa含有甘油的CMA中不能生長(zhǎng)，但將菌塊移至無(wú)甘油的CMA中則有厚垣孢子產(chǎn)生[26]，這與本研究結(jié)果相似。關(guān)于氮源對(duì)食線蟲(chóng)真菌生長(zhǎng)的影響，Jokar等[27]報(bào)道，不同食線蟲(chóng)真菌菌株對(duì)氮源的利用存在差異，硝酸銨能促進(jìn)所有測(cè)試菌株的生長(zhǎng)，其次是硝酸鈉和硝酸鉀，L-脯氨酸表現(xiàn)最差。本試驗(yàn)中，硝酸鉀對(duì)菌絲生長(zhǎng)無(wú)明顯促進(jìn)效果。Li[3]觀察發(fā)現(xiàn)，在少孢節(jié)叢孢(Arthrobotrysoligospora)培養(yǎng)基中加入氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、尿素后，菌絲產(chǎn)量降低。本研究發(fā)現(xiàn)，添加尿素、氯化銨會(huì)抑制菌絲的生長(zhǎng)，而氯化銨、尿素和硝酸鉀對(duì)厚垣孢子產(chǎn)量的影響與對(duì)照相比差異不顯著。Silva等[28]發(fā)現(xiàn)，在大豆葡萄糖培養(yǎng)基 (pH 6～7)中D.flagrans菌絲生長(zhǎng)最佳。本試驗(yàn)也表明，大豆蛋白胨可以促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)，且對(duì)厚垣孢子產(chǎn)量有明顯的促進(jìn)作用。

Elson等[29]研究表明，當(dāng)碳源質(zhì)量濃度為1.25～2.5 g/L、碳氮比為10∶1時(shí)，菌株馬鈴薯銀屑病菌(Helminthosporiumsolani)產(chǎn)生的分生孢子量最大，高碳氮比會(huì)抑制分生孢子的產(chǎn)生。Mo等[30]發(fā)現(xiàn)，厚垣普可尼亞菌在碳氮比為10∶1、pH為3.7時(shí)，分生孢子產(chǎn)量最高；碳氮比為40∶1、pH為6.8時(shí)，菌體生物量最高。Gao[31]的研究表明，食線蟲(chóng)真菌厚垣孢普可尼亞菌菌絲量達(dá)到最高時(shí)的碳氮比為160∶1，碳氮源組合為果糖+大豆蛋白胨。本試驗(yàn)中，碳氮比為40∶1時(shí)厚垣孢子產(chǎn)量最大，而菌絲生長(zhǎng)速度卻最慢，表明厚垣孢子產(chǎn)生和菌絲生長(zhǎng)的最佳碳氮比并不一致。此外，維生素可明顯促進(jìn)洛斯里被毛孢的產(chǎn)孢與菌絲生長(zhǎng)，且以VB1效果最好[24]。本研究也顯示，VB1可顯著提高厚垣孢子的產(chǎn)量。

Arias等[32]報(bào)道，線蟲(chóng)、吸蟲(chóng)及其抽提物能夠明顯促進(jìn)D.flagrans厚垣孢子的產(chǎn)生。Anank’ko等[33]報(bào)道，與不平衡培養(yǎng)基相比，營(yíng)養(yǎng)平衡的培養(yǎng)基能夠提高D.flagrans厚垣孢子產(chǎn)量；在液體培養(yǎng)基中加入400～1 600條全冠復(fù)活線蟲(chóng)(Panagrellusredivivus)后，厚垣孢子的數(shù)量達(dá)到1.02×105mL-1，與不加線蟲(chóng)相比增加了3倍。然而加線蟲(chóng)的方法在工業(yè)生產(chǎn)中難以施行。Gardner等[25]使用兩階段培養(yǎng)法，首先將菌種接種至MYPG(含有麥芽提取物、酵母抽提物、蛋白胨和葡萄糖)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待菌絲生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后，再將菌絲轉(zhuǎn)接至含10 g/L淀粉的VMSM液體培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)，如此可使厚垣孢子數(shù)量提高到6.2×105mL-1。Santurio等[34]使用液固雙相培養(yǎng)法，先將D.flagrans接種到沙保氏肉湯中培養(yǎng)作為液體種子液，然后將液體培養(yǎng)物接種到以玉米、大米等谷粒為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)與單相培養(yǎng)相比孢子產(chǎn)量有所提高。本研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)得到D.flagransF088產(chǎn)厚垣孢子和菌絲生長(zhǎng)的最佳配方為：白糖30 g、大豆蛋白胨4 g、MgSO41 g、VB130 mg，去離子水1 000 mL，在此條件下，厚垣孢子產(chǎn)量可達(dá)8.64×104cm-2，這為該菌液體發(fā)酵工藝的確定提供了參考，后續(xù)將對(duì)該菌厚垣孢子形成的影響因素和機(jī)理進(jìn)行進(jìn)一步研究，以建立可工業(yè)化應(yīng)用的培養(yǎng)工藝條件。