外源茉莉酸甲酯和異亮氨酸對灰霉菌侵染后圣女果抗病性酶酶活的影響

羅吉慶,張永杰，吳艾頻，夏 敏，張 薇

(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000)

脫落酸、水楊酸、菜油素內(nèi)酯等植物激素可對果蔬進行誘導(dǎo)，進而增強果蔬采后貯藏的品質(zhì)，目前已應(yīng)用于李果[1]、香蕉[2]、葡萄[3]和藍(lán)莓[4]等水果的采后貯藏。研究表明：植物細(xì)胞內(nèi)存在茉莉酸信號通路途徑[5],α-亞麻酸在脂肪氧化酶作用下生成茉莉酸(JA)，并在茉莉酸氨基酸合成酶(JARs)催化下與異亮氨酸(Ile)生成茉莉酸鹽(JA-Ile)，JA-Ile能與茉莉酸信號受體蛋白(COI1)結(jié)合并泛肽標(biāo)記茉莉酸信號通路的阻礙蛋白(JAZ)，進而降解并釋放茉莉酸通路的轉(zhuǎn)錄因子(MYC2)，響應(yīng)外界環(huán)境變化做出應(yīng)答，增強植物的抗病性和耐受性。

茉莉酸甲酯(MeJA)是JA的甲酯化衍生物[6]，能通過誘導(dǎo)植物合成抗氧化酶，參與作物的次生代謝過程，對提高植物的抗病性和耐受性起到至關(guān)重要的作用。在重金屬砷[7]的脅迫下，MeJA能協(xié)同茉莉酸信號的響應(yīng)基因，提高多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶的活性，從而提高植物抗逆性。此外，對于鹽脅迫[8]、干旱脅迫[9]、低溫脅迫[10]等，外源MeJA能提高植物JA-Ile含量，進而提高植物的抗氧化酶酶活和抗氧化活性物質(zhì)的積累，這對MeJA應(yīng)用在果蔬的采后貯藏意義深遠(yuǎn)。

Ile經(jīng)植物體內(nèi)JARs作用與JA耦合成活性的JA-Ile，參與植物的抗病性應(yīng)答，提高植物的耐受性[11]。利用外源的Ile處理葡萄后發(fā)現(xiàn)，葡萄的花青素含量較高[12]，外源的Ile能促進活性成分的積累從而提高抗氧化性。

灰霉菌是果蔬常見的灰霉病的致病菌[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，MeJA能誘導(dǎo)植物的抗氧化酶酶活提高和其他的抗氧化活性成分的積累，從而提高對灰霉菌腐爛的抗病性，該抗性過程主要受JA-Ile調(diào)控[14]。

圣女果含有豐富的營養(yǎng)成分且在貯藏期間易發(fā)生灰霉病，造成大量腐爛。本研究以外源的MeJA和Ile處理圣女果，并接種灰霉菌，對實驗組和對照組的病斑直徑和抗病相關(guān)酶進行測定，以探究外源MeJA、Ile的協(xié)同處理是否能提高抗病性酶酶活，增強圣女果對灰霉菌的抗病性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MeJA、硝基四氮唑藍(lán)(NBT)、核黃素，合肥巴斯夫生物科技有限公司；愈創(chuàng)木酚、苯丙氨酸、蛋氨酸、Ile、EDTA-Na2，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；次氯酸、體積分?jǐn)?shù)30%H2O2，成都金山化學(xué)試劑有限公司；硼砂、鄰苯二酚、濃鹽酸、硼酸、Na2HPO4、NaH2PO4、抗壞血酸，成都市科隆化工試劑廠；β-巰基乙醇，上海澤葉生物科技有限公司；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DNP-9025型恒溫培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；L3-C85型打漿機，九陽股份有限公司；501型水浴鍋，常州智博瑞儀器制造有限公司；UV-1000型紫外可見分光光度儀，翱藝儀器(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1樣品預(yù)處理

對采后2 d的圣女果用自來水清洗，去掉表面的雜質(zhì)和果蒂部分，并除去破損的果實。配制體積分?jǐn)?shù)1%的次氯酸鈉溶液浸泡圣女果1 min，再用去離子水浸泡1 min，重復(fù)3次后，撈出圣女果自然晾干，并分成空白對照組、Ile組、MeJA組和MeJA+ILe組4組。配制10 mmol/L的Ile溶液浸泡Ile組和MeJA+Ile組的圣女果30 min后撈出自然晾干，對照組和MeJA組用去離子水浸泡30 min后晾干，最后將晾干的MeJA組和MeJA+Ile組用10 μmol/L的MeJA密封在容器中，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱，放置48 h后完成熏蒸處理，對照組和Ile組圣女果用等量的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇代替MeJA，同等熏蒸條件處理。熏蒸前的圣女果酶活測定為第1次測定點，時間記為-24 h，每隔24 h測定酶活。

1.3.2病原菌接種

將熏蒸完成后的圣女果中軸線部位打孔(直徑2 mm、深2 mm)，每個圣女果對稱打2個孔。接種5 μL配制好的3×108spores/mL的灰霉菌孢子進行實驗，接種完成后測量病斑直徑，記作24 h，依次在36、48、72、96、120 h測定病斑直徑。

隨著人口老齡化的日益加劇，其產(chǎn)生的問題也影響著個人、家庭以及整個社會。預(yù)防老年疾病、延緩認(rèn)知老化、提高老年人的生活自理能力，讓老年人安享晚年，已經(jīng)成為國內(nèi)外專家學(xué)者關(guān)注的熱點。然而，伴隨著增齡進程，老齡化問題也表現(xiàn)出特異性，即老化現(xiàn)象僅體現(xiàn)在某些個體上，而在其他人群中則出現(xiàn)了正常或成功老齡化。這種不一致的現(xiàn)象是如何產(chǎn)生的？身體活動的參與是否是一項重要的影響因素，這些問題都有待回答。本文從成功老化的內(nèi)涵及特征出發(fā)，闡釋身體活動對成功老化的促進作用，以期在老齡化突出的社會進程中預(yù)防老年疾病，促進老年人成功老齡化。

1.3.3酶活測定

每組取樣品圣女果6個，重復(fù)3次取樣，先用游標(biāo)卡尺測量病斑直徑并做記錄。將所選圣女果預(yù)冷后完整放入打漿機勻漿30 s，各稱取5 g樣品測定酶活(以圣女果鮮質(zhì)量計)，酶活單位U/g。

1)苯丙氨酸解氨酶(PAL)酶活測定[11]：取樣品5 g加入10 mL pH值8.8的硼砂-硼酸緩沖液和0.3 g PVP，搖勻靜置30 min后，單層濾紙過濾得到粗酶提取液。取1 mL的粗酶液和3 mL 0.02 mol/L苯丙氨酸混合，置于30 ℃水浴鍋反應(yīng)1 h后取出添加1 mL的6 mol/L鹽酸終止反應(yīng)，調(diào)零組以1 mL去離子水代替酶液。290 nm測定吸光度A290并計算酶活，見式(1)。

(1)

式(1)中，V1，粗酶提取液總體積，mL;t,反應(yīng)時間，min；V2，參與反應(yīng)的酶液體積，mL;m,圣女果鮮質(zhì)量，g。

2)多酚氧化酶(PPO)、過氧化物氧化酶(POD)酶活測定：取樣品5 g加入10 mL pH值6.4的磷酸緩沖液和0.25 g PVP ，搖勻靜置30 min后，單層濾紙過濾得粗酶提取液。取20 μL的粗酶提取液加入3 mL 0.2 mol/L鄰苯二酚搖勻后，觀察tmin內(nèi)410 nm波長下吸光度變化值ΔA410，并以20 μL去離子水取代酶液設(shè)置調(diào)零組，計算PPO酶活,見式(2),結(jié)果以1 min吸光度變化0.01為1 U[15]。

(2)

取30 μL的粗酶提取液加入3 mL體積分?jǐn)?shù)1.19%愈創(chuàng)木酚，隨后添加100 μL體積分?jǐn)?shù) 0.2%的H2O2搖勻后，于470 nm波長下觀察tmin內(nèi)吸光度變化值ΔA470，其中以30 μL去離子水取代酶液設(shè)置調(diào)零組，計算POD酶活，見式(3)，結(jié)果以1 min吸光度變化0.01為1 U[10]。

(3)

3)超氧化物歧化酶(SOD)酶活測定[9-10]：取樣品5 g加入10 mL pH值7.8的磷酸緩沖液和0.3 g PVP，搖勻靜置30 min后，單層濾紙過濾得粗酶提取液；隨后取50 μL粗酶液依次添加300 μL 130 mmol/L Met、750 μmol/L NBT、100 μmol/L EDTA-Na2、20 μmol/L 核黃素、1.5 mL pH值7.8磷酸緩沖液和250 μL去離子水，構(gòu)成3 mL的反應(yīng)體系，并分別設(shè)置曝光的對照組L和避光的對照組D，以50 μL去離子水取代酶液添加。添加酶液反應(yīng)組和曝光對照組L在4 000 lx光強下反應(yīng)30 min；避光對照組D避光30 min后，在560 nm波長下，用避光對照D組調(diào)零，測定曝光對照組吸光度AL和反應(yīng)組吸光度A560，酶活結(jié)果以1 g組織在反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時，所對應(yīng)的量為一個SOD酶活力單位(U)，計算見式(4)。

(4)

不同小寫字母表示相同時間不同處理組的數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母則表示差異極顯著(P<0.01)。圖1 MeJA和Ile處理對灰霉菌侵染圣女果后病斑直徑的影響Fig.1 Effects of MeJA and Ile treatment on lesion diameter after cherry tomatoes infected by Botrytis cinerea

4)過氧化氫氧化酶(CAT)酶活測定[10]：取樣品5 g加入10 mL pH 值7.0的磷酸緩沖液和0.5 g的PVP，搖勻靜置30 min后，單層濾紙過濾得粗酶提取液。取200 μL粗酶提取液依次添加1 mL pH值7.0的磷酸緩沖液、1.7 mL去離子水、200 μL體積分?jǐn)?shù)0.2%過氧化氫，構(gòu)成3 mL反應(yīng)體系，于240 nm波長測定tmin吸光度變化值ΔA240，以200 μL去離子水取代酶液設(shè)置調(diào)零組，CAT酶活計算見式(5)。

(5)

5)抗壞血酸過氧化物酶(APX)酶活測定[8,10]：取樣品5 g加入10 mL pH值7.0的磷酸緩沖液,搖勻靜置30 min后單層濾紙過濾得粗酶提取液。取400 μL粗酶提取液依次添加3 mL pH值7.0的0.1 mmol/L EDTA-Na2、200 μL 0.3 mmol/L抗壞血酸、200 μL 體積分?jǐn)?shù)0.2%過氧化氫，構(gòu)成3.5 mL反應(yīng)體系，于290 nm波長下測定tmin吸光度變化值ΔA290，以400 μL去離子水取代酶液設(shè)置調(diào)零組，APX酶活計算見式(6)。

(6)

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗均取3組平行，重復(fù)測定3次。應(yīng)用Microsoft Excel 2010和SPSS Statistics 24軟件進行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用鄧肯氏多重比較方法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對圣女果病斑直徑的影響

圖1為MeJA和Ile處理對灰霉菌侵染圣女果后病斑直徑的影響。接種灰霉菌后的圣女果病斑直徑隨著時間延長而增大，且對照組與實驗組均有顯著差異(P<0.05)；對照組與MeJA+Ile組病斑直徑差異極顯著(P<0.01)。120 h時，對照組的病斑直徑達(dá)到最大值。通過病斑直徑的對比，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過MeJA、Ile處理后的圣女果接種灰霉菌后的病斑直徑較小，圣女果對灰霉菌的敏感性降低。其中，MeJA+Ile組對該過程病斑直徑的影響最大，能有效地降低灰霉菌侵染后圣女果的腐爛程度。

2.2 不同處理對抗病性酶酶活的影響

2.2.1對PAL酶活的影響

圖2為MeJA和Ile處理對灰霉菌侵染圣女果后PAL酶活的影響。PAL催化苯丙氨酸轉(zhuǎn)化成反式肉桂酸等中間代謝產(chǎn)物，作為木質(zhì)素、花色苷等抗病性成分合成的前體而增強果蔬在貯藏過程的抗病性和耐受性[16]。本研究對圣女果接種灰霉菌后，PAL酶活呈現(xiàn)上升趨勢，72 h時，酶活實現(xiàn)躍變，稍后增長較為平緩，其中MeJA+Ile組與對照組差異顯著(P<0.05)。圣女果在接種灰霉菌后PAL酶活保持在較高的水平，灰霉菌引起的腐爛能增強PAL酶活。

不同小寫字母表示相同時間不同處理組的數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母則表示差異極顯著(P<0.01)。圖2 MeJA和Ile處理對灰霉菌侵染圣女果后PAL酶活的影響Fig.2 Effects of MeJA and Ile treatment on PAL activity after cherry tomatoes infected by Botrytis cinerea

2.2.2對CAT酶活的影響

圖3為MeJA和Ile處理對灰霉菌侵染圣女果后CAT酶活的影響。CAT作為植物細(xì)胞的抗氧化酶簇之一，降低了細(xì)胞在生理代謝過程中產(chǎn)生的超氧陰離子和H2O2水平，維持了機體細(xì)胞正常的機能[11]。圣女果接種灰霉菌后，實驗組酶活均高于對照組，MeJA、Ile對CAT酶活提高有誘導(dǎo)效應(yīng)。經(jīng)過誘導(dǎo)后的圣女果，在接種病菌侵染后，實驗組與對照組酶活差異顯著(P<0.05),MeJA+Ile組酶活與對照組差異極顯著(P<0.01)。MeJA、Ile誘導(dǎo)能提高圣女果CAT酶活，清除灰霉菌在侵染過程中產(chǎn)生的過氧化物，降低對植物細(xì)胞的影響，提高果實的抗病性和耐貯藏性。

不同小寫字母表示相同時間不同處理組的數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母則表示差異極顯著(P<0.01)。圖3 MeJA和Ile處理對灰霉菌侵染圣女果后CAT酶活的影響Fig.3 Effects of MeJA and Ile treatment on CAT activity after cherry tomatoes infected by Botrytis cinerea

2.2.3對SOD酶活的影響

圖4為MeJA和Ile處理對灰霉菌侵染圣女果后SOD酶活的影響。SOD作為自由基的清除劑，在對圣女果接種灰霉菌的抗病性實驗中發(fā)現(xiàn)，對照組SOD酶活較低，與實驗組差異顯著(P<0.05),與MeJA+Ile組差異極顯著(P<0.01)。SOD 酶活的提高能有效地降低圣女果在灰霉菌腐爛過程中產(chǎn)生的過氧化物和超氧陰離子對果實的影響，增強圣女果對灰霉菌的抗病性。

2.2.4對APX酶活的影響

不同小寫字母表示相同時間不同處理組的數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母則表示差異極顯著(P<0.01)。圖4 MeJA和Ile處理對灰霉菌侵染圣女果后SOD酶活的影響Fig.4 Effects of MeJA and Ile treatment on SOD activity after cherry tomatoes infected by Botrytis cinerea

圖5為MeJA和Ile處理對灰霉菌侵染圣女果后APX酶活的影響。APX以維生素C為電子的供體，催化過氧化物，維護機體細(xì)胞正常的代謝機制。在接種灰霉菌后，APX酶活普遍提升，對照組與實驗組差異顯著(P<0.05)，與MeJA+Ile組差異極顯著(P<0.01)。APX對過氧化物的清除，降低了灰霉菌侵染過程產(chǎn)生的和機體自身產(chǎn)生的過氧化物在貯藏過程對圣女果的毒害作用，從而有效地提高圣女果的抗病性和耐貯藏性能。

不同小寫字母表示相同時間不同處理組的數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母則表示差異極顯著(P<0.01)。圖5 MeJA和Ile處理對灰霉菌侵染圣女果后APX酶活的影響Fig.5 Effects of MeJA and Ile treatment on APX activity after cherry tomatoes infected by Botrytis cinerea

2.2.5對PPO酶活的影響

圖6為MeJA和Ile處理對灰霉菌侵染圣女果后PPO酶活的影響。PPO參與酚類的氧化，同時參與木質(zhì)素的形成，對增強細(xì)胞壁的強韌度，增強抗病性和限制灰霉菌真菌毒素的擴散、病原菌的穿透性等方面有一定的效果[17]。此外，MeJA能激活CsPPO2/4的轉(zhuǎn)錄而增強PPO活性[18]。本研究發(fā)現(xiàn)：接種灰霉菌后，PPO酶活在接種后都會有所提高，這是圣女果對于真菌侵染的基礎(chǔ)性的抗病性表現(xiàn)，經(jīng)MeJA、Ile處理的圣女果，PPO酶活高于對照組，96 h時酶活差異顯著(P<0.05);120 h時，MeJA+Ile組酶活與對照組差異極顯著(P<0.01)。PPO酶活的提高可能受到MeJA和Ile的影響，經(jīng)過誘導(dǎo)后，圣女果PPO酶活提高，增強了對灰霉菌引起的腐爛的抗性。

不同小寫字母表示相同時間不同處理組的數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母則表示差異極顯著(P<0.01)。圖6 MeJA和Ile處理對灰霉菌侵染圣女果后PPO酶活的影響Fig.6 Effects of MeJA and Ile treatment on PPO activity after cherry tomatoes infected by Botrytis cinerea

2.2.6對POD酶活的影響

圖7為MeJA和Ile處理對灰霉菌侵染圣女果后POD酶活的影響。POD催化果蔬貯藏過程產(chǎn)生過氧化氫、氧化酚類、胺類化合物和烴類氧化產(chǎn)物，并作為木質(zhì)素合成最后一步的關(guān)鍵酶，增強植物細(xì)胞壁的強韌性構(gòu)建，是果蔬抗病性的主要酶活指標(biāo)。在對圣女果接種灰霉菌的抗病性實驗中發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過灰霉菌接種后，POD酶活都大幅度地提高，實驗組酶活提高迅速，與對照組差異極顯著(P<0.01)。POD可能是存在于植物體內(nèi)的抗病性的基礎(chǔ)酶，MeJA、Ile能誘導(dǎo)茉莉酸信號通路而提高POD酶活，增強圣女果對灰霉菌的抗病性，降低貯藏過程中果實腐爛程度。

不同小寫字母表示相同時間不同處理組的數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母則表示差異極顯著(P<0.01)。圖7 MeJA和Ile處理對灰霉菌侵染圣女果后POD酶活的影響Fig.7 Effects of MeJA and Ile treatment on POD activity after cherry tomatoes infected by Botrytis cinerea

3 結(jié) 論

通過對圣女果接種灰霉菌后酶活的測定和病斑直徑觀察，本研究發(fā)現(xiàn)：PAL、POD和PPO酶活提高，即圣女果自身對灰霉菌的侵染存在一定的抗性。接種灰霉菌的圣女果在病斑直徑的差異也從某種程度上說明了MeJA和Ile能有效地提高圣女果的抗病性。外源添加MeJA和Ile處理圣女果，PAL、POD、PPO酶活在實驗組中普遍較高，該類酶在合成木質(zhì)素的功能上發(fā)揮較為關(guān)鍵的作用，接種灰霉菌的圣女果經(jīng)MeJA和Ile處理后，圣女果的內(nèi)源代謝酶活性得以增強，提高圣女果細(xì)胞壁的機械強度，圣女果的抗灰霉菌腐爛的性能得到增強，這種情況與MeJA應(yīng)用在鮮切菠蘿[19]、鮮切蘋果[20]、草莓[21]中酶活增強的效果類似。MeJA和Ile處理的圣女果抗氧化酶酶活較高，在侵染致病菌后，實驗組的抗氧化酶APX、SOD、CAT酶活整體水平提高，對腐爛過程產(chǎn)生的脅迫因子起到抑制作用，增強了圣女果對腐爛的抗性，這與MeJA應(yīng)用在番茄[22]中酶活增強的研究相似。

對抗病性的酶活研究，揭示了這6種酶與圣女果對灰霉菌侵染的抗病性存在某種聯(lián)系，未施加外源MeJA和Ile時，圣女果的茉莉酸信號通路是如何調(diào)控這些酶的響應(yīng)機制仍需進一步探索。但有研究發(fā)現(xiàn)，茉莉酸和Ile能在植物細(xì)胞內(nèi)形成JA-Ile偶合物，該有效成分是存在于植物體的可轉(zhuǎn)運化合物[23]，參與植物的生物和非生物脅迫的抗性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在植物體內(nèi)的JA-Ile偶聯(lián)物的形成受宿主的可用Ile的限制，外源施加Ile處理是對該偶聯(lián)物的補充[24]，這與本研究中觀察到實驗組病斑直徑較小的結(jié)果一致。外源MeJA和Ile可能會通過提高圣女果的JA-Ile含量，從而增強圣女果的抗氧化酶酶活，對灰霉菌引起的腐爛產(chǎn)生抵御的作用。本研究以10 mmol/L Ile浸泡處理和10 μmol/L MeJA熏蒸有效地提高了SOD、PAL、APX、CAT、PPO、POD酶活，抑制了接種的灰霉菌的擴張，在貯藏過程中有效控制了圣女果的腐爛，提高了果實的貯藏效果。

茉莉酸能與其他的氨基酸偶聯(lián)成新的茉莉酸鹽，如與苯丙氨酸、纈氨酸等[12]，研究結(jié)果對果蔬采后貯藏有重要的指導(dǎo)意義，可利用茉莉酸類化合物聯(lián)合外源氨基酸增強果蔬貯藏的抗氧化活性，提高果蔬采后的貯藏性，旨在為果蔬的防腐保鮮提供一定的理論依據(jù)。