飼料中蛋白水平對三疣梭子蟹雌體生長、卵巢發(fā)育和生化組成的影響*

何先林 柳梅梅 朱篩成 董志國 萬夕和 吳旭干,4,5①

(1. 上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚類營養(yǎng)和環(huán)境生態(tài)研究中心 上海 201306；2. 江蘇海洋大學(xué)海洋學(xué)院江蘇 連云港 222005；3. 江蘇省海洋水產(chǎn)研究所 江蘇 南通 226007；4. 上海海洋大學(xué) 上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心 上海 201306；5. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 上海 201306)

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)廣泛分布于東亞沿海，是我國沿海重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)蟹類。目前，在江蘇、浙江和福建等地廣泛養(yǎng)殖(環(huán)朋朋等, 2019;Donget al, 2010)，2018 年池塘養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)116 251 t(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局, 2019)。目前，我國三疣梭子蟹池塘養(yǎng)殖主要依靠大量投喂冰鮮雜魚和低值貝類等，這種投喂模式容易引起池塘水質(zhì)惡化、病害暴發(fā)，從而導(dǎo)致養(yǎng)殖效果和商品蟹品質(zhì)不穩(wěn)定，影響產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展(Wuet al, 2010)；另一方面，大量投喂冰鮮雜魚給海洋資源保護(hù)帶來了巨大壓力，導(dǎo)致漁業(yè)資源的過度捕撈和利用(Caoet al, 2015)。因此，研發(fā)高效實(shí)用的專用配合飼料勢在必行。

確定和優(yōu)化主要營養(yǎng)參數(shù)是研發(fā)配合飼料的重要前提，其中，蛋白質(zhì)是最重要的營養(yǎng)參數(shù)之一，是影響水產(chǎn)動物生長的關(guān)鍵營養(yǎng)成分，其對于維持水生動物生長發(fā)育和維持機(jī)體正常生命活動具有重要意義(麥康森, 2011)。飼料蛋白水平和質(zhì)量不僅直接影響?zhàn)B殖效果，而且影響飼料配方成本和養(yǎng)殖成本。當(dāng)飼料中的蛋白質(zhì)不足時，會導(dǎo)致生長減緩或停止；而攝入過高的蛋白飼料時，只有一部分用來產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)，其余的蛋白質(zhì)將轉(zhuǎn)化為能量，這將增加飼料成本和氮的排泄(Baiet al, 2016; 公緒鵬等, 2018)。有關(guān)三疣梭子蟹的蛋白營養(yǎng)研究近年來日益受到重視，Huo等(2014)養(yǎng)殖初始體重為(3.75±0.20) g的三疣梭子蟹幼蟹56 d后發(fā)現(xiàn)，飼料蛋白質(zhì)和脂類水平對軀體粗蛋白、粗脂肪、水分含量和肌肉氨基酸分布有顯著影響，51%蛋白水平和5%脂質(zhì)水平的飼料最適合三疣梭子蟹幼蟹生長。Jin等(2013)研究發(fā)現(xiàn)，初始體重為(2.50±0.08) g的三疣梭子蟹幼蟹養(yǎng)殖56 d后，飼料蛋白對增重率、飼料系數(shù)和蛋白質(zhì)效率均有顯著影響，在50.2%飼料蛋白水平下獲得最大增重率和特定生長率。這些研究主要集中于幼蟹階段，且主要在室內(nèi)循環(huán)水系統(tǒng)中養(yǎng)殖。實(shí)際上，我國三疣梭子蟹養(yǎng)殖主要在池塘養(yǎng)殖條件下進(jìn)行，且養(yǎng)殖中后期的飼料用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于養(yǎng)殖前期。迄今為止，有關(guān)三疣梭子蟹在室外池塘條件下，適宜的飼料蛋白含量研究較少。

因此，本研究在室外池塘條件下，采用不同蛋白水平的等能等脂配合飼料投喂三疣梭子蟹120 d，比較了飼料蛋白水平對三疣梭子蟹生長、卵巢發(fā)育和生化組成的影響，以期為三疣梭子蟹的配合飼料配制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)飼料配制

根據(jù)先前對三疣梭子蟹的研究(段青源等, 2011)，設(shè)計(jì)4 種不同蛋白水平的實(shí)驗(yàn)飼料，以魚粉、豆粕和菜粕等為主要蛋白源，以魚油、豬油和豆油為主要脂肪源，使用面粉和纖維素調(diào)節(jié)飼料總能水平，使4 組飼料中的粗蛋白水平不同，但總脂和總能水平基本一致，分別記為飼料1～4。飼料配制前，所有飼料原料均粉碎后過60 目篩，按照表1 的配方，利用混合機(jī)混合均勻，然后用雙螺旋小型膨化機(jī)擠壓成沉性膨化飼料(DSD30 試驗(yàn)機(jī)，濟(jì)南鼎潤機(jī)械設(shè)備有限公司)，粒徑分別為1.6 mm (養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)0～60 d 采用)和3.5 mm(養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)61～120 d 采用)。所有實(shí)驗(yàn)飼料制粒后在室溫中冷卻風(fēng)干，-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。飼料中生化成分測定方法見1.4，表2 為飼料中常規(guī)營養(yǎng)成分、能量和氨基酸含量。

表1 4 種實(shí)驗(yàn)飼料配方Tab.1 Formulations of four experimental diets /%

1.2 實(shí)驗(yàn)用蟹的養(yǎng)殖管理

實(shí)驗(yàn)用蟹為江蘇南通協(xié)通水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司的池塘養(yǎng)殖三疣梭子蟹幼蟹，挑選四肢健全、活力較好的幼蟹用于實(shí)驗(yàn)，雌體平均體重為(10.98±0.28)g，雄體平均體重為(10.66±0.42) g。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在四周為水泥、池底為泥土的室外土池(長×寬×深=14 m×11 m×1.5 m)中進(jìn)行，每個池塘放雌蟹120 只，雄蟹60 只。因雌蟹經(jīng)濟(jì)效益較高，主要養(yǎng)殖雌體。雄蟹主要用于交配后促進(jìn)雌體卵巢發(fā)育，以提供卵巢發(fā)育良好的膏蟹。實(shí)驗(yàn)分4 個飼料組，每組設(shè)置3 個重復(fù)池塘。

養(yǎng)殖期間，每日08:00 和16:00 投喂飼料，上午的投喂比例(投喂量占1 d 總投喂量的比例)約為30%，下午的投喂比例約為70%，日投喂量占蟹總體重的3%～5%。具體投喂量根據(jù)水溫、天氣和殘餌情況適當(dāng)調(diào)整。養(yǎng)殖期間，每3 d 測定1 次水質(zhì)指標(biāo)，根據(jù)水質(zhì)情況，每次更換總水體1/3 的水，養(yǎng)殖過程中水質(zhì)指標(biāo)維持在 pH 7.0～9.0，溶氧＞4 mg/L，氨氮濃度＜0.5mg/L，亞硝酸鹽濃度＜0.15 mg/L。此外，養(yǎng)殖期間每15 d 進(jìn)行1 次全池潑灑碘消毒制劑和微生態(tài)制劑(北京水世紀(jì)生物技術(shù)有限公司)，以保持良好的水質(zhì)。每天根據(jù)溶解氧情況適時開啟增氧機(jī)增氧。實(shí)驗(yàn)于7 月下旬開始，到11 月下旬結(jié)束實(shí)驗(yàn)，整個養(yǎng)殖周期共4 個月。

1.3 樣品采集和解剖

實(shí)驗(yàn)過程中，每40 d 打樣稱重1 次，每個池塘隨機(jī)采集10 只左右雌體，精確稱重后，用于計(jì)算平均體重、增重率(weight gain rate, WGR)和特定增長率(specific growth rate, SGR)。

各指標(biāo)計(jì)算公式如下：

式中，Wt和Wt-1分別為實(shí)驗(yàn)第t次打樣的平均體重(g)和第t-1 打樣的平均體重(g)；d為養(yǎng)殖天數(shù)，即每次打樣時間差。

采集養(yǎng)殖120 d 的樣品用于組織系數(shù)和生化組成測定。采樣前停食1 d，隨機(jī)從每口池塘采集4 只生殖蛻殼后的雌蟹，用毛巾擦干體表水分后用電子天平(精確度為 0.01 g)稱重，用游標(biāo)卡尺(精確度為0.02mm)測量甲殼長和甲殼寬，然后進(jìn)行活體解剖。取出每只雌蟹的肝胰腺和卵巢，精確稱重后分別計(jì)算卵巢指數(shù)(gonadosomatic index, GSI)和肝胰腺指數(shù)(hepatosomatic index, HSI)。最后刮出腹部和步足中的所有肌肉，計(jì)算出肉率(meat yield, MY)。采用公式計(jì)算總可食率(total edible yield, TEY)和肥滿度(condition factor, CF)。所有的肝胰腺、卵巢和肌肉分別裝入自封袋后，保存于-40℃冰箱中用于后續(xù)測定。各指標(biāo)計(jì)算公式如下：

式中，Wg為終末性腺質(zhì)量(g)，Wh為終末肝胰腺質(zhì)量(g)，Wm為終末肌肉質(zhì)量(g)，W為三疣梭子蟹體質(zhì)量(g)，L為甲殼長(cm)。

1.4 生化成分分析

將每個池塘采集的2個雌體卵巢、肝胰腺和肌肉分別合并，采用冷凍干燥法凍干48 h，測定三疣梭子蟹組織中的水分含量后用于后續(xù)生化分析。采用凱氏定氮法測定樣品的粗蛋白含量(AOAC, 1995)。參考Folch等(1957)的方法，使用氯仿∶甲醇(V/V=2∶1)法測定樣品中的總脂含量。采用550℃灼燒法測定樣品中的灰分含量(AOAC, 1995)。采用苯酚-硫酸法測定樣品的總碳水化合物含量(AOAC, 1995)。采用鹽酸水解法測定樣品的總氨基酸組成(Blackburnet al,1984)，色氨酸測定采用堿性水解法(Chenet al, 2007)，含硫氨基酸測定采用過氧甲酸水解法(Spindleret al,1985)，水解后的樣品均在氨基酸自動分析儀(S-433D，Sykam公司，德國)上進(jìn)行定性和定量分析。飼料中水分含量測定參照AOAC的標(biāo)準(zhǔn)方法，而其他生化成分的分析均與組織中生化成分測定的方法相同。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，采用SPSS 22.0 軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用Levene 法對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)。當(dāng)不滿足齊性方差時，對百分比數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦或平方根處理。采用ANOVA 對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，采用Duncan 氏法進(jìn)行多重比較，取P<0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料蛋白水平對三疣梭子蟹雌體生長、卵巢發(fā)育和可食率的影響

飼料蛋白水平對三疣梭子蟹雌體生長的影響見圖1。整個養(yǎng)殖周期中，飼料中蛋白水平對三疣梭子蟹雌體的體重、增重率和特定生長率均無顯著影響。隨著養(yǎng)殖的延長，在養(yǎng)殖80 d 時，飼料2組的體重顯著低于其他組(P＜0.05)；各組三疣梭子蟹的增重率和特定增長率均呈下降趨勢，其中，41～80 d 期間，飼料2組的增重率最低(P＜0.05)，而在81～120 d 期間，飼料1組的增重率最低(P＜0.05)。特定生長率表現(xiàn)出相似的變化規(guī)律。

圖1 飼料蛋白水平對三疣梭子蟹雌體生長影響Fig.1 Effects of dietary protein levels on growth of female P. trituberculatus

飼料蛋白水平對三疣梭子蟹雌體卵巢發(fā)育、可食率和肥滿度的影響數(shù)據(jù)如表3 所示。飼料蛋白水平對三疣梭子蟹的卵巢指數(shù)及可食率有顯著影響，飼料3 組和4 組的卵巢指數(shù)顯著高于1 組和2 組(P＜0.05)，3 組總可食率顯著高于2 組(P＜0.05)，與其他兩組無顯著差異(P＞0.05)；其他指標(biāo)無顯著差異(P＞0.05)。以卵巢指數(shù)為參考指標(biāo)，通過雙折線回歸，y=0.2331x-5.1911，y=-0.557 6x+26.564 得出，在飼料蛋白水平為40.16%時，三疣梭子蟹雌體卵巢指數(shù)達(dá)到最大(圖2)。

圖2 飼料中不同蛋白對三疣梭子蟹雌體卵巢指數(shù)的折線模型分析Fig.2 Broken-line model analysis of the relationship of gonadosomatic index with dietary protein levels of female adult P. trituberculatus

表3 飼料蛋白水平對三疣梭子蟹雌體卵巢發(fā)育和可食率的影響(Mean±SD, n=3)Tab.3 Effects of dietary protein levels on ovarian development and edible yield of female P. trituberculatus (Mean±SD, n=3)

2.2 飼料蛋白水平對三疣梭子蟹雌體組織中常規(guī)生化組成的影響

飼料蛋白水平對三疣梭子蟹組織的常規(guī)生化組成的影響如表4所示。就水分而言，飼料1組的卵巢中含量最高(P＜0.05)，飼料2組的肝胰腺中含量最高(P＜0.05)，而肌肉中無顯著變化(P＞0.05)。就粗蛋白而言，飼料4組的卵巢中含量最高(P＜0.05)，肝胰腺中飼料3組和4組顯著高于飼料1組和2組(P＜0.05)，肌肉中的粗蛋白的含量則是飼料1組和3顯著高于另外兩組(P＜0.05)。就總脂而言，卵巢中的含量隨著蛋白水平的增加呈上升趨勢(P＜0.05)，而肝胰腺和肌肉中的含量均在飼料1組中最高，飼料2組中最低(P＜0.05)。就總碳水化合物而言，卵巢和肝胰腺中的含量均在飼料3組中最高(P＞0.05)，肌肉中的含量在飼料1組最高(P＜0.05)。

表4 飼料蛋白水平對三疣梭子蟹雌體組織中常規(guī)生化組成的影響(%濕重, Mean±SD, n=3)Tab.4 Effects of dietary protein levels on proximate omposition of female adult P. trituberculatus(% wet weight, Mean±SD, n=3)

2.3 飼料蛋白水平對三疣梭子蟹雌體肌肉中氨基酸組成的影響

飼料蛋白水平對三疣梭子蟹肌肉的氨基酸組成的影響如表5 所示。肌肉中檢測出18 種氨基酸，其中人體必需氨基酸(EAA)10 種；賴氨酸和亮氨酸含量相對較高(＞9 mg/g)，蘇氨酸和纈氨酸含量相對較低(＜2 mg/g)，其中，飼料1 組和飼料3 組中的異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸和酪氨酸含量顯著高于2 組和4 組(P＜0.05)；非必需氨基酸(NEAA)中，除絲氨酸和組氨酸含量相對較低(＜5 mg/g)，其余含量均大于8mg/g。整體上，飼料1 組和飼料3 組三疣梭子蟹肌肉中的總必需氨基酸(∑EAA)和總的非必需氨基酸(∑NEAA)含量顯著高于飼料 2 組和飼料 4 組(P＜0.05)。

表5 飼料蛋白水平對三疣梭子蟹雌體肌肉中氨基酸組成的影響(%濕重, Mean±SD, n=3)Tab.5 Effects of dietary protein level on amino acid composition in muscle of female adult P. trituberculatus(% wet weight, Mean±SD, n=3)

3 討論

3.1 飼料蛋白水平對三疣梭子蟹雌體生長和卵巢發(fā)育的影響

蛋白質(zhì)是動物體的主要組成物質(zhì)之一，對其生長發(fā)育至關(guān)重要(Resources, 2011)。本研究表明，室外池塘養(yǎng)殖條件下，飼料中蛋白水平對雌體生長無顯著影響，可能原因有：(1)池塘低密度養(yǎng)殖條件下(最終0.1～0.3只/m2)，飼料中32%的蛋白水平可以滿足其正常生長需求；(2)飼料1組和2組三疣梭子蟹雌體可能通過攝食更多的餌料來滿足其生長發(fā)育對蛋白質(zhì)和氨基酸的需求。卵巢是三疣梭子蟹雌體重要的可食部位之一，卵巢發(fā)育好壞直接影響三疣梭子蟹膏蟹的營養(yǎng)品質(zhì)、經(jīng)濟(jì)價值和生殖性能(Wuet al, 2010; 吳旭干等, 2014)。甲殼動物的卵巢發(fā)育過程主要是在卵母細(xì)胞中大量積累卵黃磷蛋白和脂滴(Yanget al, 2005)，而卵黃磷蛋白主要由卵黃蛋白原、磷脂和類胡蘿卜素等組成(Cocciaet al, 2010)。本研究中，飼料3組(蛋白含量為39.59%)三疣梭子蟹雌體的卵巢指數(shù)顯著高于飼料1組和2組，這暗示飼料中較高的蛋白含量可以促進(jìn)其卵黃磷蛋白的合成，進(jìn)而促進(jìn)卵巢發(fā)育和提高卵巢指數(shù)。這與紅螯螯蝦(Cherax quadricarinatus)的研究結(jié)果類似(Rodríguez-Gonzálezet al, 2009)。先前有研究在自然海區(qū)單個體籠養(yǎng)條件下，基于雌體生長、蛋白質(zhì)效率、肥滿度、卵巢中色素沉積和肌肉及卵巢中的常規(guī)生化組成等指標(biāo)評價三疣梭子蟹雌體飼料中的適宜蛋白質(zhì)和脂肪含量及其交互作用，研究表明，三疣梭子蟹雌體生長后期和育肥飼料中適宜蛋白水平為41.52% (段青源等, 2011)，略高于本研究的結(jié)論(40.16%)?？赡苁且?yàn)楸狙芯繉?shí)驗(yàn)飼料的粗脂肪水平(15%)顯著高于該研究(7%～11%)，適當(dāng)提高飼料中的粗脂肪水平可以節(jié)約甲殼動物飼料中蛋白質(zhì)，從而降低其蛋白需求(Catacutan, 2002)。

先前在室內(nèi)養(yǎng)殖條件下的研究表明，三疣梭子蟹幼蟹(體重為2.50～42.90 g)飼料中的蛋白需求為45%左右(丁雪燕等, 2003)，顯著高于三疣梭子蟹雌體育肥飼料的適宜蛋白水平(40%左右)。由此可見，三疣梭子蟹在生長和卵巢發(fā)育期間的營養(yǎng)需求存在較大差異。通常認(rèn)為，三疣梭子蟹幼蟹階段需要高蛋白和低脂肪的飼料(Jinet al, 2015)，而卵巢發(fā)育階段需要高脂肪和中等蛋白的飼料來滿足其正常卵巢發(fā)育(Dinget al, 2017)。

3.2 飼料蛋白水平對三疣梭子蟹雌體生化組成的影響

可食組織的生化組成可用于評價三疣梭子蟹的營養(yǎng)和食用價值(吳旭干等, 2014)。在本研究中，隨著飼料蛋白水平的提高，三疣梭子蟹雌體卵巢和肝胰腺中的粗蛋白含量呈顯著上升趨勢，原因可能是隨著飼料蛋白水平的提高，三疣梭子蟹攝入的蛋白質(zhì)相對更多，從而導(dǎo)致其卵巢和肝胰腺中蛋白積累的增加(Unnikrishnanet al, 2010)。隨著飼料蛋白水平的提高，飼料3 組和飼料4 組雌蟹卵巢中的總脂含量顯著增加，這可能與這兩組雌體卵巢指數(shù)較高有關(guān)。通常卵巢指數(shù)較高的蟹類，其卵巢中的水分含量較低，但蛋白和脂肪含量較高(Rosaet al, 2002; 于智勇等,2007)。

3.3 飼料蛋白水平對三疣梭子蟹雌體肌肉中氨基酸組成的影響

必需氨基酸對動物生長發(fā)育非常重要，且水產(chǎn)品中的必需氨基酸含量和組成是評價蟹類營養(yǎng)品質(zhì)的重要依據(jù)(Wuet al, 2010)。根據(jù)FAO/WHO 的理想氨基酸模式，食品中必需氨基酸/總氨基酸(EAA/TAA)理想比值為0.4左右(FAO, 1985)。本研究中，4種蛋白水平飼料養(yǎng)殖的三疣梭子蟹肌肉中的必需氨基酸的含量均達(dá)到了該標(biāo)準(zhǔn)。徐善良等(2009)研究表明，三疣梭子蟹的主要限制性氨基酸分為含硫氨基酸(蛋氨酸和半胱氨酸)和異亮氨酸。本研究結(jié)果表明，這3種必需氨基酸含量均在飼料1組#和飼料3組雌體肌肉中較高。谷氨酸和天冬氨酸是2種呈鮮味的氨基酸，其含量均在飼料3組中達(dá)到最高，推測飼料3組三疣梭子蟹肌肉具有較高的營養(yǎng)品質(zhì)。

綜上所述，基于池塘養(yǎng)殖條件下三疣梭子蟹雌體的卵巢指數(shù)和生化組成變化，建議池塘養(yǎng)殖條件下三疣梭子蟹雌體育肥飼料中適宜的蛋白水平約為40.16%。