暴馬桑黃倍半萜合酶基因SbTps1的克隆及表達分析

烏木提?巴合提別克 唐玉倩 王淑婷 李亞偉 鄒莉

摘 要：倍半萜（Sesquiterpenes）在動植物及微生物體內(nèi)廣泛存在，且具有重要的生理調(diào)節(jié)功能。本研究從暴馬桑黃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出1個編碼暴馬桑黃萜類合酶的基因，命名為SbTps1，并對其進行克隆及表達分析，經(jīng)測序該基因全長1 281 bp，編碼426個氨基酸，編碼蛋白的相對分子質(zhì)量為48.17 ku。SDS-PAGE分析結果表明，在相對分子質(zhì)量69.17 ku（包含21 ku標簽蛋白）附近出現(xiàn)與預期大小一致的蛋白條帶。系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析表明，暴馬桑黃SbTps1蛋白和嗜藍孢孔菌Tps蛋白同源性最高;熒光定量分析結果表明，SbTps1基因轉(zhuǎn)錄水平在不同發(fā)育階段有差異性，并且在菌絲發(fā)酵培養(yǎng)第14天時SbTps1基因轉(zhuǎn)錄水平達到最高狀態(tài)，該結果與鮑姆纖孔菌（Inonotus baumii）倍半萜合酶基因的轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢相似，因此可以推測SbTps1與倍半萜合成有關，初步鑒定該基因為倍半萜合酶基因，為后續(xù)暴馬桑黃倍半萜合酶基因功能的研究奠定理論基礎。

關鍵詞：暴馬桑黃;倍半萜;倍半萜合酶基因;基因克隆與序列分析;原核表達;熒光定量

中圖分類號：S567.3??? 文獻標識碼：A?? 文章編號：1006-8023（2021）04-0033-07

Cloning and Function Identification of the Sesquiterpenes Synthase Gene

SbTps1 in Sanghuangporus baumii

WUMUTI Bahetibieke， TANG Yuqian， WANG Shuting， LI Yawei， ZOU Li*

（School of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China）

Abstract：Sesquiterpenes are widely found in plants， animals and microorganisms， and have important physiological regulatory functions. In this study， a gene encoding terpenoid synthase was screened out from the transcriptome database of Sanghuangporus baumii， named SbTps1， and its cloning and expression were analyzed. Sequence analysis showed that the full length of the gene was 1 281 bp， encoding 426 amino acids with a molecular weight of 48.17 ku. The results of SDS-PAGE showed that a protein band of the same size as expected appeared near 69.17 ku （including 21 ku labeled protein）. Phylogenetic tree results showed that SbTps1 protein and TPS protein of Formitiporia mediterranea had the highest homology. Quantitative real-time PCR analysis results showed that SbTps1 gene transcription level had differences in different development stages， and the transcription level of SbTps1 gene reached the highest state on the 14th day of mycelium fermentation culture， which was similar to the transcription level of Inonotus baumii sesquiterpene synthase gene. Therefore， it can be inferred that SbTps1 was related to sesquiterpene synthesis， and the gene was preliminarily identified as a sesquiterpene synthase gene， which laid a foundation for the further study on the function of sesquiterpene synthase gene in Sanghuangporus baumii.

Key words：Sanghuangporus baumii; sesquiterpene; sesquiterpene synthase gene; gene cloning and sequence analysis; prokaryotic expression; quantitative real-time PCR

收稿日期：2021-03-16

基金項目：中央財政林業(yè)科技推廣項目（黑[2021]TG14號）

第一作者簡介：烏木提·巴合提別克，碩士研究生。研究方向為食藥用菌。E-mail： 1053652783@qq.com

*通信作者：鄒莉，博士，教授。研究方向為食藥用菌技術。E-mail： shyj@nefu.edu.cn

引文格式：烏木提·巴合提別克，唐玉倩，王淑婷，等.暴馬桑黃倍半萜合酶基因SbTps1的克隆及功能初步鑒定[J].森林工程，2021，37（4）：33-39.

WUMUTI B， TANG Y Q， WANG S T， et al. Cloning and function identification of the sesquiterpenes? synthase gene SbTps1 in Sanghuangporusbaumii[J]. Forest Engineering，2021，37（4）：33-39.

0 引言

桑黃（Sanghuangporus spp.）為擔子菌亞門（Ba-sidiomcota）真菌[1]。因多生長于桑屬植物上，且其子實體多呈黃褐色，而得名為“桑黃”。據(jù)相關文獻資料記載，桑黃具有降血糖[2]、抗氧化[3]、治療腫瘤[4]和提高免疫力[5]等藥效。桑黃具有豐富的生物學功效，是因為其內(nèi)部含有萜類、多糖等成分[6]。萜類在很多生物中已經(jīng)被證明具有廣泛的藥理活性[7-8]，桑黃萜類成分包括倍半萜、二萜和三萜等化合物，其中倍半萜類化合物種類最多。目前國內(nèi)外已有大量研究證明倍半萜具有較高的利用價值，如Wawrzyn等[8]發(fā)現(xiàn)擔子菌Omphalotus olearius合成的揮發(fā)性萜類物質(zhì)illudin S在抗癌、抗腫瘤等方面具有顯著的效果;倍半萜類衍生物青蒿素是我國首先發(fā)現(xiàn)的一種新抗瘧藥，具有毒性低、見效快的特點[9-10]，由此可知倍半萜對人類生命和健康都很有益。

暴馬桑黃是生長于暴馬丁香（Syringa reticulata var. amurensis）樹上的一種大型真菌，倍半萜是其重要活性成分之一，是經(jīng)過MVA途徑合成的一種萜類化合物[11-12]。另外，由于倍半萜合酶的多樣性決定倍半萜化合物的多樣性，導致運用化學方法合成倍半萜極為困難，因此通過分子克隆、基因編輯等方式研究其合成途徑中的關鍵酶基因，從而提高倍半萜產(chǎn)量，不失是一種科學可行的方法。

倍半萜合酶基因在倍半萜生物合成和代謝過程中具有重要的意義[13]。桑黃倍半萜類化合物含量的多少受到倍半萜合酶基因的調(diào)控，然而關于桑黃倍半萜生物合成途徑中關鍵酶基因的研究卻鮮有報道。本文從暴馬桑黃（Sanghuangporus baumii）中克隆了一個倍半萜合酶基因，并對其進行生物信息學分析和功能研究，從而為研究SbTps1基因在倍半萜合成途徑中的功能提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株與載體

本試驗所用的桑黃菌種經(jīng)ITS（intemal transcribed spacer）鑒定為暴馬桑黃（NCBI登錄號為KP974834），命名為暴馬桑黃DL101、大腸桿菌（Escherichia coli）克隆菌株Top10，表達菌株BL21（DE3）和原核表達載體 pET-32a（+）于東北林業(yè)大學森林保護學科實驗室保藏。

1.2 試驗試劑

QuickCut EcoR I、QuickCut Hind Ⅲ、Premix Taq酶、TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）、5×In-Fusion HD試劑盒、Prime ScriptⅡ1ST、Strand cDNA Synthesis Kit和Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）均購自大連Takara公司。植物總RNA提取試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購于北京天根生化公司。質(zhì)粒提取試劑盒購于上海Omega公司。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodiumdodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒購自北京索萊寶公司。

1.3 試驗引物

用于SbTps1基因克隆、檢測及原核表達的引物序列見表1。

1.4 目的片段的克隆

采用植物總RNA提取試劑盒提取暴馬桑黃總RNA，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，SbTps1-F1、SbTps1-R1為引物進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行純化回收，并檢測回收產(chǎn)物濃度。回收產(chǎn)物送至哈爾濱擎科生物公司測序。

1.5 SbTps1基因序列分析

利用在線軟件預測SbTps1基因開放閱讀框（Open reading frame，ORF），并參考相關文獻對SbTps1蛋白理化特性（ExPASy Proteomics Server）、蛋白質(zhì)結構（SPOMA）、跨膜區(qū)（TMHMM）、信號肽（SignalP3.0）以及系統(tǒng)發(fā)育（MEGA6.0）進行預測和分析 [14-15]。

1.6 原核表達載體的構建

對pET-32a質(zhì)粒進行雙酶切（Quick Cut EcoRⅠ和Quick Cut Hind Ⅲ），以DNA回收試劑盒純化回收酶切產(chǎn)物。將純化后的基因片段SbTps1和線性化的pET-32a質(zhì)粒以In-Fusion HD 試劑盒進行重組，將得到的pET-32a-SbTps1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞。提取大腸桿菌Top10中轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒，將PCR檢測正確的陽性質(zhì)粒送至哈爾濱擎科生物公司測序。

1.7 重組蛋白的誘導表達和檢測

將pET-32a-SbTps1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞后，采用引物pET-32a-F2、pET-32a-R2（表1）對大腸桿菌 BL21（DE3）菌落進行PCR檢測，將陽性菌落接到LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL Amp）中過夜振蕩培養(yǎng)，取50 μL菌液加入50 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL Amp）中振蕩培養(yǎng)，當OD600達到0.6～0.8時收集菌液做對照，然后加入IPTG（濃度為1 mmol/L）誘導表達，收集不同誘導時間的菌液進行SDS-PAGE檢測。

1.8 轉(zhuǎn)錄水平分析

參照孫婷婷[16]的方法培養(yǎng)不同階段的液體菌種、子實體及原基，之后各時間段分別提總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以表1的α-tubulin為內(nèi)參基因，qRT-PCR做3個重復。參考Livak等[17]的方法計算SbTps1基因的轉(zhuǎn)錄水平。

2 結果和分析

2.1 目的片段的克隆

以暴馬桑黃菌種菌絲cDNA為模板，SbTps1-F1和SbTps1-R1為引物用RT-PCR技術獲得SbTps1基因cDNA全長序列。擴增出的條帶大小為1 281 bp，與預期的目的片段長度一致，條帶清楚且特異性強。如圖1所示。

2.2 SbTps1基因生物信息學分析結果

2.2.1 理化性質(zhì)分析結果

SbTps1基因ORF序列及對應翻譯的氨基酸序列如圖2所示，據(jù)分析得到SbTps1基因cDNA序列全長為1 281 bp，編碼426個氨基酸，蛋白相對分子量為48.17 ku，理論等電點5.41，氨基酸含量最高的是亮氨酸Leu（40%），

含量最低的是色氨酸Trp （1.6%），疏水性指標為-0.269，不穩(wěn)定指數(shù)46.70，大于40，預測該蛋白是一個不穩(wěn)定蛋白。通過NCBI的Conserved domains程序比對，得出該序列與Terpene-Cyclase-Nonplant-C1具有較高的相似性，且含1個超家族Isoprenoid-Biosyn-C1保守區(qū)，E-value值為1.36×10-42，可以推斷此蛋白與暴馬桑黃中的倍半萜的環(huán)化相關，結果如圖3所示。

2.2.2 蛋白性質(zhì)的預測分析

用TMHMM預測跨膜結構，發(fā)現(xiàn)SbTps1蛋白無跨膜結構，結果如圖4所示;用SignalP預測信號肽，發(fā)現(xiàn)該蛋白無信號肽，結果如圖5所示;用SPOMA對SbTps1蛋白結構預測結果為：該蛋白由α螺旋狀態(tài)、延伸鏈、轉(zhuǎn)角狀態(tài)和無規(guī)則卷曲等狀態(tài)組成的蛋白，其中含有49.77%的α螺旋、8.45%延伸鏈、1.41%的轉(zhuǎn)角區(qū)和40.38%無規(guī)則卷曲狀態(tài);使用Swiss-Model預測SbTps1蛋白的3級結構，結果顯示SbTps1蛋白3級結構模型是以Epi-isozizaene synthase 蛋白結構（6ofv.1.A）為模板構建的（圖6）。

2.2.3 SbTps1基因系統(tǒng)發(fā)育分析

系統(tǒng)發(fā)育分析結果如圖7所示，由進化樹可以看出暴馬桑黃Tps蛋白和嗜藍孢孔菌Tps蛋白同源性最高，相似度達到了87.68%，可能是因為二者均是多孔菌，親緣關系較近，可以進一步確認克隆出的基因為Tps基因。

2.3 重組質(zhì)粒的構建

將SbTps1基因片段和線性化的pET-32a質(zhì)粒重組后，得到pET-32a-SbTps1重組質(zhì)粒。以pET-32a-F2、pET-32a-R2（表1）為引物進行PCR擴增檢測。結果顯示在2 000 bp（1 281 bp目的基因+上下游引物之間的堿基712 bp）附近出現(xiàn)特異條帶，特異條帶大小符合預期（圖8）。通過分析陽性質(zhì)粒測序后得到電子序列可知重組質(zhì)粒構建成功。

2.4 SbTps1基因原核表達結果分析

將重組質(zhì)粒pET-32a-SbTps1轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞后，采用IPTG為誘導物進行誘導，SDS-PAGE結果顯示如圖9所示，在相對分子質(zhì)量為69. 17 ku（包含21 ku標簽蛋白）附近位置出現(xiàn)了特異蛋白帶并符合預期大小，且隨著誘導時間的增多蛋白量也增多。該結果可以說明重組質(zhì)粒pET-32a-SbTps1構建成功并能成功表達目的SbTps1蛋白。

2.5 不同發(fā)育階段暴馬桑黃SbTps1基因轉(zhuǎn)錄水平變化

以SbTps1-F3、SbTps1-R3為引物（表1），采用熒光定量（qRT-PCR）技術檢測SbTps1相對表達量在不同發(fā)育時期的變化趨勢，結果如圖10所示，SbTps1基因相對表達量在不同發(fā)育時間呈動態(tài)變化。在培養(yǎng)到8 d時SbTps1基因的轉(zhuǎn)錄水平逐漸上升，隨后開始下降，在第14 d時明顯上升達到最高，與其他時期呈現(xiàn)顯著性差異，而原基和子實體時期又維持在相對較低的水平，在原基階段基因相對表達量達到最低值，僅是14 d的7.62%。

3 討論

倍半萜合酶基因是倍半萜合成途徑中的關鍵基因。自從煙草中的倍半萜合酶基因被克隆[18]，陸續(xù)有包括黃花蒿、冷杉、天仙子和靈芝等30余個種物種倍半萜合酶基因被克隆和研究[19]。且有研究表明，通過基因工程技術調(diào)控次生代謝產(chǎn)物合成途徑中關鍵酶基因的表達水平，可以提高其次生代謝物的產(chǎn)量。Chen等[20]通過過表達青蒿中的法尼基焦磷酸合酶基因，使青蒿素的含量提高4倍。

系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析Tps蛋白結果顯示，暴馬桑黃與嗜藍孢孔菌（Formitiporia mediterranea）相似性較高，與其他真菌萜類合酶蛋白聚為一支。同時，通過NCBI比對發(fā)現(xiàn)，該蛋白與Agrocybe aegerita（A0A5Q0QU70.1）倍半萜合酶蛋白有64.66%的相似度，與Clitopilus sp.（BBH51500.1）倍半萜合酶蛋白相似度達66.09%。

通過SbTps1基因ORF序列推測得到氨基酸序列，對其信號肽、跨膜結構區(qū)進行預測，結果表明該序列不具有信號肽和疏水的跨膜區(qū)。該結果與靈芝倍半萜合酶蛋白和鮑姆纖孔菌倍半萜合酶蛋白結果一致[19，21]，說明暴馬桑黃倍半萜合酶蛋白的結構與靈芝和鮑姆纖孔菌倍半萜合酶蛋白存在著一定相似性。

與紫芝[13]、靈芝[19]、鮑姆纖孔菌[21]等真菌相同，SbTps1基因在大腸桿菌中能夠?qū)崿F(xiàn)異源表達。通過SDS-PAGE表達分析，可以看出SbTps1蛋白產(chǎn)量高，表明SbTps1基因在原核表達系統(tǒng)中具有良好的表達效果，在后續(xù)的試驗中，將對SbTps1蛋白進行提取純化，研究其酶學特性等功能。

為檢測SbTps1基因在暴馬桑黃中的表達水平，利用不同發(fā)育階段材料進行熒光定量檢測[22]。結果發(fā)現(xiàn)SbTps1基因轉(zhuǎn)錄水平在不同發(fā)育階段差異較大，在原基與子實體中該基因轉(zhuǎn)錄水平較低，說明在這2個階段SbTps1基因并不活躍。菌絲發(fā)酵培養(yǎng)第14 天時SbTps1基因表達量達到峰值，與其他時期呈現(xiàn)顯著性差異，其轉(zhuǎn)錄水平與張國權[21]報道的鮑姆纖孔菌中倍半萜合酶代謝途徑中的基因轉(zhuǎn)錄水平變化趨勢相似，在大多時期都處于相對較低水平，在某一時期會顯著升高，初步鑒定克隆到的SbTps1基因為倍半萜合酶基因，該推測還有待通過轉(zhuǎn)基因試驗進一步研究。試驗結果可為研究倍半萜合成途徑鑒定基礎，同時為培育高產(chǎn)量暴馬桑黃倍半萜菌株打下理論基礎。

【參 考 文 獻】

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