乙酰水楊酸聯(lián)合雙氯芬酸治療骨關(guān)節(jié)炎的機制*

侯圣貴 劉建強

濟南市第四人民醫(yī)院，山東 濟南 250033

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種臨床常見的慢性關(guān)節(jié)疾病，主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛而降低患者生活質(zhì)量，病理檢查顯示病變的關(guān)鍵是關(guān)節(jié)軟骨退行性變合并繼發(fā)性骨質(zhì)增生，引起疼痛［1］，其病變部位主要累及負重大的關(guān)節(jié)，如雙側(cè)膝、雙側(cè)髖，以及脊柱，部分患者累及遠側(cè)指間關(guān)節(jié)［2］。研究證實，OA發(fā)病機制涉及到氧化、局部炎癥、局部免疫紊亂等多種機制，局部病變的關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡過度伴有細胞外基質(zhì)降解過度，關(guān)節(jié)表現(xiàn)為系統(tǒng)損傷［3-4］。損傷過程中主要的炎性因子是白細胞介素-1β（IL-1β），多種致病因素刺激軟骨細胞分泌過量的IL-1β，并誘導(dǎo)胞膜IL-1β受體的高表達［5-6］，導(dǎo)致軟骨細胞損傷。IL-1β不止作用于軟骨細胞，還可以活化氧化應(yīng)激途徑，激活機體的活性氧及NO途徑，多途徑誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡［7］。乙酰水楊酸屬于非甾體抗炎藥，而雙氯芬酸除抗炎作用外，也具有解熱鎮(zhèn)痛效果，本研究采用動物模型觀察兩種藥物聯(lián)合治療骨關(guān)節(jié)炎的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用新西蘭大白兔建模，由中山大學(xué)實驗動物中心購買。雌雄兔共計40只，平均體重（2.5±0.5）kg，雌雄分籠。

1.2 主要試劑

乙酰水楊酸（純度大于98%，上海生工）；雙氯芬酸（純度大于98%，上海生工）；TRIzol試劑盒（美國BD公司）；Primescript RT-PCR試劑盒；SYBR Premix Ex Taq TM II（Perfect Real Time）試劑盒（美國Sigma公司）；BCA蛋白定量試劑盒（美國Sigma公司）；鼠抗人GAPDH抗體（美國BD公司）；兔抗人MMP-3，MMP-13抗體（美國BD公司）；羊抗人TIMP-1抗體（美國BD公司）；DNA marker（美國Sigma公司）；DNA Loading buffer（美國Sigma公司）。

1.3 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱（美國ThermoForma公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠）；電泳槽、蛋白轉(zhuǎn)印槽、電泳儀和電源（美國Bio-rad公司）；GB303基本型電子天平（Mettler—Totado公司）；DDL-5型離心機（上海安亭科技儀器廠）；酶標(biāo)儀（DNM-9606酶標(biāo)分析儀，普朗）；PCR儀（ZY325161，Eppendorf）。

1.4 實驗方法

1.4.1 兔骨關(guān)節(jié)炎模型的建立

隨機取選取8只新西蘭兔作為正常對照組A組，其余32只進行建模。首先以30 g／L戊巴比妥納行新西蘭兔耳緣靜脈注射，選取單側(cè)左后肢膝關(guān)節(jié)，建立骨關(guān)節(jié)炎模型。左側(cè)股骨近段扎止血帶，在膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切口，外側(cè)牽開髕骨及髕韌帶。屈曲兔左膝關(guān)節(jié)，充分顯露。對照組8只，只探查關(guān)節(jié)腔，確認腔內(nèi)無關(guān)節(jié)原發(fā)病變后關(guān)閉關(guān)節(jié)囊并逐層縫合。另32只用于手術(shù)造模，顯露膝關(guān)節(jié)，切斷交叉韌帶及內(nèi)外副韌帶，切除半月板，人為減少關(guān)節(jié)保護作用，確定關(guān)節(jié)軟骨面無損傷后，逐層縫合切口。術(shù)后連續(xù)5天肌內(nèi)注射慶大霉素80萬U（一天一次）。

分組：將32只造模成功的新西蘭大白兔隨機編號。A組：正常對照組；B組：模型對照組；C組：乙酰水楊酸聯(lián)合雙氯芬酸低劑量組治療組（5 mg／kg，乙酰水楊酸∶雙氯芬酸＝1∶1）；D組：乙酰水楊酸聯(lián)合雙氯芬酸中劑量組治療組（10 mg／kg，乙酰水楊酸∶雙氯芬酸＝1∶1）；E組：乙酰水楊酸聯(lián)合雙氯芬酸大劑量組治療組（20 mg／kg，乙酰水楊酸∶雙氯芬酸＝1∶1），每組各8只，見表1。A組、B組給予生理鹽水，C組、D組、E組給予不同濃度的藥物，腹腔注射4周。見表1。

表1 分組及各組藥物劑量

1.4.2 病理學(xué)觀察大白兔滑膜組織

取下動物右后膝關(guān)節(jié)，PBS沖洗后浸泡，甲醛中固定24 h，PBS漂洗，10%EDTA脫鈣12周至關(guān)節(jié)組織變軟，硬度與肌肉相仿，無穿刺阻力。脫鈣完成后取出，固定脫水包埋后石蠟切片，厚度為4μm，然后進行HE染色，1x70型倒置相差顯微鏡（型號：TS100美國尼康公司）下觀察組織病理學(xué)改變。

1.4.3 兔膝關(guān)節(jié)軟骨行大體觀察并進行評分

大體觀察關(guān)節(jié)軟骨，參照文獻標(biāo)準(zhǔn)［8］進行評分，關(guān)節(jié)軟骨表面光滑呈淡藍色或無色半透明狀，計0分。關(guān)節(jié)軟骨表面平滑，僅有軟化，計1分。關(guān)節(jié)軟骨變薄，出現(xiàn)小纖維束狀改變的表面，計2分。纖維束狀變明顯，但無磨損，計3分。軟骨下骨外露，骨硬化，表面磨損性纖維束狀變，計4分。

1.4.4 試劑盒測定各組關(guān)節(jié)液中的NO、IL-1β含量

向術(shù)側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射1.0 ml生理鹽水，反復(fù)抽吸取至試管內(nèi)。離心取上清液，測量上清液中NO、IL-1β含量。檢測方法按照試劑盒以及IL-1β ELISA測定試劑盒說明書進行。

1.4.5 WB法測定MMP-3，MMP-13的蛋白的表達

取兔手術(shù)側(cè)軟骨退變組織樣品約20 mg，充分剪碎后置于勻漿機中攪碎。加入1 ml TRIZOL試劑以及10 mmol／L PMSF40μl，充分混勻后冰上放置10 min，均勻裂解后用無菌注射器反復(fù)抽吸獲得裂解產(chǎn)物。轉(zhuǎn)移裂解液到EP管中，冰浴30 min，低溫離心機12000×g，15 min。上清移入新EP管后，BCA法酶標(biāo)儀測定蛋白濃度。凍存－80℃冰箱。采用SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，分別加入一抗（1∶500，MMP-3，MMP-13），4℃搖床過夜，PBST洗滌三次，二抗（1∶1000）室溫孵育1 h，PBST洗滌，化學(xué)發(fā)光法顯色后顯影、定影。

1.4.6 PCR法測定TIMP-1的mRNA表達

取兔手術(shù)側(cè)關(guān)節(jié)軟骨退變組織樣品約20 mg，剪碎攪拌混勻，按RNA提取試劑盒說明書操作。測濃度后保存在－80℃低溫冰箱。合成cDNA及反轉(zhuǎn)錄根據(jù)試劑盒（Code No.9160）的說明書操作。熒光實時定量PCR依據(jù)試劑盒說明書操作，設(shè)置如下：預(yù)變性（95℃，5 min）；退火（60℃，30 s）；延伸（72℃，20 s），共40個循環(huán)；溶解曲線：60～95℃條件下，每個循環(huán)溫度升高0.5℃，維持20 s，共71循環(huán)。取10μl PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，驗證PCR產(chǎn)物。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

各實驗重復(fù)三次，使用SPSS18.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用Bonferroni Test。P≤0.05則認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨評分結(jié)果

A組關(guān)節(jié)軟骨表面整齊，無裂紋、缺損、軟化，無骨贅形成，評分為0分。B組為手術(shù)組，表面可見龜裂、蟲蝕樣變，纖維束狀改變易見，動物的軟骨廣泛軟化缺損，外露軟骨下骨伴有邊緣明顯骨贅，評分為3.8分。給藥后C組、D組、E組的兔手術(shù)側(cè)關(guān)節(jié)軟骨表面較平滑，纖維束狀改變縮小并偶見，可見細小裂紋，軟骨磨損程度與模型對照組比較，可見明顯減輕，軟骨邊緣骨贅增生減輕，C組評分為3.1分，D組評分為2.5分，E組評分為1.8分，數(shù)據(jù)對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2所示。模型組及小劑量聯(lián)合治療組、大劑量聯(lián)合治療組病理切片HE染色與評分結(jié)果一致，如圖2所示。

表2 兔骨關(guān)節(jié)炎模型各組膝關(guān)節(jié)軟骨評分結(jié)果

2.2 對HE染色的病理影響

A組關(guān)節(jié)軟骨病理顯示，表面及邊緣均整齊排列，無裂紋、缺損、軟化，無骨贅形成。模型組（B組、C組、D組、E組）的關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙不平，無彈性，明顯纖維束狀改變及邊緣骨贅形成，伴有龜裂、軟骨軟化、缺損，部分軟骨下骨外露。高劑量治療組關(guān)節(jié)軟骨呈黃白色，表面部分失去正常光澤，較平滑，可見小纖維束狀改變，細小裂紋，軟骨磨損較模型對照組明顯減輕，軟骨邊緣骨贅增生程度明顯較模型對照組輕，比中低劑量的作用都好。見圖2。

圖1 藥物對兔膝關(guān)節(jié)軟骨的影響

圖2 不同劑量組藥物作用下病理切片HE染色對比

2.3 藥物對兔膝關(guān)節(jié)液中NO、IL-1β的含量影響

通過與A組空白對照組與B組模型對照組NO、IL-1β均值比較，可以得出A組［NO：（5.97±0.9）ng／L、IL-1β：（7.03±0.8）ng／L］含量低于B組［（NO：（13.21±1.2）ng／L，IL-1β：（15.43±1.4）ng／L］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)不同劑量藥物治療后的各組，尤其是高劑量給藥組的NO、IL-1β［NO：（7.32±0.6）ng／L，IL-1β：（8.43±0.4）ng／L］含量均有下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。提示隨著藥物劑量的增加關(guān)節(jié)液中NO、IL-1β含量進一步降低。見圖3和表3、表4。

圖3 藥物對兔膝關(guān)節(jié)液中NO、IL-1β的含量影響

表3 ELISA檢測兔骨關(guān)節(jié)炎模型各組的關(guān)節(jié)液中IL-1β含量（±s，n＝8）

表3 ELISA檢測兔骨關(guān)節(jié)炎模型各組的關(guān)節(jié)液中IL-1β含量（±s，n＝8）

組別 n IL-1β含量（ng／L）A 8 7.03±0.8 B 8 15.43±1.4 C 8 12.47±0.5 D 8 10.49±0.3 E 8 8.43±0.4

表4 兔骨關(guān)節(jié)炎模型各組的關(guān)節(jié)液中NO含量（±s，n＝8）

表4 兔骨關(guān)節(jié)炎模型各組的關(guān)節(jié)液中NO含量（±s，n＝8）

組別 n NO含量（ng／L）A 8 5.94±0.9 B 8 13.21±1.2 C 8 10.01±0.5 D 8 8.95±0.4 E 8 7.32±0.6

2.4 藥物對MMP-3，MMP-13的蛋白的表達影響

MMP-3，MMP-13在B組模型中高度表達，給藥后均有所下調(diào)，高濃度用藥后的效果最佳。見圖4和表5、表6。

表5 兔骨關(guān)節(jié)炎模型各組的MMP-3的WB灰度比值

表6 兔骨關(guān)節(jié)炎模型各組的MMP-13的WB灰度比值

圖4 藥物對MMP-3，MMP-13的蛋白的表達影響

2.5 藥物對TIMP-1的mRNA表達影響

應(yīng)用PCR方法檢測抑制物TIMP-1mRNA的表達，并對比各組動物之間的差異。與模型組（0.31±0.00）ng／μl相比，聯(lián)合用藥后的各組動物組織TIMP-1［低劑量為（0.42±0.01）ng／μl，中劑量為（0.55±0.02）ng／μl，高劑量為（0.73±0.01）ng／μl］的表達明顯減少。表達量的減少與濃度增加有關(guān)。見圖5和表7。

圖5 藥物對TIMP-1的mRNA表達影響

表7 RT-PCR檢測兔骨關(guān)節(jié)炎模型各組的TIMP-1的mRNA水平的表達

3 討 論

研究證實，骨關(guān)節(jié)炎病變部位的軟骨細胞和滑膜細胞都高表達基質(zhì)金屬蛋白酶系MMPs。MMPs主要是在軟骨降解過程中起作用，大部分軟骨細胞外基質(zhì)都被MMPs水解，導(dǎo)致軟骨細胞外基質(zhì)降解［8-10］。而基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMPs）阻斷細胞外基質(zhì)的降解，是最重要的MMPs生理性抑制劑［11-12］。TIMPs同時還能間接地影響細胞信號的傳遞［13］。TIMPs與MMPs按1∶1的比例結(jié)合，TIMPs氨基末端結(jié)合MMPs后，產(chǎn)生位阻效應(yīng)，抑制MMPs的活性，阻斷MMPs對軟骨基質(zhì)的降解活性，減少骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展［14-15］。綜上所述，MMPs及抑制物TIMPs調(diào)控軟骨基質(zhì)的降解過程［16-18］。生理狀態(tài)下，MMPs與TIMPs按1∶1的比例結(jié)合通過位阻效應(yīng)減少骨軟骨基質(zhì)的降解；病理狀態(tài)下，如本研究的OA動物模型所示，MMPs水平明顯增高導(dǎo)致MMPs-TIMPs失去了動態(tài)平衡。在力學(xué)負荷和局部炎性因子分泌等共同作用下，軟骨基質(zhì)中的II型膠原被降解，破壞了軟骨組織關(guān)鍵性拱形纖維結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細胞外基質(zhì)不完整并失去彈性，降低了正常的包埋和篩濾作用。最終軟骨細胞裸露于軟骨基質(zhì)外，在炎性因子和MMPs的作用下，軟骨中基質(zhì)成分游離，蛋白多糖、軟骨膠原持續(xù)被破壞，最終出現(xiàn)軟骨降解和破壞，臨床表現(xiàn)為骨關(guān)節(jié)炎［19-20］。

本實驗通過建模，模擬了骨關(guān)節(jié)炎的病變發(fā)生發(fā)展，通過對模型進行了聯(lián)合藥物治療，探討了不同藥物濃度的作用，證明聯(lián)合用藥能延緩OA進程，起到很好的治療作用。本研究從臨床評分、免疫組化、細胞因子的蛋白表達及RNA水平表達等四個層面，驗證了雙氯芬酸聯(lián)合不同濃度乙酰水楊酸的治療效果。我們的研究證實，通過兩種藥物聯(lián)合治療，能夠降低骨關(guān)節(jié)炎的臨床評分，降低MMP-3，MMP-13的蛋白表達下調(diào)，上調(diào)TIMP-1的mRNA表達。由此我們推斷聯(lián)合用藥能夠恢復(fù)軟骨基質(zhì)的合成和降解之間的相對平衡，逆轉(zhuǎn)關(guān)節(jié)軟骨的降解破壞過程。

綜上所述，乙酰水楊酸聯(lián)合雙氯芬酸逆轉(zhuǎn)了關(guān)節(jié)軟骨降解，從而對骨關(guān)節(jié)炎臨床進程起到重要的延緩作用。不同濃度的聯(lián)合用藥，均取得良好的治療效果。