核磁共振波譜法分析代縣黃酒成分及酒齡

李剛，張松，高碧霞，趙智勇，趙晶晶

（1.山西省科技資源與大型儀器開放共享中心，太原 030012； 2.山西省飼料獸藥監(jiān)察所，太原 030027）

黃酒是世界上三大古酒（啤酒、葡萄酒、黃酒）之一［1］，具有活血祛寒、溫經(jīng)通絡(luò)、健身強(qiáng)體、延年益壽之功效，是中藥丸散膏丹的重要輔料。陳釀是黃酒生產(chǎn)工藝中重要的過程之一，黃酒的陳釀時(shí)間也稱為酒齡，是評價(jià)黃酒品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)［2］。早在宋代酒業(yè)專著《酒名記》中就有“代州金波又瓊酥”的記載，“金波”即指代州黃酒［3］。代縣黃酒以當(dāng)?shù)靥赜修r(nóng)作物黍米為原料釀制而成，其獨(dú)特的釀造技術(shù)成功入選山西非物質(zhì)文化遺產(chǎn)保護(hù)名錄。黃酒的營養(yǎng)豐富，含有大量的氨基酸、碳水化合物、有機(jī)酸、酯類物質(zhì)及礦物質(zhì)元素等［4］。目前市售代縣黃酒有不同的釀制年限，包括5年、8年、10年、20年等。

黃酒成分檢測通常采用氣相色譜、液相色譜等方法，這些方法樣品處理過程復(fù)雜，標(biāo)準(zhǔn)品昂貴，實(shí)驗(yàn)條件難摸索，檢測過程耗時(shí)長。1H NMR技術(shù)具有無破壞性、無偏向性及快速測定的優(yōu)勢，以組群指標(biāo)分析為基礎(chǔ)，以高通量檢測和多元數(shù)據(jù)分析處理為手段，具有整體觀的研究思路［5–6］，已應(yīng)用于酒科學(xué)相關(guān)研究［7］，如Gougeon［8］等應(yīng)用1H NMR技術(shù)分析了法國6個不同主產(chǎn)區(qū)的紅酒，表明Bordeaux紅酒與其它5個地區(qū)紅酒差異顯著；Hu等［9］采用1H NMR技術(shù)分析了夏敦埃白酒不同放置年限的差異。筆者基于1H NMR技術(shù)，指認(rèn)出代縣黃酒的30種主要成分，研究了不同酒齡的代縣黃酒化學(xué)成分的差異特征及成分穩(wěn)定性，為代縣黃酒在品質(zhì)提高、生產(chǎn)工藝優(yōu)化及質(zhì)量改進(jìn)等方面提供了科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 主要儀器與試劑

核磁共振波譜儀：AVANCEⅢ型，600 MHz，配5 mm核磁管，德國布魯克公司。

超聲波清洗儀：KQ–250DE型，東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司。

重水：25 mL，批號為174611，北京百靈威科技有限公司。

氘代三甲基硅烷丙酸鈉鹽（TSP）：單位裝量為1 g，批號為226597，北京百靈威科技有限公司。

氘代氫氧化鈉：10 mL，批號為551792，北京百靈威科技有限公司。

氘代甲醇：25 mL，批號為184886，北京百靈威科技有限公司。

乙酸乙酯：分析純。

代縣黃酒樣品：酒齡分別為5、8、10、20年，山西省代縣貴喜酒業(yè)有限公司。

1.2 樣品制備

取5 mL黃酒樣品于蒸發(fā)皿中，置于70 ℃恒溫水浴鍋中，直接蒸干，得殘?jiān)麺1。稱取適量殘?jiān)?，加入氘代甲?00 μL與緩沖重水（將NaH2PO4溶于含0.1% TSP的重水中，以氘代氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.0）400 μL溶解，溶解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，以轉(zhuǎn)速13 000 r／min離心10 min，移取上清液600 μL于核磁管中，待測。

用量筒量取75 mL代縣黃酒樣品于分液漏斗中，按照體積比1∶1加入乙酸乙酯進(jìn)行萃取，將萃取液蒸干，得到黃酒乙酸乙酯層（M2）。稱取適量殘?jiān)?，采?00 μL氘代甲醇溶解。將溶解液分別轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，以轉(zhuǎn)速13 000 r／min離心10 min，移取上清液600 μL置于核磁管中，待測。

1.3 1H NMR樣本測試

樣品在25 ℃下于600 MHz NMR儀上測定（頻率為600.13 MHz），掃描次數(shù)為64，脈沖寬度為12.6 μs，譜寬為12 345.7，數(shù)據(jù)點(diǎn)大小為65 536，采用noesypprld序列壓制水峰，zg30序列壓制甲醇峰。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

核磁圖譜采用MestReNova軟件（Version 8.0.1，西班牙m(xù)estrelab research公司）進(jìn)行處理，經(jīng)過定標(biāo)、相位、基線校準(zhǔn)后，以δ0.01×10–6積分段對化學(xué)位移區(qū)間進(jìn)行分段積分。在M1核磁圖譜中對化學(xué)位移δ(0.60～9.60)×10–6進(jìn)行分段積分，其中δ(4.80～5.10)×10–6（殘余水峰）和δ(3.28～3.36)×10–6（殘余甲醇峰）不進(jìn)行積分；在M2核磁圖譜中對化學(xué)位移δ(0.60～10.00)×10–6進(jìn)行分段積分，其中δ(3.28～3.36)×10–6（殘余甲醇峰）不進(jìn)行積分。

將積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行歸一化后導(dǎo)入Excel 中，采用SIMCA–P 14.0（瑞 典Umetrics公 司）軟 件 進(jìn)行主成分分析（PCA）及偏最小二乘法判別分析（PLS–DA）。對1H NMR圖譜中信號未完全重疊的物質(zhì)利用積分面積進(jìn)行單變量分析，并將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Graphpad Prism 6.01軟件（美國GraphPad公司）中制作折線圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 1H NMR圖譜峰的指認(rèn)與歸屬

黃酒中含有不同極性的化合物，為全面表征其化學(xué)成分，對代縣黃酒樣品采用直接蒸干和用乙酸乙酯萃取兩種方式進(jìn)行處理。直接蒸干的黃酒M1的1H NMR圖譜如圖1（A）所示，該圖譜大致可分為3個區(qū)域，高場區(qū)δ(0.50～3.00)×10–6為氨基酸和有機(jī)酸區(qū)，δ(3.00～5.50)×10–6為糖區(qū)，δ(5.50～9.60)×10–6為芳香區(qū)。對黃酒進(jìn)行乙酸乙酯萃取后得到乙酸乙酯層M2，其1H NMR圖譜如圖1（B）所示。分析圖1（B）可知乙酸乙酯層含有大量的醇類、醛類及酯類化合物。通過分析化學(xué)位移、耦合常數(shù)、峰形等圖譜信息，結(jié)合HMDB及BMRB數(shù)據(jù)庫，并參照文獻(xiàn)［10–12］，在黃酒樣本中共指認(rèn)出30種化合物，包括氨基酸11種，有機(jī)酸9種，糖類4種，醇類3種及其它3種，結(jié)果列于表1。

表1 代縣黃酒中主要成分的1H NMR信號歸屬

圖1 代縣黃酒樣本典型的600 MHz 1H NMR圖譜、

2.2 多元統(tǒng)計(jì)分析

黃酒釀制技術(shù)獨(dú)特，化學(xué)組成復(fù)雜，所得的1H NMR圖譜中涵蓋了大量的化學(xué)指紋信息，直觀分析難以顯示不同酒齡的黃酒化學(xué)成分差異，需要進(jìn)一步采用多元統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行比較分析。

主成分分析（PCA）是在保留原始變量主要信息的前提下，通過降維把許多具有一定相關(guān)性的指標(biāo)約化為少數(shù)幾個綜合指標(biāo)來代替原來指標(biāo)的多元統(tǒng)計(jì)分析方法。隨著主成分的增加，其所包含的信息量越來越少［13–14］。PCA得分散點(diǎn)圖能直觀地顯示不同樣品之間的固有差異，通過對不同酒齡的黃酒樣本進(jìn)行分析，由主成分1（PC1：29.2%）和主成分2（PC2：18.1%）構(gòu)成M1的得分圖［圖2（A）］、由主成分1（PC1：39.4%）和主成分2（PC2：12.1%）構(gòu)成M2的得分圖［圖2（B）］均顯示，不同酒齡的黃酒樣品化學(xué)成分存在明顯差異。不同酒齡代縣黃酒成分含量分布如圖3。為了區(qū)分不同酒齡黃酒之間的明顯差異特征，將不同酒齡代縣黃酒含量最高和最低成分列于表2。利用PCA散點(diǎn)圖，結(jié)合含量特征，可以初步判別代縣黃酒的酒齡。

表2 不同酒齡代縣黃酒特征成分

圖2 不同酒齡代縣黃酒樣品1H NMR圖譜的PCA散點(diǎn)圖

圖3 不同酒齡代縣黃酒樣品成分含量分布

利用以下方法進(jìn)行驗(yàn)證：抽取某未知酒齡的代縣黃酒，進(jìn)行核磁實(shí)驗(yàn)，得到1H NMR圖譜，做PCA得分散點(diǎn)圖，該黃酒樣品落在20年區(qū)域。計(jì)算該未知黃酒成分相對含量，結(jié)合前實(shí)驗(yàn)中已有的含量分布圖，發(fā)現(xiàn)谷氨酸，谷氨酰胺，酪氨酸等含量最高，異戊醇含量最低，可判定該樣品為20年酒齡的代縣黃酒。通過實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證該方法有一定可行性，具有前處理簡單、可快速判別的特點(diǎn)。

不同酒齡黃酒的成分含量較為復(fù)雜，因此，對黃酒成分再進(jìn)行Heatmap分析，結(jié)果如圖4。由聚類情況可以看出：20年黃酒聚為一類，5年、8年、10年黃酒大部分樣品聚為一類，少數(shù)樣品發(fā)生漂移，與上述PCA散點(diǎn)圖分布相似。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：20年黃酒成分穩(wěn)定，質(zhì)量控制較好。5年、8年、10年成分相對穩(wěn)定，但有少量樣品漂移，質(zhì)量控制水平可進(jìn)一步提高。

圖4 不同酒齡黃酒樣品1H NMR圖譜指認(rèn)化合物的Heatmap圖

進(jìn)一步對黃酒樣品成分進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，5-HMF與α-葡萄糖含量呈顯著負(fù)相關(guān)，可能與發(fā)酵過程中葡萄糖的美德拉反應(yīng)有關(guān)［15］；乙酸與乙酸乙酯含量呈顯著負(fù)相關(guān)，可能與乙酸發(fā)生酯化反應(yīng)有關(guān)；谷氨酸與谷氨酰胺呈顯著正相關(guān)，二者與苯丙氨酸呈顯著負(fù)相關(guān)；蘇氨酸與丁香酸呈顯著負(fù)相關(guān)等。以上相關(guān)性分析結(jié)果，為闡明代縣黃酒釀制機(jī)理，優(yōu)化營養(yǎng)成分提供了理論依據(jù)。

圖5 不同酒齡黃酒樣品1H NMR圖譜指認(rèn)化合物的Pearson相關(guān)分析圖

3 結(jié)論

（1）首先通過1HNMR實(shí)驗(yàn)，得到代縣黃酒1H NMR圖譜，分析指認(rèn)出其含有氨基酸、有機(jī)酸、碳水化合物、醇類、醛類等30種化學(xué)成分。

（2）其次運(yùn)用多元統(tǒng)計(jì)分析方法，PCA散點(diǎn)圖顯示：20年黃酒樣品聚為一類；5年、8年、10年樣品聚類大致可以分開，有少量重疊；樣品含量分布圖顯示：不同酒齡黃酒成分含量具有明顯特征，以上說明不同酒齡黃酒樣品化學(xué)成分含量存在明顯差異。通過PCA散點(diǎn)圖和成分含量特征，可判別未知代縣黃酒酒齡。

（3）對樣品進(jìn)一步采用Heatmap分析，結(jié)果表明：20年黃酒成分穩(wěn)定，質(zhì)量控制較好；5年、8年、10年成分相對穩(wěn)定，質(zhì)量控制可進(jìn)一步改進(jìn)。

（4）最后利用Pearson相關(guān)分析，找出代縣黃酒成分之間的相關(guān)性，為優(yōu)化黃酒營養(yǎng)成分奠定了基礎(chǔ)。

以上研究可為代縣黃酒改進(jìn)生產(chǎn)工藝、優(yōu)化營養(yǎng)成分及提高其品質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。