固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法測定魚肉中土臭味素和2-甲基異莰醇*

張艷紅 李德祥 張鳳枰① 鄒昌健

(1. 四川威爾檢測技術(shù)股份有限公司 四川 成都 610041；2. 通威股份有限公司水產(chǎn)畜禽營養(yǎng)與健康養(yǎng)殖農(nóng)業(yè)農(nóng)村部重點實驗室 四川 成都 610093；3. 通威股份有限公司水產(chǎn)健康養(yǎng)殖四川省重點實驗室 四川 成都 610093)

水產(chǎn)品是人類食品中優(yōu)質(zhì)動物蛋白的主要來源之一。我國是水產(chǎn)養(yǎng)殖第一大國，2019 年全國水產(chǎn)品總產(chǎn)量為6450 萬t，其中，養(yǎng)殖產(chǎn)量為5050 萬t。然而，部分養(yǎng)殖水產(chǎn)品的土腥味令消費者很難接受，是困擾水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)已久的問題，直接影響到水產(chǎn)品的消費和養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益。據(jù)研究，土臭味素(geosmin,GSM)和2-甲基異莰醇(2-methylisoborneol, 2-MIB)是易引起水產(chǎn)品肉質(zhì)產(chǎn)生土腥味最常見的2 種化合物，是放線菌(Actinomycetes)、藍(lán)藻(Cyanobacteria)、細(xì)菌(Bacteria)和真菌(Fungi)等微生物的次級代謝產(chǎn)物在萜烯合成酶的作用下產(chǎn)生的，參與這些生物合成的酶和基因最早是在鏈霉菌(Streptomyces)上發(fā)現(xiàn)的，后來也在藍(lán)藻中發(fā)現(xiàn)(Caneet al, 2006; Dickschatet al,2007; Ludwiget al, 2007)。研究表明，人體對土臭味素和2-甲基異莰醇的嗅覺閾值分別為0.9 和0.6 μg/kg(Robertsonet al,2005; Persson, 1980)；水體中4～10 ng/L的土臭味素和9～42 ng/L 的2-甲基異莰醇就能使水體及水產(chǎn)品產(chǎn)生異味；當(dāng)魚肉組織中的這2 種化合物濃度超過0.7 μg/kg 時，就不再適合零售(徐立蒲, 2009)。國內(nèi)外相關(guān)研究人員采用臭氧(薛勇, 2006; 杜國偉,2006; Schraderet al, 2010; 王國超, 2012; Zhanget al,2016)、乙酸(Lindholm-Lehtoet al, 2019)、調(diào)節(jié)水質(zhì)(Schraderet al, 2010; 王賽, 2012)和暫養(yǎng)(楊玉平,2010)等方法脫除或降低養(yǎng)殖水產(chǎn)品中的土腥味物質(zhì)。目前，有關(guān)土臭味素和2-甲基異莰醇等的測定方法主要為感官分析法(Grimmet al, 2004; Howgate,2004; Robinet al, 2006)、氣相色譜法(Howgate, 2004)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS) (陳依萍等, 2020)。GB/T 32470-2016 (張振偉等, 2016)規(guī)定了頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測定生活飲用水及其水源水中的土臭味素和2-甲基異莰醇。相關(guān)研究(張婷等,2009; 王國超等, 2011; Denget al, 2012; 周夢海,2015)報道了采用微波蒸餾－固相微萃?。瓪庀嗌V質(zhì)譜聯(lián)用法測定鯰魚(Silurus asotus)、羅非魚(Oreochromis mossambicus)肌肉中的土臭味素和2-甲基異莰醇。Ruan 等(2013)采用攪拌棒吸收萃取-熱脫附-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(SBSE-TD-GC-MS)測定大西洋鮭(Salmo salar)肌肉中的土臭味素和2-甲基異莰醇含量，土臭味素加標(biāo)回收率達(dá)93%～96%，但2-甲基異莰醇加標(biāo)回收率僅為23%～30%，不滿足檢測需求。為準(zhǔn)確測定水產(chǎn)品中的土臭味素和2-甲基異莰醇含量，本研究采用頂空固相微萃取法(headspace solid-phase microextraction, HS-SPME)提取魚肉中的土腥味物質(zhì)，以順式-十氫-1-萘酚為內(nèi)標(biāo)、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行定性和定量測定，旨在建立魚肉中土臭味素和2-甲基異莰醇的檢測方法，為養(yǎng)殖水產(chǎn)品異味物質(zhì)脫除提供檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和材料

7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，G1701EA質(zhì)譜工作站：Agilent公司，美國；T10 均質(zhì)儀，IKA公司，德國；SPME手柄、65 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，Sigma-Aldrich公司，美國；DF-Ⅱ集熱式磁力加熱攪拌器，江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠；40 mL頂空瓶，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；LD6100-1 電子天平，沈陽龍騰電子有限公司。

100 μg/mL 土臭味素和2-甲基異莰醇混和標(biāo)準(zhǔn)溶液，順式-十氫-1-萘酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：Sigma-Aldrich公司，美國；甲醇：色譜純；水為Milli-Q Gradient去離子水。

肌肉樣品：鯽魚(Carassius auratus)、烏魚(Channa argus)、羅非魚、草魚(Ctenopharyngodon idellus)、斑點叉尾(Ictalurus punctatus)、花鰱(Aristichthys nobilis)、鯉魚(Cypriniformesspp) 和武昌魚(Megalobrama amblycephala)，在四川省成都白家水產(chǎn)品批發(fā)市場購買，隨機(jī)取10 尾，均為健康鮮活個體，樣品采集后立即裝袋、充氧，0.5 h 后運送到實驗室，致死后取肌肉部分，去皮后切成2～3 cm 肉片，用均質(zhì)儀打成肉糜，置于密封袋中，并于-80℃超低溫冰箱中冷凍保存，分析時取出流水解凍后使用。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 準(zhǔn)確稱取樣品10 g (精確至0.1 g)于40 mL 頂空瓶中，加入1 μg/mL 順式-十氫-1-萘酚溶液10 μL 作為內(nèi)標(biāo)，加入10 mL 去離子水，用均質(zhì)器均質(zhì)3 min，將樣品完全破碎，放入微型攪拌子，備用。

1.2.2 頂空固相微萃取提取土臭味素和2-甲基異莰醇 萃取頭老化：第一次使用DVB/CAR/PDMS 萃取頭時，需置于氣相色譜進(jìn)樣口250℃下老化2 h (氮氣保護(hù)下)；之后使用時，需在250℃下處理30 min，以確保脫去可能吸附的揮發(fā)性成分。

SPME 提?。簩⒀b有樣品的頂空瓶置于磁力攪拌臺上，于60℃水浴中平衡10 min，將SPME 針管插入頂空瓶中(含65 μm/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭，使用前于250℃下處理30 min，以確保脫去可能吸附的揮發(fā)性成分)，固定萃取頭在頂空瓶中的位置，攪拌速度為1000 r/min 左右，頂空萃取30 min 后取出，迅速插入氣相色譜儀的進(jìn)樣口，解吸5 min，使SPME纖維頭涂膜吸附的揮發(fā)性成分在高溫下迅速熱解吸，即可通過GC-MS 進(jìn)行分析鑒定。

1.2.3 土臭味素和2-甲基異莰醇標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

0.1 μg/mL 土臭味素和2-甲基異莰醇混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確移取100 μL 100 μg/mL 土臭味素和2-甲基異莰醇混合標(biāo)準(zhǔn)溶于100 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋、定容，搖勻，備用。

1 μg/mL 順式-十氫-1-萘酚內(nèi)標(biāo)儲備液：準(zhǔn)確稱取順式-十氫-1-萘酚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10 mg 于1000 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋、定容，搖勻，備用。

土臭味素和2-甲基異莰醇混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液：稱取10 g 去離子水于40 mL 頂空瓶中，加入10 mL 去離子水，分別加入10、20、50、100、200 和1000 μL 0.1μg/mL 土臭味素和2-甲基異莰醇混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，10 μL 1 μg/mL 順式-十氫-1-萘酚內(nèi)標(biāo)儲備溶液，搖勻，得到濃度分別為0.1、0.2、0.5、1、2 和10 μg/L土臭味素和2-甲基異莰醇系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.4 儀器工作條件 色譜柱：HP-5 ms 彈性毛細(xì)管柱(30.00 m × 0.25 mm × 0.25 μm)；程序升溫：柱初溫60℃，保持4 min，然后以8.5℃/min 升至200℃，保持15 min，以20℃/min 升至250℃，保持2 min；進(jìn)樣口溫度250℃；載氣：He，流量1.0 mL/min；解吸溫度250℃，解吸時間5 min，不分流模式進(jìn)樣。

傳輸線溫度260℃；離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電子能量70 eV。掃描方式：SIM 選擇性離子掃描；土臭味素掃描離子為125、112 和97；2-甲基異莰醇的掃描離子為135、108 和95；順式-十氫-1-萘酚的掃描離子為136、94 和121。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制和樣品分析 按照上述色譜質(zhì)譜條件和方法，進(jìn)行GC-MS 分析，以標(biāo)準(zhǔn)液中被測組分的峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)液中被測組分的濃度和內(nèi)標(biāo)濃度的比值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。在相同條件下測定樣品，從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上求得樣品中土臭味素和2-甲基異莰醇的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法的選擇

國內(nèi)外有關(guān)土臭味素和2-甲基異莰醇的提取方法主要有微波蒸餾－固相微萃取、頂空固相微萃取和攪拌棒吸收萃取-熱脫附等(張婷等, 2009; 王國超等,2011; Denget al, 2012; 周夢海, 2015; 張振偉等,2016)。微波蒸餾提取需對微波萃取功率、微波蒸餾時間和載氣氣流等參數(shù)進(jìn)行確認(rèn)，由于微波萃取所用的儀器大多為家用微波爐，不同品牌和型號的微波爐使用功率不一致，很難統(tǒng)一微波萃取功率和固化實驗條件。前期準(zhǔn)備實驗時發(fā)現(xiàn)，魚肉中含有70%～80%的水分，微波萃取時，魚肉中的水分汽化為水蒸氣，在載氣吹掃和冷凝水冷卻雙重作用下，水蒸氣在管道中冷凝下來，附著在冷凝管上，影響土臭味素和2-甲基異莰醇的收集，導(dǎo)致回收率偏低，多次實驗結(jié)果的重復(fù)性、穩(wěn)定性差。本方法選擇頂空固相微萃取提取土臭味素和2-甲基異莰醇，稱取樣品后加入等體積的超純水均質(zhì)，采用60℃頂空固相微萃取法對目標(biāo)化合物進(jìn)行提取和富集，該前處理操作簡單、易標(biāo)準(zhǔn)化，加標(biāo)回收實驗、實際樣品測定結(jié)果表明，采用該提取方法具有良好的重現(xiàn)性，可滿足魚肉中土臭味素和2-甲基異莰醇的檢測需求。

2.2 固相微萃取條件的選擇和優(yōu)化

2.2.1 萃取頭的選擇 Sung等(2005)對土臭味素和2-甲基異莰醇提取過程中萃取頭的選擇進(jìn)行了研究，分析了PDMS、PDMS/DVB、PA、CAR/PDMS、CW/DVB和DVB/CAR/PDMS等6 種不同吸附材質(zhì)對水中土腥味物質(zhì)的吸附效果。結(jié)果表明，DVB/CAR/PDMS對土臭味素和2-甲基異莰醇的萃取效果最好，實驗最終選擇DVB/CAR/PDMS作為土臭味素和2-甲基異莰醇提取的萃取頭。

2.2.2 NaCl 的選擇 固相微萃取中，一般來說，加入NaCl 將獲得較高的萃取效果，但由于魚肉樣品揮發(fā)性風(fēng)味成分較多，加入NaCl 會導(dǎo)致魚肉中多種易吸附的揮發(fā)性成分吸附于萃取頭，使萃取頭容易達(dá)到飽和，從而減少土臭味素和2-甲基異莰醇的吸附，降低土臭味素和2-甲基異莰醇的回收率，最終影響土臭味素和2-甲基異莰醇的準(zhǔn)確定量，纖維頭的壽命也會因此顯著下降，比較實驗結(jié)果見圖1。實驗最終選擇萃取過程中不添加NaCl。

圖1 未加入NaCl 和加入NaCl 總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms without/with NaCl

2.2.3 攪拌速率對萃取效果的影響 設(shè)定攪拌時間30 min，萃取溫度為60℃，考察攪拌速度分別為300、600、900、1200、1500 和2000 r/min 對萃取效果的影響，實驗結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，土臭味素和2-甲基異莰醇的回收率隨著攪拌轉(zhuǎn)速的增大而增大，當(dāng)攪拌速率達(dá)到1500 r/min 之后，回收率基本趨于穩(wěn)定。實驗最終確定攪拌速率為1500 r/min。

圖2 不同攪拌轉(zhuǎn)速對加標(biāo)回收率的影響(n=3)Fig.2 Effects of different stir speeds on recovery rate (n=3)

2.2.4 萃取時間 實驗以65 μm DVB/CAR/PDMS為實驗用萃取頭。萃取溫度均設(shè)置為60℃，平衡10 min后，吸附時間選取20、30 和40 min，考察土臭味素和2-甲基異莰醇的加標(biāo)回收率，結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，30 和40 min 吸附時間的回收率明顯高于20min，30 和40 min 的回收率相接近。綜合比較，萃取時間30 min 為最佳。

圖3 不同萃取時間對加標(biāo)回收率的影響(n=3)Fig.3 Effects of different extraction time on recovery rate (n=3)

2.2.5 萃取溫度 萃取溫度對萃取結(jié)果有兩方面影響，一方面溫度升高有利于土臭味素和2-甲基異莰醇的揮發(fā)，增加吸附量；另一方面，溫度升高時，其余干擾物質(zhì)吸附增加，從而減少目標(biāo)化合物吸附量。選取萃取時間為30 min，設(shè)置40℃、60℃和80℃對實驗結(jié)果的影響，以考察土臭味素和2-甲基異莰醇的加標(biāo)回收率，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，萃取溫度為60℃時，加標(biāo)回收率最高。

圖4 不同萃取溫度對加標(biāo)回收率的影響(n=3)Fig.4 Effects of different extraction temperature on recovery rate (n=3)

2.3 定量方法的選擇

由于土臭味素和2-甲基異莰醇為半揮發(fā)性物質(zhì)，不穩(wěn)定，易損失。本研究采用外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法(順式-十氫-1-萘酚)開展加標(biāo)回收實驗，結(jié)果見圖5。結(jié)果顯示，外標(biāo)法的回收率在40.6%～46.7%之間，內(nèi)標(biāo)法回收率在70.6%～72.3%之間，內(nèi)標(biāo)法的回收率明顯高于外標(biāo)法。因此，選擇內(nèi)標(biāo)法作為魚肉中土臭味素和2-甲基異莰醇含量的測定方法。

圖5 外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法對加標(biāo)回收率的影響(n=3)Fig.5 Effects of external standard method and internal standard method on recovery rate (n=3)

實驗選用了2-異丁基-3-甲氧吡嗪和順式-十氫-1-萘酚2種與目標(biāo)化合物化學(xué)性質(zhì)相似、沸點相近的內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行加標(biāo)回收實驗。結(jié)果顯示，用順式-十氫-1-萘酚作為內(nèi)標(biāo)物，土臭味素和2-甲基異莰醇回收率分別為71.2%和69.1%；而用2-異丁基-3-甲氧吡嗪作為內(nèi)標(biāo)物，土臭味素和2-甲基異莰醇回收率分別為57.3%和48.9%。因此，選擇順式-十氫-1-萘酚作為內(nèi)標(biāo)物。

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

土臭味素和2-甲基異莰醇混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 和10.0 μg/L，順式-十氫-1-萘酚(內(nèi)標(biāo))的濃度均為1 μg/L 時進(jìn)樣測定。以標(biāo)準(zhǔn)液中被測組分的峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)液中被測組分的濃度和內(nèi)標(biāo)濃度的比值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，并分別計算、驗證最低檢出濃度(S/N=3.0，P/P)、最低定量濃度(S/N=10.0，P/P)。土臭味素和2-甲基異莰醇GC-MS 總離子流圖見圖6，線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限等結(jié)果見表1。

表1 土臭味素和2-甲基異莰醇的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Tab.1 Regression equations, correlation coefficients (r2), detection limits and quantification limits for geosmin and 2-methylisoborneol

圖6 土臭味素、2-甲基異莰醇和順式-十氫-1-萘酚(內(nèi)標(biāo))標(biāo)準(zhǔn)液總離子流圖(5.0 ng/mL)Fig.6 Total ion chromatogram of 5.0 ng/mL geosmin, 2-methylisoborneol and cis-decahydro-1-naphthol standard solution

2.5 精密度實驗

表2 精密度實驗結(jié)果Tab.2 Results of precision test

2.6 回收率實驗

對鯽魚和羅非魚進(jìn)行加標(biāo)實驗，并計算回收率，結(jié)果見表3。從表3 可以看出，土臭味素的加標(biāo)回收率為68.67%～80.30%，2-甲基異莰醇的加標(biāo)回收率為62.67%～83.40%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。由此可見，該方法能較準(zhǔn)確測定魚肉中土臭味素和2-甲基異莰醇的含量。

表3 回收率實驗結(jié)果(n=3)Tab.3 Spiked recovery of different feed material samples (n=3)

2.7 實際樣品測定

為考察方法的適用性，在水產(chǎn)市場上購買鯽魚、烏魚、羅非魚、草魚、花鰱、鯉魚和武昌魚進(jìn)行土臭味素和2-甲基異莰醇測定實驗，每個樣品重復(fù)測定3 次，結(jié)果見表4，草魚實際樣品檢測總離子流圖見圖7。7 種魚類的土臭味素的含量為0.179～0.306 μg/kg，2-甲基異莰醇的含量為0.222～0.531 μg/kg。在實際樣品測定中，目標(biāo)化合物和內(nèi)標(biāo)物分離良好，無干擾峰，可滿足魚肉中土臭味素和2-甲基異莰醇的定性定量測定。

圖7 草魚樣品總離子流圖Fig.7 Total ion chromatogram of geosmin,2-methylisoborneol, and cis-decahydro-1-naphthol in extract solution of grass carp

表4 7 種實際樣品測定結(jié)果Tab.4 Quantification determination results for 7 fish muscle samples

3 結(jié)論

由于魚肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分復(fù)雜、種類繁多，風(fēng)味物質(zhì)的檢測一直備受關(guān)注。土腥味物質(zhì)作為一類影響魚肉品質(zhì)的揮發(fā)性成分，提取和吸附難度大，干擾物質(zhì)繁多，其檢測難度較大。本方法選擇頂空固相微萃取技術(shù)作為土腥味物質(zhì)的提取和富集方法，前處理方法簡單，不使用有機(jī)溶劑，不對環(huán)境造成污染。稱取魚肉樣品后加入等體積的超純水，均質(zhì)，

將魚肉中的土臭味素和2-甲基異莰醇溶解于水相中，經(jīng)頂空固相微萃取對目標(biāo)物進(jìn)行提取和富集，以順式-十氫-1-萘酚為內(nèi)標(biāo)物，通過GC-MS 定量分析，可減少檢測過程中其他風(fēng)味成分對土臭味素和2-甲基異莰醇的干擾，達(dá)到完好分離，方法精密度均小于5%，土臭味素的加標(biāo)回收率為68.67%～80.30%，2-甲基異莰醇的加標(biāo)回收率為62.67%～83.40%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，表明該方法可滿足魚肉中土臭味素和2-甲基異莰醇的定量檢測需要，可作為養(yǎng)殖水產(chǎn)品異味物質(zhì)脫除檢測方法。