納米核酸載體和mRNA體外合成體系的構(gòu)建

馬亞平, 崔 瀟, 楊玉嬌, 李 軍

(聊城大學(xué) 藥學(xué)院，山東 聊城 252059)

0 引言

2019年12月發(fā)現(xiàn)的新型冠狀病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2)引起的新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)疫情迅速席卷全球[1, 2]。我國通過政府強(qiáng)有力的正確領(lǐng)導(dǎo)，醫(yī)護(hù)戰(zhàn)線的英勇抗疫和全國人民的眾志成城，成功遏制了COVID-19疫情在國內(nèi)的肆虐，并為全球應(yīng)對COVID-19疫情提供了寶貴經(jīng)驗(yàn)。然而，由于各國國情、社會制度、經(jīng)濟(jì)水平和防控策略的差異導(dǎo)致疫情在全世界肆虐，截至目前尚未得到有效控制，SARS-CoV-2的起源也尚未定論[3]。根據(jù)霍普金斯大學(xué)實(shí)時統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，全球已經(jīng)確診超過1.8億人，死亡人數(shù)超過400萬。

檢測和診斷、治療和預(yù)防是抗擊COVID-19疫情的三大策略[4]。檢測和診斷能力在全球，尤其是我國已經(jīng)獲得充分動員，為臨床診斷，病毒溯源，控制擴(kuò)大傳染提供了巨大支持[5]。SARS-CoV-2之前，在人類傳播的6種冠狀病毒都未有成功的臨床藥物，研發(fā)抑制SARS-CoV-2的特效藥物也將任重道遠(yuǎn)[6]。疫苗被認(rèn)為是全球抗擊新型冠狀病毒疫情的最終希望[7]。COVID-19疫情爆發(fā)以來，以滅活疫苗、重組蛋白亞單位疫苗、病毒載體疫苗、DNA載體疫苗和mRNA疫苗等五大技術(shù)路線的過百個疫苗研發(fā)項(xiàng)目在全球應(yīng)急啟動。截至2020年12月底，已經(jīng)有數(shù)款疫苗相繼在全球獲得應(yīng)急使用授權(quán)。

免疫治療已經(jīng)成為手術(shù)，放療，化療之后腫瘤治療領(lǐng)域的熱點(diǎn)，并被認(rèn)為是可能治愈腫瘤的最終手段。腫瘤mRNA疫苗也成為腫瘤治療性疫苗研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[8]。2020年11月，美國Moderna公司披露了腫瘤疫苗mRNA-4157的臨床I期試驗(yàn)數(shù)據(jù)，該疫苗對多種惡性實(shí)體腫瘤的疾病控制率高達(dá)90%，顯示出巨大的抗癌潛力。

mRNA疫苗的研究可以追溯到1990年代[9]，然而SARS-CoV-2 mRNA疫苗被緊急授權(quán)使用之前尚未有該技術(shù)路線的疫苗上市。mRNA疫苗相比其他技術(shù)路線的疫苗，具有安全性高，易于開發(fā)針對變異病毒株新疫苗的優(yōu)勢[10]。另外mRNA本身可以作為天然的免疫佐劑提高接種有效性，生產(chǎn)過程不依賴高等級生物安全生產(chǎn)設(shè)施，生產(chǎn)速度快，生產(chǎn)成本低，能更好滿足全球疫情對疫苗劑量的迫切需求[11]。mRNA的體外合成、穩(wěn)定性和細(xì)胞內(nèi)遞送是mRNA疫苗研發(fā)的關(guān)鍵技術(shù)[12]。目前這些技術(shù)主要掌握在Moderna、BioNTech和CureVac等幾個國外公司手中。輝瑞/BioNTech 和Moderna研發(fā)的mRNA疫苗已經(jīng)在全球上百個國家開始接種，國內(nèi)復(fù)星制藥參股BioNTech的mRNA疫苗BNT162b2尚在臨床階段。

在體內(nèi)環(huán)境中，mRNA半衰期短、穩(wěn)定性差。裸露的mRNA直接進(jìn)入體內(nèi)容易被體內(nèi)廣泛存在的RNA酶降解。為了保證mRNA疫苗在體內(nèi)的穩(wěn)定性與安全性，需要合適的載體材料將mRNA進(jìn)行包裹，高效遞送到機(jī)體細(xì)胞內(nèi)[13]。研究報(bào)道的非病毒mRNA遞送主要包含陽離子脂質(zhì)納米粒、聚合物、肽、類病毒顆粒、陽離子納米乳和樹突狀細(xì)胞的遞送系統(tǒng)[14]。

我們嘗試構(gòu)建了mRNA體外合成制備體系和基于陽離子聚合物聚乙酰亞胺(Polyetherimide，PEI)的PEI-脂質(zhì)納米核酸遞送系統(tǒng)，以期為開發(fā)自主知識產(chǎn)權(quán)的mRNA/DNA核酸疫苗奠定前期工作基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

mMESSAGE mMACHINE Kit 轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Lifetechnologies，PCR試劑盒購買于TaKaRa；質(zhì)粒提取試劑購自TIANGEN；MCF-7(HER2表達(dá)陰性細(xì)胞系，HER2-cell)、SKOV-3(HER2表達(dá)陽性細(xì)胞系，HER2+cell)和Hela細(xì)胞購買于中科院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，RPMI-1640、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，胎牛血清購買于美國的Thermo Fisher Scientific (GIBCO)公司；DSPE-mPEG2000(二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇2000)、DSPE-PEG2000-NHS(二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇2000-N-羥基丁二酰亞胺)、Cy5-PEG2000-DSPE(近紅外染料Cy5-聚乙二醇-磷脂)購買于西安瑞禧公司；DOTAP [(2,3-二油?；?丙基)-三甲基氯化銨],聚乙酰亞胺(PEI)購買于sigma；抗HER2單克隆抗體由上海張江生物科技有限公司贈送；其它常規(guī)生化試劑購自國藥集團(tuán)；50、100、200 nm孔徑聚碳酸酯膜購自Whatman公司；Zetasizer Nano ZSE是由英國Malvern公司制造，脂質(zhì)體擠出器LF-1由美國Avestin公司制造；精密天平為德國梅特勒-托利多XP6百萬分之一超微量天平；熒光倒置顯微鏡為Olympus CKX53；酶標(biāo)儀為Bioteck Synergy H1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 mRNA體外合成。體外合成mRNA模板質(zhì)粒制備：參照圖3所示技術(shù)路線2，以綠色熒光蛋白基因GFP為測試基因，驗(yàn)證體外mRNA合成體系。首先，將T7啟動子序列與GFP CDS序列進(jìn)行設(shè)計(jì)拼接，委托基因合成公司進(jìn)行全序列合成或以含有GFP基因的pEGFP-C1質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)含有T7啟動子的引物，PCR擴(kuò)增獲得T啟動子和GFP CDS融合序列，將獲得的融合序列定向克隆到設(shè)計(jì)有Ploy A序列的克隆載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)篩選陽性重組子，提取質(zhì)粒Sanger雙脫氧終止法測序以確認(rèn)序列正確無突變，獲得GFP-mRNA體外合成模板質(zhì)粒。

質(zhì)粒提取和mRNA體外合成模板質(zhì)粒線性化：按照TIANGEN質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取GFP真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1和構(gòu)建的GFP模板質(zhì)粒，紫外分光光度計(jì)檢測質(zhì)粒濃度。在克隆載體Poly A 3’端酶切位點(diǎn)處，用NEB限制性內(nèi)切酶將模板質(zhì)粒線性化，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效率，酚-氯仿抽提純化獲得體外合成mRNA的線性化質(zhì)粒模板。

轉(zhuǎn)錄合成mRNA：使用mMESSAGE mMACHINE Kit 轉(zhuǎn)錄試劑盒(Lifetechnologies)體外合成mRNA，在0.2 mL RNase-free的Eppendorf管中配制20 μL體系：10 μL 2× NTP/CAP、2 μL 10× Reaction Buffer、0.1-1 μg linear template DNA、2 μL Enzyme Mix、Nuclease-free Water up to 20 μL，輕柔混勻。PCR儀中，37 ℃ 1-2 h、加 1 μL TURBO DNase，混勻，37 ℃孵育15 min，酚氯仿抽提純化 mRNA。

酚氯仿抽提、純化線性化模板DNA和mRNA：用Tris飽和酚抽提DNA，水飽和酚抽提RNA，步驟如下: DNA或者RNA溶液中加入等體積飽和酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，振蕩15 s混勻，靜置3 min分層，12,000 g離心10 min；將上層水相移入新的1.5 mL Eppendorf管中，加入等體積氯仿:異戊醇(24:1)重復(fù)抽提1次；將上層水相移入新的1.5 mL Eppendorf管中，加入0.1體積3 M的醋酸鈉(pH 5.2)和2倍體積無水乙醇，充分混勻，-20 ℃放置30 min；4 ℃ 12000 g離心10 min；棄上清，保留沉淀，500 μL預(yù)冷70%乙醇，輕柔顛倒洗沉淀3-5次，4 ℃ 7500 g離心2 min；棄上清，敞開管口室溫直至乙醇揮發(fā)完全；用適合下步實(shí)驗(yàn)的溶劑溶解DNA或者RNA沉淀；紫外分光光度計(jì)檢測DNA/RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 PEI脂質(zhì)納米核酸載體的制備。 DOTAP、DOTAP-mPEG2000脂質(zhì)納米粒(DOTAP-m2000)制備：將DOTAP: DSPE-mPEG2000按摩爾比96:4溶于氯仿中，加入玻璃燒瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，直至氯仿完全揮發(fā)，得到均勻的脂質(zhì)薄膜，45 ℃，用絡(luò)合緩沖液(150 mM NaCl，10 mM HEPES，pH=7.4)薄膜水化，得到DOTAP-m2000脂質(zhì)納米粒(LNP)。將DOTAP溶于氯仿中，制備方法同上，制得DOTAP脂質(zhì)納米粒。

免疫脂質(zhì)納米粒和熒光脂質(zhì)納米粒制備：根據(jù)上述方法，將DOTAP: DSPE-mPEG2000：DSPE-PEG2000-NHS按摩爾比96:3.3:0.7溶于氯仿中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)薄膜水化法制備 DOTAP-PEG2000-NHS脂質(zhì)納米粒。根據(jù)本課題組前期構(gòu)建的免疫脂質(zhì)體制備方法[15]，用抗HER2抗體修飾，獲得Anti HER2免疫脂質(zhì)納米粒(HLNP)。精確稱取0.1 mg的Cy5-PEG2000-DSPE(645 nm激發(fā)紅光熒光染料)溶于50 μL PBS溶液，每100 μL DOTAP-m2000脂質(zhì)納米粒(LNP)或免疫脂質(zhì)納米粒(HLNP)中加入10 μL Cy5-PEG2000-DSPE溶液(2 mg/mL)，混合均勻，65 ℃水浴1 h，透析去除未連接的抗體和游離的熒光染料，獲得LNP-Cy5(DOTAP-m2000熒光脂質(zhì)納米粒)和HLNP-Cy5(Anti HER2熒光免疫脂質(zhì)納米粒)。

PEI-pEGFP、PEI-mRNA聚合物制備：PEI(1mg/mL)與GFP真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1或GFP-mRNA溶于150 mM NaCl溶液，以PEI：pEGFP-C1/GFP-mRNA質(zhì)量比2:1(N:P=6.6:1)的比例混合，渦旋10 s靜置20 min，制備PEI-GFP、PEI-GFP-mRNA復(fù)合物。

PEI、PEI-pEGFP-C1、PEI-GFP-mRNA脂質(zhì)納米粒制備：PEI與DOTAP或DOTAP-m2000脂質(zhì)納米粒，以質(zhì)量比5:1的比例混合，渦旋10 s，室溫靜置1 h，獲得PEI-DOTAP 和PEI-DOTAP-m2000脂質(zhì)納米粒，用微型擠出器擠過脂質(zhì)納米粒懸液數(shù)次(n=0，1，5，9，13)，以使脂質(zhì)納米粒粒徑均一化。PEI-pEGFP-C1、PEI-GFP-mRNA復(fù)合物分別與DOTAP或DOTAP-m2000脂質(zhì)納米粒以質(zhì)量比5:1的比例混合，渦旋10 s，室溫靜置1 h，制備PEI-GFP-DOTAP，PEI-GFP-DOTAP-m2000，PEI-GFP-mRNA-DOTAP-m2000脂質(zhì)納米粒。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)。SKOV-3細(xì)胞(HER2+)用RPMI-1640培養(yǎng)基，含10% 胎牛血清(FBS)，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)；MCF-7細(xì)胞(HER2-)用DMEM培養(yǎng)基，含10%胎牛血清(FBS)，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)；HeLa細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基，含10%胎牛血清(FBS)，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)；顯微鏡下觀察細(xì)胞，選擇生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，密度達(dá)到80-90% 即可傳代，傳代時用0.25% 胰酶消化細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果，將適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞懸液按照實(shí)驗(yàn)需要接入含有新鮮培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿或細(xì)胞培養(yǎng)板中，補(bǔ)足培養(yǎng)基，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)，以備實(shí)驗(yàn)所需。

1.2.4 納米粒粒徑分析。使用英國Malvern公司的Zetasizer Nano ZSE納米激光粒度儀測定樣品的粒徑，每份樣品重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞毒性分析。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK8方法測量不同脂質(zhì)體的體外細(xì)胞毒性。將SKOV-3細(xì)胞與MCF-7細(xì)胞分別接種于96孔板中，8000個細(xì)胞/孔，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)過夜。將PEI、PEI-DOTAP、PEI-DOTAP-m2000分別按指定濃度(0.05、0.25、1.25 μg /mL)加入，培養(yǎng)24 h。每孔加入100 μL CCK8溶液(1 mg/mL)，孵育4 h。多功能酶標(biāo)儀490 nm處測定吸光度，按照公式RCV(%)=測試組OD值/對照組OD值×100%，測定細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.6 熒光共聚焦顯微鏡分析。SKOV-3和MCF-7細(xì)胞分別接種于24孔板培養(yǎng)過夜，將免疫熒光脂質(zhì)納米粒HLNP-Cy5和熒光脂質(zhì)納米粒LNP-Cy5分別與SKOV-3和MCF-7細(xì)胞孵育，37 ℃，2 h，用PBS清洗2遍，每孔加入500 μL 4%多聚甲醛，固定5 min，吸走多聚甲醛再用PBS清洗2遍，每孔加入1 mL DAPI (5 μg/mL)染色15 min，用PBS洗兩遍，加入1 mL PBS，共聚焦顯微鏡拍照檢測納米粒靶向特異性；用PEI-GFP，PEI-GFP-DOTAP，PEI-GFP-DOTAP-m2000，PEI-GFP-mRNA-DOTAP-m2000分別與HeLa細(xì)胞孵育，培養(yǎng)過夜，按上述方法DAPI染色，共聚焦顯微鏡拍照檢測GFP轉(zhuǎn)染效率。

1.2.7 流式分析。制備SKOV-3和MCF-7細(xì)胞懸液，分別加入納米粒LNP-Cy5和HLNP-Cy5，4 ℃ 孵育30 min，PBS清洗兩遍，過100目尼龍網(wǎng)，使用密理博guava easy Cyte 8HT 流式細(xì)胞分析儀檢測靶向效率。將PEI-GFP、PEI-GFP-DOTAP、PEI-GFP-DOTAP-m2000分別加入HeLa細(xì)胞中，培養(yǎng)過夜，制備單細(xì)胞懸液，使用密理博guava easy Cyte 8HT 流式細(xì)胞分析儀檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以平均值(Mean ± SD)表示，以2-tailed Student’s t-test 或1-way ANOVA with a Tukey’s post hoc test分析各組數(shù)據(jù)差異顯著性，p> 0.05表示差異性不顯著；0.01 < *p< 0.05表示差異性顯著；**p< 0.01表示差異性極顯著；***p< 0.001表示差異極其顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 PEI-脂質(zhì)納米粒表征分析

應(yīng)用激光納米粒度電位儀分別檢測擠出次數(shù)分別為0、1、5、9、13次的PEI-DOTAP脂質(zhì)納米粒(PEI-DOTAP)(圖1(a))和PEI-DOTAP-PEGm2000脂質(zhì)納米粒(PEI-DOTAP-m2000)的粒徑(圖1(b))。結(jié)果顯示擠出次數(shù)達(dá)到9次及以上，平均粒徑達(dá)到100 nm左右，且實(shí)現(xiàn)了較好的均一化。將制備的PEI-DOTAP-m2000脂質(zhì)納米粒常溫放置7、28、60 天，檢測樣品粒徑，數(shù)據(jù)顯示經(jīng)過放置，所制備的脂質(zhì)納米粒粒徑?jīng)]有明顯變大，并且保持了較好的均一性(圖1(c))。另外，檢測制備的DOTAP-m2000脂質(zhì)納米粒(LNP)和Anti HER2免疫脂質(zhì)納米粒(HLNP)粒徑，抗體免疫化修飾的脂質(zhì)納米納米粒粒徑?jīng)]有明顯增大(HLNP)(圖1(d))。

2.2 細(xì)胞毒性分析

CCK-8法測定不同濃度的PEI、PEI-DOTAP、PEI-DOTAP-m2000對MCF-7和SKOV-3細(xì)胞的細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示，相比PBS對照，不同濃度的脂質(zhì)納米粒對MCF-7細(xì)胞(圖2(a))、SKOV-3細(xì)胞(圖2(b))細(xì)胞活力的影響無顯著差異，表明所制備的PEI-脂質(zhì)納米粒具有較低的細(xì)胞毒性。

2.3 mRNA體外制備與純化

以綠色熒光蛋白為測試基因，按照圖3所示技術(shù)路線2構(gòu)建了測試基因GFP 的mRNA體外合成體系，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測GFP-mRNA合成效率，純化效率和PEI-脂質(zhì)納米載體對mRNA的包封效率(圖4(a))。并對所制備的PEI-GFP-mRNA-DOTAP-m2000納米制劑進(jìn)行了粒徑和透射電鏡表征分析，結(jié)果顯示所制備GFP-mRNA脂質(zhì)納米粒具有較均一的粒徑分布(平均粒徑124 nm)(圖4(b)，4(c))。

圖3 mRNA體外制備技術(shù)路線示意圖

2.4 PEI-脂質(zhì)納米粒對GFP-mRNA 的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率分析

以制備PEI-GFP-mRNA-DOTAP-m2000脂質(zhì)納米粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，熒光顯微鏡檢測分析表明，所制備的mRNA脂質(zhì)納米粒能高效轉(zhuǎn)染mRNA到HeLa細(xì)胞，介導(dǎo)GFP蛋白的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(圖4 (d))。

圖4 PEI-脂質(zhì)納米粒對GFP-mRNA 的轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證(a)GFP-mRNA的合成(1)純化效率和(2)PEI-脂質(zhì)納米載體對mRNA的包封效率(3)檢測；(b)PEI-GFP-mRNA-DOTAP-m2000脂質(zhì)納米粒粒徑分析；(c)PEI-GFP-mRNA-DOTAP-m2000脂質(zhì)納米粒透射電鏡表征分析；(d)倒置熒光顯微鏡拍攝PEI-GFP-mRNA-DOTAP-m2000脂質(zhì)納米粒轉(zhuǎn)染效率

2.5 脂質(zhì)納米粒對pEGFP-C1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率分析

分別用PEI、PEI-DOTAP、PEI-DOTAP-m2000將pEGFP-C1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡檢測。結(jié)果表明，所制備的PEI-DOTAP脂質(zhì)納米粒對pEGFP-C1質(zhì)粒具有更高的轉(zhuǎn)染效率，而PEI、PEI-DOTAP-m2000對pEGFP-C1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率相對較低(圖5 (a))。流式分析取得了一致結(jié)果(圖5 (b))。結(jié)果預(yù)示所制備的PEI脂質(zhì)納米粒也具有DNA載體應(yīng)用前景，而且mPEG2000修飾可以通過提高脂質(zhì)納米粒的隱形作用而降低非被動靶向，后期可通過抗體等靶向修飾提高載體主動靶向效率。

2.6 熒光顯微鏡檢測免疫脂質(zhì)載體的靶向特異性和靶向效率

將熒光脂質(zhì)納米粒LNP-Cy5和免疫熒光脂質(zhì)納米粒HLNP-Cy5分別與SKOV-3和MCF-7細(xì)胞孵育2 h，熒光顯微鏡拍照檢測。結(jié)果顯示，HER2低表達(dá)的MCF-7細(xì)胞對HLNP-Cy5與LNP-Cy5的內(nèi)吞效率沒有顯著差異(圖6(a))，而HER2+SKOV-3細(xì)胞對HLNP-Cy5具有更高的內(nèi)吞效率(圖6 (c))，流式分析取得了與熒光顯微鏡一致的結(jié)果(圖6 (b、d))。預(yù)示著通過抗體修飾可以提高脂質(zhì)納米載體的主動靶向效率和靶向特異性。

3 結(jié)論

mRNA疫苗作為一種新型的疫苗研發(fā)技術(shù)，以其安全、高效、易開發(fā)生產(chǎn)的優(yōu)勢，在抗擊COVID-19戰(zhàn)疫中獲得疫苗行業(yè)矚目[16]。目前已經(jīng)在SARS-CoV-2預(yù)防中取得了突破性應(yīng)用，并在多種實(shí)體瘤免疫治療的臨床實(shí)驗(yàn)獲得了良好的效果。mRNA的體外高效合成和體內(nèi)遞送是開發(fā)mRNA疫苗的兩大關(guān)鍵核心技術(shù)，我們基于陽離子聚合物PEI開發(fā)了一種適用于DNA和mRNA的脂質(zhì)納米核酸遞送載體，并通過載體表征，優(yōu)化了該載體的制備方法。針對總mRNA合成和特定基因mRNA合成兩種不同應(yīng)用場景設(shè)計(jì)了兩種技術(shù)路線，以綠色熒光蛋白GFP為測試基因，驗(yàn)證了特定基因mRNA體外合成的技術(shù)路線。另外我們驗(yàn)證了所制備的PEI脂質(zhì)納米載體介導(dǎo)綠色熒光白GFP的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1和GFP-mRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效率，通過PEG隱形化修飾可以降低所制備核酸載體的被動靶向。我們還嘗試對制備的納米載體進(jìn)行靶向修飾，以抗HER2抗體為例初步驗(yàn)證了抗體免疫化修飾可以提高載體的靶向特異性和靶向效率，預(yù)示著該載體具有體內(nèi)靶向遞送的潛在應(yīng)用價值。未來，我們還需要進(jìn)行更深入的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該載體系統(tǒng)在核酸(DNA/mRNA)疫苗研發(fā)方面的應(yīng)用前景。