芽孢桿菌有氧發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉對(duì)大口黑鱸幼魚(yú)生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)及腸組織結(jié)構(gòu)的影響*

鐘國(guó)防 田鑫鑫 謝春元 黃旭雄,2,3 陳乃松,2,3 黃 衛(wèi) 朱站英

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 上海 201306；2. 上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚(yú)類(lèi)營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心 上海 201306；3. 上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海 201306；4. 上海希杰商貿(mào)有限公司 上海 201228；5. 湖州海皇生物科技有限公司 浙江 湖州 313105)

魚(yú)粉由于蛋白含量高、適口性好、氨基酸平衡，鈣、磷、碘、硒等含量高以及維生素種類(lèi)較多等特點(diǎn)，是水產(chǎn)飼料中不可缺少的優(yōu)質(zhì)蛋白源(姚俊鵬等,2015)，但隨著世界漁業(yè)養(yǎng)殖規(guī)模的迅速發(fā)展以及漁獲量的減少，導(dǎo)致魚(yú)粉的價(jià)格持續(xù)走高，養(yǎng)殖成本顯著提高，因此，魚(yú)粉替代蛋白源的研究一直為飼料研究的熱點(diǎn)(饒遠(yuǎn)等, 2019; 胡鵬莉等, 2019; Zhonget al,2011)。豆粕的蛋白質(zhì)含量高，氨基酸豐富，且有異黃酮等活性物質(zhì)(Kishidaet al, 2000)，是較為重要的魚(yú)粉蛋白替代原料。但普通豆粕有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，過(guò)量使用不僅會(huì)降低水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，而且會(huì)對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)造成損傷(Dunsfordet al, 1989)，導(dǎo)致其在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用比例受到限制。研究表明，豆粕經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵得到的發(fā)酵豆粕(fermented soybean meal, FSBM)可有效降解其抗?fàn)I養(yǎng)因子，并將大分子的大豆蛋白降解為小分子的蛋白、多肽及小肽等，且發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的益生菌、寡糖、乳酸、微生物和未知生長(zhǎng)因子等活性物質(zhì)能有效提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收率(Honget al, 2004;李寶圣等, 2016; 張成等, 2018)。發(fā)酵豆粕產(chǎn)品開(kāi)發(fā)，挖掘了豆粕蛋白在水產(chǎn)飼料中的應(yīng)用潛力。劉興旺等(2010)發(fā)現(xiàn)，卵形鯧鲹(Trachinotus ovatus)飼料中發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉的水平(60.8%)顯著高于普通豆粕(45.1%)。黃雄斌等(2010)發(fā)現(xiàn)，對(duì)方正鯽(Carassius auratus gibelio)，發(fā)酵豆粕能替代50%魚(yú)粉，而普通豆粕只能替代25%的魚(yú)粉。適量的發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉對(duì)魚(yú)蝦的生長(zhǎng)無(wú)不良影響(呂云云等, 2016; 劉韜等,2018; 楊景豐等, 2018)，但這些研究所用的發(fā)酵豆粕主要是以乳酸菌(Lactobacillus)為主的厭氧發(fā)酵產(chǎn)品。

發(fā)酵工藝對(duì)發(fā)酵豆粕產(chǎn)品的品質(zhì)有重要影響(吳明海等, 2018)。芽孢桿菌(Bacillus)有氧發(fā)酵工藝由于發(fā)酵條件相對(duì)苛刻，特別是發(fā)酵過(guò)程中引發(fā)的產(chǎn)物黏稠，很難持續(xù)營(yíng)造有氧環(huán)境，能全程有氧發(fā)酵的生產(chǎn)廠家很少。傳統(tǒng)的以厭氧乳酸菌為主的發(fā)酵工藝對(duì)豆粕抗?fàn)I養(yǎng)因子特別是大分子蛋白(主要是抗原蛋白)的去除能力有限，僅能去掉14%～17.88%的大分子蛋白(表1)，而本研究所用的以芽孢桿菌有氧發(fā)酵后的產(chǎn)品，分子質(zhì)量為10～30 kDa 的小分子蛋白含量達(dá)26.38%，而對(duì)大分子蛋白的去除率達(dá)54.15%，能有效提高大分子蛋白的降解能力(表1)，且發(fā)酵產(chǎn)品富含芽孢桿菌有益菌，產(chǎn)品質(zhì)量?jī)?yōu)良。目前，在水產(chǎn)上的應(yīng)用比較有限， 僅見(jiàn)虹鱒(Oncorhynchus mykiss)(Moniruzzamanet al, 2018)、凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei) (van Nguyenet al, 2018)和巖魚(yú)(Sebastes schlegeli) (Leeet al, 2016)等幾個(gè)品種，芽孢桿菌有氧發(fā)酵豆粕在大口黑鱸(Micropterus salmoides)上的應(yīng)用研究還未見(jiàn)報(bào)道。

表1 乳酸菌厭氧發(fā)酵與芽孢桿菌有氧發(fā)酵對(duì)豆粕蛋白質(zhì)的降解差異Tab.1 The difference of protein degradation on lactic acid bacteria fermented soybean meal and Bacillus aerobic fermentation of soybean meal

大口黑鱸又名加州鱸魚(yú)，是一種典型的肉食性魚(yú)類(lèi)，其對(duì)飼料中蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)需求較高(大于37%)(李二超等, 2011)。2018 年，我國(guó)大口黑鱸的產(chǎn)量達(dá)43 萬(wàn)t，其中，全程投喂配合飼料養(yǎng)殖的比例超過(guò)50%，且大口黑鱸配合飼料中魚(yú)粉含量較高，一般為50%～55%，少數(shù)產(chǎn)品甚至達(dá)到60%。因此，研究大口黑鱸飼料中魚(yú)粉的替代具有極其重要的意義。本實(shí)驗(yàn)研究芽孢桿菌有氧發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)及腸道組織結(jié)構(gòu)的影響，旨在為開(kāi)發(fā)大口黑鱸高效、綠色環(huán)保、功能性飼料提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)飼料

根據(jù)大口黑鱸的營(yíng)養(yǎng)需求，配制魚(yú)粉含量為50%的基礎(chǔ)飼料(FM)，用芽孢桿菌有氧發(fā)酵豆粕分別替代FM 組10%(FSBM10)、20%(FSBM20)、30%(FSBM30)和40%(FSBM40)的魚(yú)粉，配制5 種等氮、等能的實(shí)驗(yàn)飼料(表2)。芽孢桿菌有氧發(fā)酵豆粕(粗蛋白56.9%、粗脂肪2%)由上海希杰商貿(mào)有限公司提供，其他原料由湖州?；噬锟萍加邢薰咎峁?。原料粉碎后，過(guò)60 目篩，按飼料配方稱(chēng)重，逐級(jí)混勻，加入適量的水，混勻后過(guò)10 目篩，用制粒機(jī)制粒，烘箱熟化后于60℃烘干18 h，包裝后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表2 飼料組成和營(yíng)養(yǎng)水平(%風(fēng)干樣品)Tab.2 Composition and nutrient levels of diets (% air dry basis)

1.2 養(yǎng)殖管理

實(shí)驗(yàn)在上海海洋大學(xué)濱?；厥覂?nèi)養(yǎng)殖池網(wǎng)箱(1.0 m×1.0 m×1.2 m)中進(jìn)行。大口黑鱸幼魚(yú)苗購(gòu)自上海秦皇山漁業(yè)有限公司，幼魚(yú)運(yùn)到基地后先暫養(yǎng)14 d 并用基礎(chǔ)飼料進(jìn)行馴化。暫養(yǎng)結(jié)束挑選形態(tài)正常、體質(zhì)健康、規(guī)格均勻的450 尾魚(yú)隨機(jī)分到15 個(gè)網(wǎng)箱中。實(shí)驗(yàn)分5 組，每組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30 尾魚(yú)。每天飽食投喂2 次(07:00 和18:00)，投飼后1 h 收集殘餌。每周測(cè)定水質(zhì)指標(biāo)，養(yǎng)殖期間水溫為(29.0±3.5)℃，pH 值為8.5±0.5，溶解氧(DO)為4.0～5.0 mg/L，氨氮為0～0.03 mg/L。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)持續(xù)75 d。

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，停食24 h，每平行隨機(jī)取6 尾魚(yú)，分別測(cè)量魚(yú)體質(zhì)量與體長(zhǎng)，冰上分離內(nèi)臟與肝臟并稱(chēng)重記錄，用于計(jì)算體質(zhì)指標(biāo)。尾部抽血，放入3 個(gè)2 mL 離心管中，離心(10 min, 8000 r/min, 4℃)分離血清備用。

1.4 測(cè)定指標(biāo)和方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后撈出網(wǎng)箱中魚(yú)，計(jì)數(shù)稱(chēng)重，并計(jì)算成活率、增重率和飼料系數(shù)。計(jì)算方法如下：

存活率(survival rate, SR, %)=100×實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)尾數(shù)/實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)尾數(shù);

增重率(weight gain rate, WGR, g)=[(末體重-初始體重)/初始體重]×100%;

飼料效率(feed efficiency, FE)=(末體重-初始體重+死亡體重)/(投料量-殘餌量);

飼料營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定：水分測(cè)定采用105℃常壓干燥法，粗灰分測(cè)定采用550℃灼燒法，粗蛋白質(zhì)測(cè)定采用杜馬斯燃燒法(Etheridgeet al, 1998)，粗脂肪測(cè)定采用氯仿-甲醇法(黃凱等, 2011)。

血清中堿性磷酸酶(ALP)、白蛋白、總蛋白、球蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)采用江蘇南京建成生物工程研究所購(gòu)試劑盒測(cè)定。

1.5 腸組織切片制作及觀察

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，饑餓24 h，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取3 尾魚(yú)，冰上分離并取前腸、中腸和后腸組織各2～3 cm，生理鹽水沖洗后，用濾紙擦干表面水分后放入Bouin 氏液中，24 h 內(nèi)換用70%的酒精保存。制作切片時(shí)，組織樣本乙醇梯度脫水，二甲苯透明處理，石蠟包埋，切片(5 μm)，隨后進(jìn)行展片、烤片、H&E 染色和封片等系列工作(夏青等, 2015; 陳曉瑛等, 2018)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因子方差分析(one-way ANOVA, LSD)，若存在顯著差異，則進(jìn)行Duncan 多重比較。所有統(tǒng)計(jì)值均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，顯著水平定為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 芽孢桿菌有氧發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉對(duì)大口黑鱸幼魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響

由表3 可知，適量的芽孢桿菌有氧發(fā)酵豆粕能顯著提高大口黑鱸幼魚(yú)的增重率(P＜0.05)，且隨著發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉用量的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，10%組與對(duì)照組無(wú)顯著差異，替代量20%組的生長(zhǎng)性能最好并顯著優(yōu)于其他各實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)，但當(dāng)替代量達(dá)到40%時(shí)，增重率與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)；各實(shí)驗(yàn)組的飼料效率并無(wú)顯著差異(P＞0.05)。各實(shí)驗(yàn)組間存活率也無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

表3 芽孢桿菌有氧發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)性能的影響Tab.3 Effects of replacement of FM by FSBM on growth indices of M. salmoides

2.2 芽孢桿菌有氧發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉對(duì)大口黑鱸血清生化指標(biāo)的影響

由表4 可知，大口黑鱸血液中的白蛋白含量隨替代量的增加先上升后下降，在20%組出現(xiàn)最大值，但各組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)；實(shí)驗(yàn)組總蛋白和球蛋白的含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力隨魚(yú)粉替代量的增加而顯著升高，10%組與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)，其他各替代組顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。10%組的谷草轉(zhuǎn)氨酶活力與對(duì)照組無(wú)顯著差異，但其他各替代組顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。

表4 芽孢桿菌有氧發(fā)酵豆粕對(duì)大口黑鱸血清生化指標(biāo)的影響Tab.4 Effects of replacement of FM by FSBM on biochemical indices in serum of M. salmoides

2.3 發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉對(duì)大口黑鱸形體指標(biāo)的影響

由表5 可知，肥滿(mǎn)度隨著魚(yú)粉替代量的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，在20%替代量時(shí)出現(xiàn)最大值，但無(wú)顯著差異(P＞0.05)；肝體比隨著替代量的增加呈下降的趨勢(shì)，但各組之間無(wú)顯著差異(P＞0.05)；隨著替代量的增加，替代組臟體比出現(xiàn)下降趨勢(shì)，且當(dāng)替代量超過(guò)30%時(shí)，顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。

表5 芽孢桿菌有氧發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉對(duì)大口黑鱸形體指標(biāo)的影響Tab.5 Effects of replacement of FM by FSBM on morphometry of M. salmoides

2.4 芽孢桿菌有氧發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉對(duì)大口黑鱸腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

腸道切片形態(tài)結(jié)構(gòu)顯微觀察發(fā)現(xiàn)，前腸對(duì)照組大口鱸的腸絨毛結(jié)構(gòu)完整，發(fā)育良好，杯狀細(xì)胞較多且排列密集有序，但40%組腸絨毛密度稍有降低，有絨毛脫落；后腸組織中觀察到上皮細(xì)胞和肌肉層的分離現(xiàn)象，40%組腸絨毛的完整性降低，腸絨毛減少，杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，并且腸黏膜層與腸肌層之間的連接明顯變得疏松(圖1)。

圖1 芽孢桿菌有氧發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉對(duì)大口黑鱸腸道組織結(jié)構(gòu)的影響Fig.1 Effects of replacement of FM by FSBM on intestinal tissue structure of M. salmoides

由表6 可知，隨著發(fā)酵豆粕替代的增加，前腸的肌層厚度呈顯著下降的趨勢(shì)(P＜0.05)，各實(shí)驗(yàn)組前腸的絨毛長(zhǎng)度和絨毛寬度均顯著大于對(duì)照組(P＜0.05)。

表6 芽孢桿菌有氧發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉對(duì)大口黑鱸腸道組織結(jié)構(gòu)的影響Tab.6 Effects of replacement of FM by FSBM on intestinal tissue structure of M. salmoides

中腸肌層厚度各實(shí)驗(yàn)組顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，絨毛長(zhǎng)度除10%組顯著大于對(duì)照組外，其他各實(shí)驗(yàn)組顯著小于對(duì)照組(P＜0.05)，而絨毛寬度各組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

后腸肌層厚度20%和30%組顯著大于對(duì)照組，而其他實(shí)驗(yàn)組顯著小于對(duì)照組(P＜0.05)，30%組絨毛長(zhǎng)度顯著大于其他各組，20%和40%組絨毛長(zhǎng)度顯著小于對(duì)照組(P＜0.05)，絨毛寬度20%和30%組顯著大于對(duì)照組(P＜0.05)。

3 討論

3.1 芽孢桿菌有氧發(fā)酵豆粕對(duì)大口黑鱸幼魚(yú)生長(zhǎng)性能的影響

豆粕替代魚(yú)粉受到限制主要是因?yàn)榭範(fàn)I養(yǎng)因子對(duì)魚(yú)生長(zhǎng)的消極影響，而對(duì)豆粕抗?fàn)I養(yǎng)因子的研究推動(dòng)了發(fā)酵豆粕產(chǎn)品的快速發(fā)展。以乳酸菌厭氧發(fā)酵制得的發(fā)酵豆粕與普通豆粕相比，在魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)性能、消化吸收及對(duì)魚(yú)類(lèi)消化生理結(jié)構(gòu)的影響方面都有積極效應(yīng)。魚(yú)類(lèi)飼料中不同工藝處理后的發(fā)酵豆粕能替代16%～40%的魚(yú)粉(Barneset al, 2015; Yaghoubiet al,2016)，豆粕處理及發(fā)酵工藝的不同對(duì)抗?fàn)I養(yǎng)因子的去除能力也不一樣，芽孢桿菌有氧發(fā)酵工藝對(duì)大分子蛋白的降解能力優(yōu)于傳統(tǒng)的乳酸菌厭氧發(fā)酵(表1)，對(duì)豆粕抗?fàn)I養(yǎng)因子的處理能力有顯著提高。

發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉的潛力與發(fā)酵豆粕產(chǎn)品生產(chǎn)工藝及養(yǎng)殖對(duì)象的食性有密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)研究芽孢桿菌有氧發(fā)酵在大口黑鱸飼料中替代魚(yú)粉的潛力，養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后發(fā)現(xiàn)，20%～30%替代組均表現(xiàn)出較佳的生長(zhǎng)性能。Azarm等(2014)研究發(fā)現(xiàn)，能用乳酸菌厭氧發(fā)酵豆粕替代 40%的魚(yú)粉飼喂黑鯛(Acanthopagrus schlegeli)。Barnes等(2015)發(fā)現(xiàn)，能用乳酸菌厭氧發(fā)酵豆粕替代 35%的魚(yú)粉飼喂虹鱒(Oncorhynchus mykiss)。Zhang等(2014)研究發(fā)現(xiàn)，能用γ射線照射后的豆粕替代 16%的魚(yú)粉飼喂日本花鱸(Lateolabrax japonicus)。Kokou等(2012)研究發(fā)現(xiàn)，能用生物處理豆粕替代近40%的魚(yú)粉飼喂金頭鯛(Sparus aurata)。芽孢桿菌有氧發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉的研究目前也有相關(guān)報(bào)道，如在虹鱒、凡納濱對(duì)蝦和巖魚(yú)(Moniruzzamanet al, 2018; van Nguyenet al, 2018; Leeet al, 2016 )替代魚(yú)粉的量分別為30%、25.36%和40%。

本研究20%～30%實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組顯著提高了增重率，可能是由于發(fā)酵后大分子蛋白質(zhì)被大量分解為多肽和小肽，提高了吸收效率。游離氨基酸的吸收是逆濃度梯度的轉(zhuǎn)運(yùn)，要通過(guò)不同的Na+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)才能完成(Matthews, 1980)，且游離氨基酸在吸收時(shí)有相互競(jìng)爭(zhēng)，需要消耗較多的能量。小肽的吸收不通過(guò)水解，而是通過(guò)特殊的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，完整地進(jìn)入血液中(Jalkanenet al, 2004)。因此，小肽比游離氨基酸更有利于魚(yú)類(lèi)吸收，能提高魚(yú)類(lèi)高蛋白質(zhì)的合成效率。此外，植物蛋白替代魚(yú)粉最大的不利因素是缺乏一些必需氨基酸 (Kaderet al, 2012; Zhanget al, 2014; Joetal, 2017)，導(dǎo)致在吸收時(shí)會(huì)影響氨基酸在體內(nèi)合成蛋白質(zhì)的效率，而以小肽的形式直接吸收可能會(huì)避免這種缺陷，其具體的吸收合成過(guò)程還有待于進(jìn)一步開(kāi)展相關(guān)的生理實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。

3.2 芽孢桿菌有氧發(fā)酵豆粕對(duì)大口黑鱸幼魚(yú)血清生化指標(biāo)的影響

魚(yú)類(lèi)的血液指標(biāo)能充分反映魚(yú)體的生理和健康狀態(tài)(Maita, 2007)，生理或病理因素都會(huì)導(dǎo)致它們的變化。血清白蛋白主要反映機(jī)體營(yíng)養(yǎng)能力，而球蛋白與免疫能力相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，魚(yú)粉替代量在30%以?xún)?nèi)時(shí)，實(shí)驗(yàn)組血清白蛋白略有升高，說(shuō)明適宜的替代魚(yú)粉對(duì)機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)能力沒(méi)有影響。但替代組的球蛋白顯著高于對(duì)照組，表明替代后導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)活躍。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶是機(jī)體分布最廣、活性最強(qiáng)的轉(zhuǎn)氨酶，通常作為評(píng)估肝臟健康狀況的指示酶(Krajnovic-Ozretic, 1991)。魚(yú)類(lèi)與哺乳動(dòng)物一樣，當(dāng)組織或器官受到功能性損傷時(shí)，某些特有的細(xì)胞酶會(huì)釋放到血液里而被檢測(cè)出來(lái)(Boucket al, 1975)。正常情況下，轉(zhuǎn)氨酶主要存在于肝臟。肝功能障礙或肝細(xì)胞受損時(shí)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶會(huì)釋放到血液中，引起血清轉(zhuǎn)氨酶活性的升高(Kaplan, 1979)。實(shí)驗(yàn)組谷丙轉(zhuǎn)氨酶與谷草轉(zhuǎn)氨酶隨著替代量的增加而升高且均顯著高于對(duì)照組，表明大口黑鱸攝食替代魚(yú)粉飼料后，肝臟產(chǎn)生了應(yīng)激。養(yǎng)殖魚(yú)蝦投喂植物蛋白含量高的飼料容易出現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)性脂肪肝，主要是因?yàn)橹参锏鞍缀写罅康目範(fàn)I養(yǎng)因子(吳莉芳等, 2006; 陳曉明等, 2015)。本實(shí)驗(yàn)魚(yú)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有明顯的綠肝、花肝等病變，可能是因?yàn)橄鄬?duì)于養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)時(shí)間較短，且芽孢桿菌有氧發(fā)酵后清除了大量的抗?fàn)I養(yǎng)因子。但長(zhǎng)期應(yīng)激是否產(chǎn)生肝功能障礙等不良影響，還有待于進(jìn)一步進(jìn)行中試驗(yàn)證。這也提示在實(shí)際生產(chǎn)時(shí)，芽孢桿菌有氧發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉的量要從生長(zhǎng)、生理及病理等多個(gè)因素綜合評(píng)測(cè)。

3.3 芽孢桿菌有氧發(fā)酵豆粕對(duì)大口黑鱸幼魚(yú)形體指標(biāo)的影響

本研究的形體指標(biāo)中實(shí)驗(yàn)組肝體比有明顯下降的趨勢(shì)，但與對(duì)照組無(wú)顯著差異，這與Kokou 等(2012)和Yaghoubi 等(2016)的研究結(jié)果相似，這可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)時(shí)間較短所致(Qiuet al, 2018)。肝體比增加與許多因素有關(guān)，如必需氨基酸低也會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖對(duì)象肝體比的增大(Espeet al, 2010)。而本研究中，肝體比沒(méi)有增加，說(shuō)明發(fā)酵豆粕中豐富的小分子量蛋白質(zhì)、小肽等可以彌補(bǔ)必需氨基酸少的缺陷。本研究20%和30%組的臟體比顯著低于對(duì)照組，這一結(jié)果要優(yōu)于王新霞(2009)的研究結(jié)果，其研究表明，加州鱸飼料中添加10%以?xún)?nèi)的發(fā)酵豆粕，能顯著降低臟體比和肝體比，降低了脂肪在體內(nèi)的沉積，從而降低脂肪肝的發(fā)生率，而本研究20%和30%組臟體比均為下降。這可能是因?yàn)楸狙芯匡暳系臓I(yíng)養(yǎng)組成中小肽含量豐富，以小肽吸收能促進(jìn)幼魚(yú)的快速生長(zhǎng)，對(duì)能量的需求加大，促使飼料中的糖類(lèi)更多地用于能量消耗，而轉(zhuǎn)化為脂肪儲(chǔ)存相對(duì)較少。這種推斷需要進(jìn)一步研究糖的代謝來(lái)證實(shí)。同時(shí)，小肽能促進(jìn)“脂質(zhì)代謝”(Drevon, 2005)，也會(huì)減少脂肪在內(nèi)臟的沉積，致使臟體比下降。

3.4 芽孢桿菌有氧發(fā)酵豆粕對(duì)大口黑鱸幼魚(yú)腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

腸道絨毛高度、密度以及杯狀細(xì)胞的數(shù)量等組織形態(tài)學(xué)指標(biāo)反映魚(yú)類(lèi)腸道的發(fā)育和健康程度，通常作為評(píng)估魚(yú)類(lèi)腸道的消化吸收能力的依據(jù)(聶國(guó)興等,2007; 王壇等, 2019)。植物蛋白替代魚(yú)粉會(huì)導(dǎo)致腸道組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。芽孢桿菌有氧發(fā)酵豆粕替代魚(yú)粉后，盡管適宜替代量(20%和30%替代)促進(jìn)了大口黑鱸的生長(zhǎng)性能，但對(duì)腸道組織形態(tài)學(xué)研究表明，40%的魚(yú)粉替代引起了前腸肌肉層厚度的下降，損害了小腸的完整性。鄭銀樺等(2015)用混合植物蛋白質(zhì)替代50%魚(yú)粉后，引起了大口黑鱸腸道肌層變薄，絨毛完整度下降等不良影響，與本研究結(jié)果相似。本實(shí)驗(yàn)切片觀察還發(fā)現(xiàn)，替代組前腸絨毛長(zhǎng)度和寬度均顯著優(yōu)于對(duì)照組，推測(cè)絨毛面積的增加促進(jìn)了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而促進(jìn)了生長(zhǎng)，這與Yamamoto 等(2010)在虹鱒中的研究結(jié)果相一致。趙柳蘭等(2018)研究認(rèn)為，大口黑鱸前腸皺襞密集而細(xì)長(zhǎng)，中性黏液細(xì)胞多，是大口黑鱸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場(chǎng)所，肌肉層厚度下降會(huì)影響前腸蠕動(dòng)的能力，對(duì)前腸物理性消化功能會(huì)產(chǎn)生不良影響，但絨毛面積增加而引起的吸收功能的提高，彌補(bǔ)了物理消化減弱這個(gè)缺陷，這也是20%和30%組生長(zhǎng)性能優(yōu)于對(duì)照組的一個(gè)極為重要的原因。同時(shí)，由于大口黑鱸為有胃魚(yú)，胃的蠕動(dòng)減少了腸道蠕動(dòng)的壓力，因此，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)過(guò)胃和前腸充分的消化吸收作用以后，中后腸結(jié)構(gòu)的變化對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收影響就相對(duì)有限。杯狀細(xì)胞分泌黏液協(xié)助消化和保護(hù)胃腸道組織免受損傷(Cerezuelaet al, 2013;Khosraviet al, 2015)。本研究表明，魚(yú)粉替代對(duì)前腸杯狀細(xì)胞沒(méi)有不良影響，但替代量達(dá)到40%時(shí)，后腸杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯減少。Bakke-McKellep 等(2007)研究發(fā)現(xiàn)，在豆粕型日糧中添加益生元和益生菌后，通過(guò)微生物的調(diào)控可以改變杯狀細(xì)胞的數(shù)量。飼料中的芽孢桿菌對(duì)虹鱒小腸的杯狀細(xì)胞的形成有促進(jìn)作用(Ramoset al, 2017)，本研究所用的發(fā)酵豆粕含有豐富的芽孢桿菌，這可能是導(dǎo)致前腸杯狀細(xì)胞不受影響的主要原因。與之相反，Khosravi 等(2015)研究認(rèn)為，大豆?jié)饪s蛋白會(huì)導(dǎo)致杯狀細(xì)胞數(shù)量的減少，可能是大豆?jié)饪s蛋白對(duì)抗?fàn)I養(yǎng)因子的去除能力有限所致。

4 結(jié)論

芽孢桿菌有氧發(fā)酵豆粕能顯著增加飼料小分子蛋白、肽類(lèi)的含量，適量替代魚(yú)粉能促進(jìn)大口黑鱸的生長(zhǎng)，且能降低臟體比。但同時(shí)引起了轉(zhuǎn)氨酶活性的升高，增加了營(yíng)養(yǎng)應(yīng)激程度，長(zhǎng)期飼喂會(huì)使生長(zhǎng)受阻。替代量太高會(huì)引起腸組織結(jié)構(gòu)的損傷，從而影響消化吸收。因此，在本研究中，綜合考慮生長(zhǎng)、形體指標(biāo)和消化道組織結(jié)構(gòu)等多方面因素，大口黑鱸飼料中芽孢桿菌有氧發(fā)酵豆粕替代20%的魚(yú)粉能達(dá)到理想的效果。