廣佛手UDP-鼠李糖合成酶基因的克隆及功能鑒定

周良云，蔡啟忠，劉長征，劉 露，張春榮，楊 全

廣佛手UDP-鼠李糖合成酶基因的克隆及功能鑒定

周良云，蔡啟忠，劉長征，劉 露，張春榮，楊 全*

廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院 國家中醫(yī)藥管理局嶺南藥材生產(chǎn)與開發(fā)重點研究室國家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系 廣州綜合試驗站，廣東 廣州 510006

對廣佛手var.中參與合成UDP-鼠李糖的UDP-鼠李糖合成酶（UDP-rhamnose synthase，RHM）基因進行全長cDNA克隆、功能鑒定及差異表達分析?；趶V佛手轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選和克隆廣佛手鼠李糖合成酶基因（）的全長cDNA，并對其進行生物信息學(xué)分析；構(gòu)建原核表達載體，通過體外酶促反應(yīng)鑒定CmRHM1的功能；利用實時熒光定量PCR分析廣佛手不同器官中基因的表達特性?；虻拈_放閱讀框（ORF）長度為2007 bp，編碼668個氨基酸。該基因編碼蛋白的相對分子質(zhì)量為75 330、理論等電點是6.97，為親水蛋白，無信號肽。多重序列比對顯示CmRHM1在序列的N-端和C-端均含有高度保守的2個結(jié)構(gòu)域（GxxGxxG/A和YxxxK）。體外酶促反應(yīng)結(jié)果表明CmRHM1蛋白具有催化UDP-Glc合成UDP-Rha的功能。實時熒光定量結(jié)果顯示該基因在廣佛手的莖、葉和果實中的表達水平依次為葉＞果實＞莖。基因的功能鑒定為UDP-鼠李糖及鼠李糖糖苷的生物合成奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

佛手；UDP-鼠李糖合成酶；UDP-鼠李糖；基因克?。还δ荑b定

UDP-鼠李糖（UDP-Rha）是合成植物細胞壁主要成分鼠李半乳糖醛酸聚糖-I（rhamnogalacturonan- I，RG-I）、鼠李半乳糖醛酸聚糖-II（rhamnogalacturonan-II，RG-II）以及各種鼠李糖糖苷類次生代謝產(chǎn)物所必需的重要組分之一[1]。RG-I、RG-II和半乳糖醛酸聚糖（homogalacturonan，HG）是植物細胞壁中主要的3種果膠多糖，它們在維管植物的生長和發(fā)育過程中承擔(dān)著重要的作用。UDP-Rha常作為糖基供體參與黃酮、三萜、酚類等受體分子的糖基化反應(yīng)，最終形成鼠李糖糖苷類次生代謝產(chǎn)物。研究顯示，鼠李糖糖苷類化合物具有抗炎[2]、抗病毒[3]、抗氧化[4]和抗癌[5]等廣泛的生理活性。在自然界中，鼠李糖至少有2種活化形式：dTDP-Rha和UDP-Rha[6-7]。dTDP-Rha主要分布在細菌中，而UDP-Rha則分布在真菌和植物中。在細菌中，dTDP-葡萄糖（dTDP-Glc）經(jīng)dTDP-葡萄糖-4, 6-脫水酶（RmlB）、dTDP-4-酮-6-脫氧--葡萄糖-3，5-差向異構(gòu)酶（RmlC）和dTDP-4-酮--鼠李糖-4-酮-還原酶（RmlD）3種酶連續(xù)催化生成dTDP-Rha[8-10]。在真菌中，由UDP-葡萄糖-4,6-脫水酶（UG4,6-Dh）和UDP-4-酮-6-脫氧-葡萄糖（UDP-4K6DG）-3,5-差向異構(gòu)酶/-4-還原酶2種酶通過連續(xù)2步催化反應(yīng)將UDP-葡糖糖（UDP-Glc）轉(zhuǎn)化生成UDP-Rha[11]。在植物中，胞漿中的UDP-Glc在UDP-鼠李糖合成酶（RHM）的作用下一步生成UDP-Rha，該酶具備UG4,6-Dh、UDP-4K6DG-3,5-差向異構(gòu)酶和UDP-4KR-4-酮-還原酶3種酶的功能[12]。目前，已從擬南芥[12]、楊樹[13]、玉米[14]等植物中克隆鑒定出相應(yīng)的RHM基因，而對藥用植物中的RHM基因研究相對較少[15]。

佛手為蕓香科柑橘屬植物佛手L. var.Swingle的干燥果實，具有疏肝理氣、和胃止痛、燥濕化痰之功效，用于治療肝胃氣滯、胸脅脹痛、胃脘痞滿、食少嘔吐、咳嗽痰多等病癥[16]。佛手主產(chǎn)于廣東、廣西、四川、福建、浙江等省，產(chǎn)于廣東和廣西的佛手稱為“廣佛手”。一般認為產(chǎn)于廣東肇慶的廣佛手質(zhì)量最優(yōu)，為道地藥材[17]。本研究基于廣佛手轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，首先克隆得到1條廣佛手RHM基因（）的全長cDNA序列，并通過原核表達獲得重組蛋白。以槲皮素為底物、UDP-Glc為糖供體，和擬南芥UGT78D1 2種粗酶混合液為催化反應(yīng)的酶進行體外酶促反應(yīng)，通過檢測槲皮素-3--鼠李糖苷的生成，以鑒定CmRHM的體外功能。其次，利用qRT-PCR檢測在廣佛手不同器官的表達水平?；虻墓δ荑b定為UDP-Rha及鼠李糖糖苷的生物合成奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

樣品采自于肇慶市德慶縣武壟鎮(zhèn)云樓村（N23°20′2″，E112°14′16″，海拔60 m)，經(jīng)廣東藥科大學(xué)楊全教授鑒定為蕓香科植物佛手L. var.Swingle，剪取莖、葉和果實3個器官用液氮速凍后置?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器

高通量冷凍研磨儀，PowerPacTMBasic 型電泳儀，Tocan240型凝膠成像儀，Nano-100型微量分光光度計，C1000 TouchTMThermal Cycler 型PCR 儀，CFX96TMOptics Module型Real-time PCR儀，Waters高效液相色譜儀。

2 方法

2.1 CmRHM的克隆

從?80 ℃冰箱中取出廣佛手樣品置入EP管中并加入磁珠，用高通量冷凍研磨儀低溫粉碎?？俁NA的提取參照RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441）說明操作。使用Takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript ? RT reagent Kit with gDNA Eraser）進行反轉(zhuǎn)錄，生成單鏈cDNA。根據(jù)從廣佛手轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選的基因序列，設(shè)計cDNA全長克隆引物（引物序列見表1）。根據(jù)KOD-Plus-Neo高保真酶說明書配制PCR體系：10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5 μL，2 mmol/L dNTPs 5 μL，25 mmol/L MgSO43 μL，正反向引物各2.5 μL，cDNA 1 μL，KOD-Plus-Neo 1 μL，ddH2O補足至50 μL。反應(yīng)程序：94 ℃、2 min；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，重復(fù)35個循環(huán)；72 ℃、10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，利用TaKaRa膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。采用無縫克隆試劑盒（TransGen Biotech，中國），將PCR產(chǎn)物與經(jīng)BamH I酶切后的pET-28a載體連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌1-T1克隆感受態(tài)細胞中，涂布在含有50 mg/L Kan的LB固體培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)，選取單克隆進行菌液PCR驗證，并將陽性結(jié)果送擎科公司測序驗證。

表1 引物名稱及序列

2.2 生物信息學(xué)分析

將測序得到序列通過ExPASy ProtParam tool（http://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測蛋白相對分子質(zhì)量和理論等電點；InterPro在線軟件（http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan）進行結(jié)構(gòu)域分析，PredictProtein （https://www.predictprotein. org/）進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和二級結(jié)構(gòu)分析；SignalP 4.1 （http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行信號肽分析；TRMHMM server v2.0 （http://www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）進行跨膜域分析；根據(jù)NCBI BLAST結(jié)果下載同源序列，分別使用DNAMAN軟件和MEGA 5.0軟件進行多重序列比對和系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。

2.3 CmRHM蛋白體外誘導(dǎo)表達

挑選測序驗證后的菌液，過夜培養(yǎng)，提取pET-28a-CmRHM重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到Transetta（DE3）感受態(tài)大腸桿菌中培養(yǎng)。挑取陽性克隆進行PCR檢測，并送測序驗證表達系統(tǒng)正確性。挑選序列正確菌株擴大培養(yǎng)于100 mL含有50 mg/LKan的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 250 r/min振蕩培養(yǎng)至600 nm處吸光度（600）值達0.6～1.0，加入IPTG至終濃度0.4 mmol/L，16 ℃、200 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜。將誘導(dǎo)完的菌液4 ℃、5000×離心10 min，收集菌體。用預(yù)冷的ddH2O清洗菌液2次，菌體懸浮于緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、10%甘油、1 mmol/L 苯甲基磺酰氟）中，超聲波細胞破碎機超聲破碎（30%功率，超聲5 s，間隔5 s，持續(xù)5 min）。破碎后4 ℃、13 000 r/min離心15 min，上清即為蛋白粗提物。取蛋白粗提物加入6×loading buffer混勻，沸水浴5～10 min、12 000×離心5 min，上樣10 μL進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將膠置于考馬斯亮藍染色1 h，用脫色液進行背景脫色，檢測蛋白表達情況。

2.4 AtUGT78D1表達載體的構(gòu)建及原核表達

從NCBI網(wǎng)站下載擬南芥基因序列，提交給蘇州泓迅生物科技有限公司合成并連接到pET-28a載體上，構(gòu)建重組表達載體。將克隆菌株擴大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到Transetta（DE3）中培養(yǎng)，挑選陽性克隆菌，按“2.3”項下的操作進行AtUGT78D1重組蛋白的體外表達及蛋白提取。

2.5 體外酶促反應(yīng)與檢測

2.5.1 陰性對照品溶液的制備 酶促反應(yīng)體系總體積為400 μL：含0.5 mmol/L UDP-Glc、0.1 mmol/L槲皮素、0.5 mmol/L NADPH、0.5 mmol/L NAD+以及AtUGT78D1和CmRHM粗酶液各193 μL。以空載表達菌在同等條件下誘導(dǎo)的蛋白粗提物替代CmRHM粗酶液進行酶促反應(yīng)為陰性對照。

2.5.2 供試品溶液的制備 將酶促反應(yīng)體系在30 ℃水浴鍋中反應(yīng)過夜，加入400 μL甲醇終止反應(yīng)，振搖混勻，14000×離心20 min，取上清過0.22 μm濾膜，得到供試品溶液。

2.5.3 對照品溶液的制備 精密稱取12.09 mg槲皮素，18.58 mg槲皮素-3--葡萄糖，17.93 mg槲皮素-3--鼠李糖苷分別加入1 mL DMSO溶解，制得各對照品濃度為40 mmol/L的母液。吸取母液各2 μL，并補足甲醇至800 μL，過0.22 μm濾膜，得到濃度為0.1 mol/mL的槲皮素、槲皮素3--葡萄糖苷、槲皮素3--鼠李糖苷混合對照品溶液。

2.5.4 色譜條件 色譜柱為Waters Symmetry C18Column（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國Waters公司），柱溫30 ℃。流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液（55∶45），體積流量1 mL/min，進樣量10 μL，檢測波長為366 nm。

2.6 不同器官CmRHM基因的差異表達分析

利用實時熒光定量檢測基因在不同組織中的表達水平。冰上配制反應(yīng)體系20 μL；包含10 μL TBGreen Premix Ex Taq II（2×）、上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL、2 μL cDNA、6.4 μL ddH2O，在CFX96 Touch （Bio-Rad，美國）儀上進行擴增。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性（95 ℃、30 s）；變性（95 ℃、5 s），退火和延伸（60 ℃、30 s）40個循環(huán)；最后添加熔解曲線設(shè)置。相對定量分析采用2?ΔΔCt方法進行計算，結(jié)果采用GraphPadPrism 7.0進行數(shù)據(jù)分析與繪圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 CmRHM基因全長克隆

以廣佛手cDNA為模板進行全長克隆，獲得1條基因的PCR產(chǎn)物約為2000 bp，與預(yù)期大小相近，如圖1所示。將PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后連接到pET-28a載體上并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，選擇陽性克隆菌株送測序公司進行測序。測序結(jié)果顯示克隆獲得的序列長度為2007 bp，與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的序列一致。該基因編碼668個氨基酸，命名為

3.2 CmRHM1基因序列的生物信息學(xué)分析

CmRHM1蛋白的相對分子質(zhì)量為75 330、理論等電點為6.97，為親水蛋白。信號肽分析顯示無信號肽；跨膜域分析結(jié)果表明CmRHM1蛋白為非跨膜蛋白。結(jié)構(gòu)域分析表明：CmRHM1在10～315 aa處含有NADP（H）結(jié)合位點；在384～557 aa處含有類似RmlD酶結(jié)構(gòu)的活性中心。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示：基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲占58.08%，α-螺旋結(jié)構(gòu)占29.19%，其中無規(guī)則卷曲和α-螺旋結(jié)構(gòu)是其主要的結(jié)構(gòu)原件。

M-Marker 1-PCR擴增產(chǎn)物

3.3 CmRHM1氨基酸序列和系統(tǒng)進化樹分析

BLAST結(jié)果顯示，CmRHM1氨基酸序列與甜橙(L.) Osbeck，阿月渾子L.、川桑Schneid.、木槿L.等7種植物的相似度均達到80%以上。利用DNAMAN軟件將其與同源性較高的植物進行氨基酸序列多重比對（圖2），結(jié)果顯示CmRHM1氨基酸序列存在NADP(H)結(jié)合位點（GXXGXXG/A）和類似RmlD酶結(jié)構(gòu)的活性中心（YXXXK）。結(jié)合InterProScan結(jié)構(gòu)域分析，CmRHM1蛋白具有2個功能不同的結(jié)構(gòu)域：具有UG4,6-Dh活性的N末端域和具有UDP-4K6DG-3,5-差向異構(gòu)酶和UDP-4KR 4-酮-還原酶雙功能活性的C-端區(qū)域[18]（UERs）。為了進一步研究CmRHM1蛋白的功能，在NCBI中下載完整RHM酶的氨基酸序列和UDP-4K6DG 3,5-差向異構(gòu)酶和UDP-4KR 4-酮-還原酶雙功能的酶，利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CmRHM1與甜橙的親緣關(guān)系最近，與擬南芥(L.) Heynh.、陸地棉L.等植物的親緣關(guān)系較遠。

圖2 CmRHM1序列與其他植物多重序列比對

圖3 CmRHM1系統(tǒng)進化分析

3.4 CmRHM1與AtUGT78D1的原核表達分析

分別構(gòu)建pET-28a-CmRHM1和pET-28a- AtUGT78D1重組表達載體，并轉(zhuǎn)化到Transetta（DE3）感受態(tài)中進行異源表達。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示：與空載相比，pET-28a-CmRHM1和pET-28a-AtUGT78D1在近70 000和55 000處出現(xiàn)目的蛋白條帶，分別與CmRHM1和AtUGT78D1預(yù)測的蛋白大小基本一致（圖4）。所以這2個蛋白條帶為誘導(dǎo)表達的CmRHM1重組蛋白和AtUGT78D1重組蛋白。

M-Marker 1-空載 2-CmRHM1重組蛋白 3-AtUGT78D1重組蛋白

3.5 CmRHM1的體外催化功能

AtUGT78D1蛋白既能將UDP-Glc作為供體對槲皮素進行糖基化生成槲皮素-3--葡萄糖苷，又能將UDP-Rha作為供體對槲皮素進行鼠糖基化生成槲皮素-3--鼠李糖苷。利用AtUGT78D1蛋白的雙重糖基化功能，對CmRHM1的生物活性進行體外驗證。以槲皮素為底物，UDP-Glc為糖供體，在酶促反應(yīng)體系中加入重組蛋糖苷產(chǎn)物類型來考察CmRHM1的功能。其中不添CmRHM1的為對照組，添加重組蛋白CmRHM1的為實驗組。結(jié)果顯示（圖5），對照組的酶促反應(yīng)體系在保留時間4.03 min處出現(xiàn)明顯的色譜峰，這與標準品槲皮素-3--葡萄糖苷（S1）的出峰時間相近，說明體系中有槲皮素-3--葡萄糖苷的生成；實驗組的酶促反應(yīng)體系僅在4.95 min處出現(xiàn)明顯的色譜峰，這與槲皮素-3--鼠李糖苷（S2）的出峰時間一致，說明加入重組CmRHM1蛋白的酶促反應(yīng)體系中有UDP-Rha的生成，AtUGT78D1利用體系生成的UDP-Rha作為供體對槲皮素鼠李糖基化生成槲皮素-3--鼠李糖苷。在本實驗中，2組酶促反應(yīng)體系均未在8.38 min（S3）處出現(xiàn)色譜峰，說明底物槲皮素均被轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的糖苷。實驗結(jié)果證明，CmRHM1在體外具有將UDP-Glc轉(zhuǎn)化成UDP-Rha的功能。

S1-槲皮素-3-O-葡萄糖苷 S2-槲皮素-3-O-鼠李糖苷 S3-槲皮素

3.6 不同器官CmRHM1基因差異表達分析

利用qRT-PCR對廣佛手不同器官（莖、葉、果實）中的基因進行差異表達分析，結(jié)果顯示（圖6），基因在葉中的表達量最高，而在莖中的表達量最低。相對于莖而言，葉中基因的相對表達水平為4.03（＜0.001），果實中基因的相對表達水平為1.36。

***表示差異顯著，P＜0.001

4 討論

UDP-Rha是生物合成多糖和鼠李糖糖苷類天然產(chǎn)物的必要組分之一。然而，在植物中，分離并鑒定出與UDP-Rha合成相關(guān)的基因依然很少。目前，尚未有廣佛手中關(guān)于基因的相關(guān)報道，本實驗基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)首次從廣佛手中擴增得到1條基因全長序列，并對其進行了生物信息學(xué)的分析。多重序列比對分析顯示在序列的N-端和C-端均含有植物RHM中高度保守的2個結(jié)構(gòu)域（GxxGxxG/A和YxxxK），GxxGxxG/A是酶促反應(yīng)輔因子NADP(H)結(jié)合位點，而輔因子NAD+則結(jié)合YxxxK結(jié)構(gòu)，暗示著具有將UDP-Glc轉(zhuǎn)化成UDP-Rha的能力。進化分析顯示與同屬植物甜橙的親緣關(guān)系最近，而與擬南芥等植物的親緣關(guān)系相對較遠。此外，本研究通過構(gòu)建表達載體pET-28a-CmRHM1并誘導(dǎo)其重組蛋白的表達，并結(jié)合擬南芥AtUGT78D1具有鼠李糖基化槲皮素生成槲皮素3--鼠李糖苷的功能對廣佛手的功能進行鑒定，進一步證實了CmRHM1蛋白具有催化UDP-Glc合成UDP-Rha的功能。為了考察不同器官中基因的表達情況，本研究利用qRT-PCR的方法對基因在廣佛手的莖、葉和果實進行了差異表達分析，結(jié)果顯示基因在莖、葉和果實中的表達水平依次為葉＞果實＞莖。

迄今為止，在代謝工程或合成生物學(xué)中用于微生物合成UDP-Rha的基因主要為擬南芥的2和1[1,19]。本實驗從藥用植物廣佛手中獲得了1條能一步將UDP-Glc轉(zhuǎn)化成UDP-Rha的鼠李糖合成酶基因，以期為微生物合成UDP-Rha提供候選基因，也為鼠李糖糖苷類次生代謝產(chǎn)物的合成提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Cloning and characterization of a UDP-rhamnose synthase gene from

ZHOU Liang-yun, CAI Qi-zhong, LIU Chang-zheng, LIU Lu, ZHANG Chun-rong, YANG Quan

School of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University/ Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine for Production & Development of Cantonese Medicinal Materials/ Comprehensive Experimental Station of Guang zhou, Chinese Materia Medica, China Agriculture Research System, Guangzhou 510006, China

To clone and characterize a UDP-rhamnose synthase gene involved in the biosynthetic mechanism of UDP-rhamnose for the medicinal plant.Based on the transcriptome data, the full-length cDNA of UDP-rhamnose synthase gene () was screened and cloned, and then the bioinformatics analysis was carried out. The prokaryotic expression vector was constructed and the function of CmRHM1was identified by enzymatic reaction. Additionally, Real-time PCR was performed to analyze the expressive characteristics of CmRHM1 gene in different plant organs.The ORF length ofwas 2007 bp, encoding 668 aa. Bioinformatic analysis of the amino acid sequence showed that the molecular weight of encoded protein was 75 330, and theoretical isoelectric point was 6.97. This protein was proved to be a hydrophilic protein without signal peptide sequence. Multiple sequence alignment showed thatcontained two highly conserved domains (GxxGxxG/A and YxxxK) at the-terminal and-terminal regions. The enzymatic reactionrevealed that CmRHM1 has indeed been shown to have catalytic activities for converting UDP-glucose into UDP- rhamnose. The results of qPCR showed that the ranking of the expressive level of thein the stem, leaf and fruit was leaf > fruit > stem.The functional identification ofgene reported here provides the basic foundation for the biosynthesis of UDP-rhamnose and rhamnosides.

L. var.Swingle; UDP rhamnose synthase; UDP-rhamnose; cloning; characterization

R282.12

A

0253 - 2670(2021)16 - 5005 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.16.025

2021-02-13

國家重點研發(fā)計劃（2017YFC1700704）；2017年廣東省嶺南中藥材保護資金專項（粵財社[2017]60號）；廣東省普通高校青年創(chuàng)新人才類項目（2018KQNCX133）

周良云（1986—），男，講師。Tel: 18810599924 E-mail: 503712735@qq.com

楊 全，教授。Tel: (020)39252353 E-mail: yangquan7208@vip.163.com

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