辣椒素及二氫辣椒素的制備方法及其結(jié)構(gòu)確證

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(1.湖南工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，湖南 株洲 412007；2.許昌學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，河南 許昌 461000)

辣椒素類物質(zhì)是一類含香草酰胺結(jié)構(gòu)的生物堿。其中主要成分為辣椒素和二氫辣椒素，是辣椒中最辛辣、影響辣度的主要成分，二者約占辣椒素類物質(zhì)總含量的90%[1-3]。辣椒素，又名辣椒堿，化學(xué)名稱為8-甲基-N-香蘭基-6-壬烯酰胺(其結(jié)構(gòu)如圖1)，在辣椒素類物質(zhì)中含量居于首位。二氫辣椒素(其結(jié)構(gòu)如圖2)與之區(qū)別在于辣椒素中不飽和的雙鍵被氫化。

圖1 辣椒素

圖2 二氫辣椒素

無論是辣椒素還是其他辣椒素類物質(zhì)，當(dāng)人類的皮膚接觸到它們時都會產(chǎn)生強烈灼燒感，致使人類痛苦難忍。眼睛接觸大劑量辣椒素類物質(zhì)會不停的流淚，甚至引起短暫失明，但不會對眼睛造成危害?；谶@種特性，辣椒素類物質(zhì)可用于制作防衛(wèi)武器，例如配置“防狼噴霧”、“催淚彈”等[4]。適量辣椒素類物質(zhì)添加到食品中，可用于制備健胃消食劑，增加人們的食欲[5]。人類食用辣素之后，交感神經(jīng)被刺激而興奮，從而促進(jìn)汗腺分泌大量汗液，排出人體濕氣，起到祛濕作用。另外，辣椒素類物質(zhì)具有止痛、消炎[6-8]的作用，在醫(yī)藥方面有著廣泛的用途。辣椒素類物質(zhì)也可作為生化農(nóng)藥[9-10]用于農(nóng)業(yè)，實現(xiàn)驅(qū)蟲避害的目的。

天然辣椒素類物質(zhì)使用安全、健康，用途廣泛[11]，因此其分離、提純、獲取單體成為研究的熱點之一。目前天然辣椒素類物質(zhì)的提取方法[8,12]主要有微波提取法、超聲波提取法、超臨界提出法、溶劑提取法。前三種提取方法的儀器成本較高，很難適用于規(guī)模生產(chǎn)，而最后一種提取方法的浸取能力大、能源節(jié)約，適用于大量生產(chǎn)。目前文獻(xiàn)報道的辣椒素和二氫辣椒素單體的制備文獻(xiàn)較少。姚金平等[13]選取超臨界CO2提取法對辣椒粗品進(jìn)行提取、純化，利用C18色譜柱分離提純，最大上樣量只有10 mg。董新榮等[14]利用制備型高效液相，以甲醇∶水=70∶30作為流動相，等梯洗脫，得到的3種化合物單體，即：降二氫辣椒素，辣椒素，二氫辣椒素。盡管化合物的純度較高，但最大上樣量只有180 mg。以上兩種方法均不適合克級或大量生產(chǎn)。

因此本文采取溶劑提取法對辣椒素類物質(zhì)進(jìn)行粗提，用結(jié)晶法進(jìn)一步純化。使用自填充柱，利用中壓液相色譜獲取單體。

1 實驗材料與方法

1.1 儀器與試劑

干辣椒粉，云南；95%乙醇，AR，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙酸乙酯，AR，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；正己烷，AR，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；石油醚60～90℃，AR，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；紫外-可見分光光度計，TU-1950，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；中壓液相制備色譜儀，MP200，天津博納艾杰爾科技有限公司；高壓液相色譜儀，ThermoFisher Ultimate 3000，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；核磁共振波譜儀，AVANCE III HD，400 MH，瑞士布魯克公司；傅里葉變換紅外光譜儀，F(xiàn)TIR-650，天津港東科技發(fā)展股份有限公司。

1.2 色譜條件

分析型HPLC：C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-水(體積比為50∶50)，流速1 mL/min，紫外檢測波長210 nm，柱溫30℃，進(jìn)樣體積為5 μL。

1.3 實驗方法

1.3.1 辣椒素類物質(zhì)粗品的提取

稱量辣椒粉(40～60目)200 g，加到1 L的三口瓶中，70℃攪拌下正己烷浸漬4 h，抽濾得濾餅，60℃真空干燥2 h。在50℃攪拌下，濾餅用95%乙醇(料液比1∶5)浸提2 h，抽濾，濾液減壓濃縮，得到辣椒素含量為50%～60%的辣椒油樹脂。

1.3.2 辣椒素類物質(zhì)的純化

取10 g辣椒油樹脂，加入4倍量10%的乙醇，加熱至50℃。攪拌至全溶，再加入2倍量的乙酸乙酯，萃取，分液。乙酸乙酯層過濾去除不溶性雜質(zhì)，減壓濃縮后加入正己烷∶乙酸乙酯 = 6∶1的混合溶劑(料液比1∶4)，攪拌加熱回流，至樣品全溶。-7℃攪拌冷卻直至辣椒素類物質(zhì)固體析出，抽濾，40℃真空干燥，得到固態(tài)辣椒素類物質(zhì)，含量大于90%。

1.3.3 辣椒素、二氫辣椒素單體的制備

取5 g固態(tài)辣椒素類物質(zhì)，用甲醇配置成10 mL溶液，按照色譜方法填充色譜柱，設(shè)置流速20 mL/min。用注射器進(jìn)樣，按表1條件進(jìn)行梯度分離，得到2.9 g辣椒素單體和1.58 g二氫辣椒素單體。

表1 洗脫梯度條件

1.3.4 樣品的純度檢測

準(zhǔn)確稱量10 mg固態(tài)辣椒素類物質(zhì)，用乙腈稀釋至50 mL，作為儲備液備用。移取儲備液1 mL用乙腈定容至10 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，待檢測。辣椒素、二氫辣椒素單體待檢測液配制方法同上，按照分析型液相色譜條件分別進(jìn)行色譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品的純度

正如圖3所示，固態(tài)辣椒素類物質(zhì)的分析型高效液相色譜圖。從圖中可以看出，在保留時間為1.432、2.438處存在極性較大且有紫外吸收的雜質(zhì)，7.27與8.142處有吸收極弱的雜質(zhì)峰，不易提純與分離，目標(biāo)產(chǎn)物辣椒素與二氫辣椒素的保留時間分別為8.782、11.917，基本實現(xiàn)基線分離。結(jié)合文獻(xiàn)[14]報道的色譜圖，保留時間為8.142處應(yīng)為降二氫辣椒素的紫外吸收峰，說明得到的固態(tài)辣椒素類物質(zhì)中含有極少量的降二氫辣椒素。

圖3 固體辣椒素類物質(zhì)

固態(tài)辣椒素類物質(zhì)通過中壓制備液相的自填充柱，進(jìn)行色譜分離，可得到辣椒素與二氫辣椒素單體。首先，作者對洗脫劑的分離條件進(jìn)行篩選，優(yōu)選取出最佳梯度條件(如表1)。起始溶劑比甲醇∶水(體積比為50∶50)，分離出前面極性較大的雜質(zhì)后，逐漸增大甲醇含量的百分比-增大洗脫能力。在縮短時間的同時，使辣椒素與二氫辣椒素充分分離。辣椒素與二氫辣椒素均以辣椒素峰面積外標(biāo)法計算含量[14-15]。

圖4 辣椒素單體

正如圖4所示，分離出的辣椒素單體的分析型高效液相色譜圖。從中可以看出，辣椒素單體的保留時間為8.80。得到的單體含有極少量的二氫辣椒素和降二氫辣椒素。辣椒素含量達(dá)到96.78%。

圖5 二氫辣椒素單體

正如圖5所示，分離出的二氫辣椒素單體的分析型高效液相色譜圖。從中可以看出，二氫辣椒素單體的保留時間為11.968，二氫辣椒素與降二氫辣椒素以及辣椒素實現(xiàn)完全分離，單體中含有少量的雜質(zhì)，色譜圖中保留時間為1.348、11.86處出現(xiàn)微弱的紫外吸收。二氫辣椒素含量達(dá)到96.64%。

2.2 辣椒素與二氫辣椒素單體的結(jié)構(gòu)確證

2.2.1 辣椒素NMR與IR分析

正如圖1所示，從1H-NMR 可以看出：化學(xué)位移6.86、6.80、6.76可被指認(rèn)為苯環(huán)上的氫。6.86與6.76兩處的氫均為d峰，且偶常數(shù)相等，說明這兩個氫為苯環(huán)16、17號碳上的氫，沒有裂分的6.80處的氫為苯環(huán)13號碳上的氫?；瘜W(xué)位移5.66為與苯環(huán)相連亞甲基(18號碳)上的氫，3.87為19號碳上的甲基氫，0.94為10、13號碳上的兩個甲基氫，5.39～5.27多重峰為碳碳雙鍵上的氫。從13C-NMR可以看出：化學(xué)位移為172.77為1號羰基碳，146.70，145.13，分別為苯環(huán)上連接甲氧基的14號碳和苯環(huán)上連接羥基的15號碳，138.09，130.39分別為支鏈上碳碳雙鍵的7號、8號碳，55.93為19號甲氧基碳，43.53為連接苯環(huán)與酰胺的18號碳，22.63為兩個甲基碳10、11號碳。

辣椒素的紅外光譜數(shù)據(jù)中，3550～3150 cm-1為O-H、N-H伸縮振動吸收，2959、2929、2868 cm-1為甲基和亞甲基C-H伸縮振動吸收，1647 cm-1為酰胺的羰基伸縮振動吸收，1559 cm-1為酰胺的C-N-H彎曲振動吸收，1630 cm-1為碳碳雙鍵的伸縮振動吸收，1601、1516、1460 cm-1為苯環(huán)骨架振動吸收。辣椒素：1H NMR (400 MHz,CDCl3) δ = 6.86 (d,J = 8.0 Hz,1H),6.80 (s,1H),6.76 (d,J = 8.0 Hz,1H),5.66 (s,2H),5.39～5.27 (m,2H),4.35 (d,J = 5.64 Hz,2H),3.87 (s,3H),2.23～2.18 (m,2H),2.01～1.95 (m,2H),1.69～1.61 (m,2H),1.42～1.34 (m,2H),0.94 (d,J = 6.76 Hz,6H)。13C NMR (100 MHz,CDCl3) δ = 172.77,146.70,145.13,138.09,130.39,126.46,120.79,114.36,110.68,55.93,43.53,36.71,32.20,30.95,29.27,25.25,22.63 ppm.FTIR(KBr)ν = 3314,2959,2929,2868,1647,1630,1601,1559,1516,1460,1451,1429,1280,1242,1207,1156,1124,1038,970,802,642 cm-1。

2.2.2 二氫辣椒素NMR與IR分析

正如圖2所示，從1H-NMR 可以看出：化學(xué)位移6.85、6.79、6.74可被指認(rèn)為苯環(huán)上的氫。6.85與6.74兩處的氫均為d峰，且偶常數(shù)相等，說明這兩個氫為苯環(huán)16、17號碳上的氫，沒有裂分的6.79處的氫為苯環(huán)13號碳上的氫?；瘜W(xué)位移5.78為與苯環(huán)相連亞甲基(18號碳)上的氫，3.86為19號碳上的甲基氫，0.85為10、13號碳上的兩個甲基氫。核磁碳譜數(shù)據(jù)中：化學(xué)位移為172.94為1號羰基碳，146.71,145.12,130.35,120.75,114.37,110.70為苯環(huán)上六個碳，其中146.71，145.12，分別表示苯環(huán)上連接甲氧基的14號碳和連接羥基的15號碳，55.90為甲氧基碳上19號碳，43.49為連接苯環(huán)與酰胺的18號碳，22.58為兩個甲基碳10、11號碳。

樣品的紅外光譜數(shù)據(jù)中，3485-3317 cm-1為O-H、N-H伸縮振動吸收，2951、2929、2854 cm-1為甲基和亞甲基C-H伸縮振動吸收，1649 cm-1為酰胺的羰基伸縮振動吸收，1550 cm-1為酰胺的C-N-H彎曲振動吸收，1635、1520、1464 cm-1為苯環(huán)骨架振動吸收。

二氫辣椒素：1H NMR (400 MHz,CDCl3) δ = 6.85 (d,J = 8.0 Hz,1H),6.79 (s,1H),6.74 (d,J = 8.0 Hz,1H),5.78 (s,2H),4.33 (d,J = 5.6 Hz,2H),3.86 (s,3H),2.21～2.17 (m,2H),1.67～1.60 (m,2H),1.54～1.44 (m,1H),1.30～1.25 (m,5H),1.15～1.12 (m,2H),0.85 (d,J = 6.6 Hz,6H)。13C NMR (100 MHz,CDCl3) δ = 172.94,146.71,145.12,130.35,120.75,114.37,110.70,55.90,43.49,38.91,36.83,29.59,29.33,27.90,27.20,25.77,22.58 ppm.FTIR(KBr)ν = 3317,2951,2929,2854,1649,1635,1550,1520,1464,1281,1238,1200,1155,1122,1039,1020,800,719,636 cm-1。

3 結(jié)論

以天然辣椒粉為原料，使用95%乙醇作為提取液，經(jīng)提取，純化得到固態(tài)辣椒類物質(zhì)。以C18為填料，制備自填充柱。固態(tài)辣椒類物質(zhì)經(jīng)過中壓制備液相的進(jìn)行單次色譜分離，得到克級以上的辣椒素單體和二氫辣椒素單體，核磁、紅外確證結(jié)構(gòu)正確，且純度均在96%以上，大于GB/T 21266-2007中辣椒素與二氫辣椒素的標(biāo)準(zhǔn)品純度。該制備方法獲得辣椒素與二氫辣椒素的純度高、可以克級及上規(guī)模生產(chǎn)，進(jìn)一步放大生產(chǎn)研究正在進(jìn)行當(dāng)中。