HPLC法同時測定茶葉中咖啡因和兒茶素

胡旭倩，唐銷蓉，姚菲菲，駱 燦

（1.贊宇科技集團股份有限公司，浙江杭州 310009；2.浙江金正檢測有限公司，浙江義烏 322000）

茶多酚具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、調(diào)血脂和降血糖等藥理作用,被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥保健品、功能性飲料和化妝品中[1-3]。兒茶素是茶多酚的主成分，也是其主要的藥理活性物質(zhì)，占茶多酚含量的60%～80%[3-5]。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260超高效液相色譜儀（配紫外檢測器）（美國Agilent公司）；超聲波振蕩器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；渦旋混合儀（上海精科實業(yè)有限公司）；純水凈化儀（杭州永潔達凈化科技有限公司）；甲醇為色譜純（美國大地公司）；甲酸為分析純（上海安譜實驗科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 流動相的配制

①流動相A（0.1%甲酸水）。1 000 mL水中加入1 mL的甲酸，超聲脫氣備用。②流動相B（0.1%甲酸甲醇）。 1 000 mL甲醇中加入1 mL的甲酸，超聲脫氣備用。

1.2.2 標準溶液配制

（1）標準儲備溶液的配制。準確稱取兒茶素（C）、表沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和咖啡因（CAF）0.100 0 g（精確到0.000 1 g）于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成濃度約為2.0 mg/mL的標準儲備液。

（2）標準混合工作溶液的配制。用甲醇溶液稀釋兒茶素及咖啡因的混合標準儲備溶液，得到適量質(zhì)量濃度的混合標準工作溶液。

1.2.3 色譜條件

安捷倫C18（4.6 μm×250 mm）色譜柱；柱溫30 ℃；流速 0.8 mL/min，進樣量20 μL，紫外檢測器檢測，檢測波長：280 nm，流動相條件如表1所示。

表1 流動相條件

1.2.4 提取方法

稱取1.0 g均勻磨碎的試樣于50 mL離心管中，加入在75 ℃中預(yù)熱過的70%甲醇溶液30 mL，用玻璃棒充分攪拌均勻濕潤，立即移入75 ℃水浴中，浸提30 min，期間不間斷攪拌幾次，取出，冷卻至室溫。用70%甲醇溶液定容至50 mL，搖勻，濾液過0.45 μm濾膜，上機待測。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的選擇

選取一定濃度的混合標準工作溶液，用二極管陣列檢測器在200～400 nm的波長范圍內(nèi)進行掃描，5種兒茶素分別在210 nm和280 nm處有兩個最大吸收波長，咖啡因在280 nm處有最大吸收波長。鑒于梯度洗脫時，在210 nm的波長下檢測時，基線漂移比較明顯，故本方法采用280 nm為檢測波長。

2.2 流動相添加劑的選擇

本文在相同的色譜條件下，選取一定濃度的混合標準工作溶液進行進樣分析，綜合考慮6種物質(zhì)的出峰時間、峰形和分離度等因素，故本文選擇甲酸為流動相添加劑。

2.3 提取方法的選擇

對同一茶葉樣品在相同的色譜條件下，分別用傳統(tǒng)加熱浸提法和超聲浸提法在70%甲醇溶液下提取30 min。結(jié)果表明，經(jīng)過相同時間的提取，傳統(tǒng)的加熱浸提法提取率明顯高于超聲浸提法，故本方法選用加熱浸提法。

2.4 提取時間的選擇

稱取同一茶葉樣品，在相同的色譜條件下，用70%的甲醇溶液在75 ℃的水浴中分別提取10 min、20 min、 30 min、40 min、50 min和60 min。結(jié)果表明，加熱浸提時間從30 min開始，提取率開始緩慢下降（詳見表圖1）。因此，本實驗選取30 min為最佳提取時間。

圖1 不同提取時間對提取率的影響

2.5 方法線性關(guān)系、精密度和重現(xiàn)性

EGC、C、EC、EGCG、ECG和CAF在0.2～2.0 mg/mL的范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 11～0.999 95，RSD為0.24%～0.57%，回收率為95.9%～100.6%（詳見表2）。本方法簡單、準確、重現(xiàn)性好，可用于茶葉中兒茶素類和咖啡因的定量檢測。

表2 各組分線性回歸方程、線性范圍及回收率

3 結(jié)論

本研究以茶葉中EGC、C、EC、EGCG、ECG和CAF為研究對象，采用酸性流動相梯度洗脫同時測定了茶葉中5種主要兒茶素和咖啡因的含量。實驗結(jié)果表明，茶葉中的EGC、C、EC、EGCG、ECG和CAF經(jīng)70%甲醇溶液在 75 ℃加熱浸提30 min，能夠充分被提取。本方法簡單、準確、重復(fù)性好且成本低廉，可用于茶葉中咖啡因和兒茶素的 檢測。