山新楊PdPapGH12基因克隆及其響應(yīng)脅迫的組織表達(dá)

李素 陳芳 殷緣 田廣宇 陳曉璇 王天真 范諾 ABDUL WAHID BALOCH 張榮沭

摘 要：為篩選林木抗性基因，培育高抗轉(zhuǎn)基因林木，以山新楊（Populus davidiana × P. alba var.pyramidlis）為試材，采用RT-PCR技術(shù)克隆獲得1 560 bp的PdPapGH12（Potri.004G109200.1）基因cDNA，生物信息學(xué)分析表明該基因編碼519個(gè)氨基酸，該蛋白屬于親水性酸性蛋白。依據(jù)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果推測(cè)其在胞內(nèi)發(fā)揮水解的作用。蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)PdPapGH12與4個(gè)楊樹品種的9條GHs序列具有高度一致性。qRT-PCR分析顯示，PdPapGH12在莖基、老葉和根中表達(dá)量更高。并發(fā)現(xiàn)200 mmol/L NaCl、pH為10的Na2CO3溶液和聚乙二醇6000（PEG 6000;質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%）脅迫48 h其在莖尖、葉和根中均上調(diào)表達(dá);5種植物致病病原真菌脅迫48 h均使其在莖尖的表達(dá)下調(diào)。只有核盤菌使其在葉中表達(dá)顯著上調(diào);尖孢鐮刀菌、鏈格孢菌和立枯絲核菌使其在根內(nèi)表達(dá)顯著上調(diào)。受激素誘導(dǎo)48 h，ABA（100 μmol/L）僅使其在根部表達(dá)上調(diào);SA（100 μmol/L）僅使其在葉中表達(dá)上調(diào)，而JA（100 μmol/L）使其在葉和根中的表達(dá)均上調(diào)。結(jié)果表明PdPapGH12參與植物抵抗逆境脅迫和激素誘導(dǎo)的信號(hào)途徑。

關(guān)鍵詞：糖苷水解酶;非生物脅迫;生物脅迫;激素誘導(dǎo);qRT-PCR

中圖分類號(hào)：Q786? ????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A?? 文章編號(hào)：1006-8023（2021）04-0011-11

Cloning of PdPapGH12 Gene of Shanxin Poplar

（Populus davidiana × P. alba var. pyramidlis） and Its Tissue

Expression in Response to Stress

LI Su1， CHEN Fang1， YIN Yuan1， TIAN Guangyu1， CHEN Xiaoxuan1， WANG Tianzhen1，

FAN Nuo1， ABDUL WAHID BALOCH2， ZHANG Rongshu1*

（1.College of Landscape Architecture， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China;

2.Department of Plant Breeding and Genetics， Sindh Agriculture University， Tandojam 70060， Pakistan）

Abstract：In order to screen for the resistance genes of trees and cultivate transgenic trees with high resistance， Shanxin Poplar （Populus davidiana × P. alba var. pyramidlis） was used as the test material， and the 1 560 bp cDNA of the PdPapGH12 （Potri.004G109200.1） gene was cloned by RT-PCR. Bioinformatics analysis showed that PdPapGH12 encoded a protein of 519 amino acids， and the PdPapGH12 protein was a hydrophilic acidic protein. According to the prediction results of the subcellular localization of PdPapGH12， it might play a role in the hydrolysis reactions in the cytoplast. Protein structure analysis showed that PdPapGH12 shared high similarity with nine other GHs of four poplar varieties. RT-qPCR analysis showed that PdPapGH12 was relatively highly expressed in the stem base， old leaves and roots. Salt （NaCl， 200 mmol/L）， alkali （Na2CO3 solution， pH=10） and PEG 6000 （Polyethylene glycol 6000; 30%） treatments for 48 hours could induce the up-regulation of PdPapGH12 in the apex， mature leaf and root. PdPapGH12 expression in the apex was down-regulated by the inducing of five plant pathogenic fungi for 48 hours. Only Sclerotinia sclerotiorum induction significantly upregulated the expression of PdPapGH12 in mature leaves. Fusarium oxysporum， Alternaria alternate and Rhizoctonia solani induction significantly increased PdPapGH12 expression in the roots. After 48 hours of phytohormone induction， ABA （100 μmol/L） only upregulated PdPapGH12 expression in the roots. SA （100 μmol/L） only upregulated PdPapGH12 expression in mature leaves， while JA （100 μmol/L） upregulated PdPapGH12 expression in both the mature leaves and roots. This study demonstrated that PdPapGH12 had a role in poplar's resistance against environmental stresses and responses to phytohormone induction.

Keywords：Glycoside hydrolase; abiotic stress; biotic stress; hormone induce; RT-qPCR

收稿日期：2021-03-13

基金項(xiàng)目：2019年國家級(jí)本科生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（201910225087）;國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31370642）

*通信作者：張榮沭，博士，副教授。研究方向?yàn)閳@林植物種質(zhì)資源及植物病害生物防治。E-mail：? zrs6504@sina.com

引文格式：李素， 陳芳， 殷緣， 等. 山新楊PdPapGH12基因克隆及其響應(yīng)脅迫的組織表達(dá)[J]. 森林工程，2021，37（4）：11-21.

LI S， CHEN F， YIN Y， et al. Cloning of PdPapGH12 Gene of Shanxin Poplar （Populus davidiana × P. alba var. pyramidlis） and its tissue expression in response to stress[J]. Forest Engineering，2021，37（4）：11-21.

0 引言

我國實(shí)施退耕還林政策以來，植樹造林工程、天然林保護(hù)工程等相關(guān)事項(xiàng)愈發(fā)受到行業(yè)重視[1]。楊樹因其物種資源豐富，分布廣泛，具有生長(zhǎng)迅速、繁殖率高、樹干筆直和枝繁葉茂遮陰效果好等特點(diǎn)，作為綠化樹種能起到水土保持、防風(fēng)固沙和改善環(huán)境的作用;又因其生長(zhǎng)期短、出材率高還可作為經(jīng)濟(jì)樹種起到促進(jìn)地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展的作用[2-4]。因此，開展提高楊樹抗逆性的相關(guān)研究，一方面有利于推進(jìn)生態(tài)環(huán)保事業(yè)發(fā)展，另一方面對(duì)促進(jìn)經(jīng)濟(jì)產(chǎn)值的提高有重要的意義。

β-葡萄糖苷酶（又稱為β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，β-D-glueosidase， E.C.3.2.1.21），是纖維素酶的一個(gè)重要組成部分，能水解結(jié)合于末端、非還原性的β-D-糖苷鍵，同時(shí)釋放β-D-葡萄糖及相應(yīng)的配基[5-6]。根據(jù)氨基酸序列，β-葡萄糖苷酶目前可被劃分為糖苷水解家族GH1、GH3、GH5、GH9和GH30[7-10]。GH1、GH5和GH30均屬于GH-A（clan GH-A），結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是擁有（β/α）8桶狀結(jié)構(gòu)，其β折疊結(jié)構(gòu)中C端的第4位和第7位的Glu殘基是它的活性位點(diǎn)[11-12]，一個(gè)作為質(zhì)子供體，一個(gè)作為親核集團(tuán)參與催化反應(yīng)，分別催化酸堿和親核試劑[13，15]。糖苷水解酶家族1（GH1）β-葡萄糖苷酶由大量基因編碼，參與植物的許多發(fā)育過程和脅迫反應(yīng)，不僅參與防御病原體及其他食草動(dòng)物的侵害[15]，響應(yīng)滲透脅迫[5，16] ，被生物或非生物脅迫所誘導(dǎo)[16-17];還能參與植物激素的激活[18]、細(xì)胞壁的木質(zhì)化[19]和植物的次級(jí)代謝[20]等多種途徑。由于GH1β-葡萄糖苷酶在植物生長(zhǎng)和發(fā)育中的重要性，已經(jīng)在多種植物中被克隆和分析。

山新楊是以山楊（P. davidiana）為母本、新疆楊（P. alba var. pyramidalis）為父本雜交得到的優(yōu)良樹種，生長(zhǎng)速度較快，適應(yīng)性強(qiáng)，抗逆性好，果序自然脫落不飛絮，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值。迄今為止，有關(guān)山新楊（GH1）β-葡萄糖苷酶的生物信息學(xué)分析、組織表達(dá)模式和生物脅迫應(yīng)答的相關(guān)研究未見報(bào)道。本研究團(tuán)隊(duì)已具備山新楊良好的遺傳轉(zhuǎn)化體系[21-22]?；跇?gòu)建的山新楊與植物益生菌棘抱木霉和致病菌鏈格孢菌互作的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，獲得一條特異表達(dá)基因Potri.004G109200.1 v3.1的cDNA全長(zhǎng)序列，該基因具有完整的Glycosyl hydrolase family 1（PF00232）功能域，在Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTx比對(duì)，與已命名的楊樹GH12一致性最高，將其命名為PdPapGH12。在此基礎(chǔ)上擬對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。利用RT-qPCR（Real-time Quantitative polymerase chain reaction）技術(shù)揭示PdPapGH12在莖尖、葉、莖和根中的表達(dá)模式，以此為基礎(chǔ)進(jìn)一步研究山新楊根部進(jìn)行鹽、堿和高滲透壓脅迫，接種5種植物土傳病害病原菌或植物激素誘導(dǎo)48 h后，PdPapGH12的組織表達(dá)變化，為進(jìn)一步揭示此基因的調(diào)控功能和進(jìn)行山新楊基因工程改良育種獲得高抗山新楊新品種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植物：山新楊組培苗由本實(shí)驗(yàn)室保存。繼代培養(yǎng)培養(yǎng)基為WPM（Woody Plant Medium）+NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L;生根培養(yǎng)為WPM+IBA 0.4 mg/L。 在人工氣候箱中培養(yǎng)和完成各種處理。

供試微生物：核盤菌NECC20005（Sclerotinia sclerotiorum NECC20005）、立枯絲核菌NECC20006（Rhizoctonia solani NECC20006）、尖孢鐮刀菌NECC20007（Fusarium oxysporum NECC20007），由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)劉志華教授贈(zèng)予;金黃殼囊孢菌C29（Cytospora chrysosperma C29）由東北林業(yè)大學(xué)宋瑞清教授贈(zèng)予;鏈格孢菌NECCFP002（Alternaria alternate NECCFP002）由本實(shí)驗(yàn)室分離保藏。

1.2 方法

1.2.1 PdPapGH12基因的PCR擴(kuò)增及測(cè)序

基于本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的山新楊與棘抱木霉菌和鏈格孢菌互作的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（北京，百邁客公司），采用Gang等[23]的方法進(jìn)行有參轉(zhuǎn)錄組差異基因表達(dá)分析。經(jīng)篩選獲得特異表達(dá)基因Potri.004G109200.1的cDNA全長(zhǎng)序列。依據(jù)此序列信息，利用Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計(jì)克隆該基因的全長(zhǎng)引物（表1），采用CTAB裂解法提取山新楊葉片總RNA。并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser， TaKaRa）合成cDNA。以cDNA為模板，TaKaRa Primer STAR Max DNA Polymerase為反應(yīng)試劑，使用表1中PdPapGH12的“PdPapGH12-F”和“PdPapGH12-R”引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，條件為：98 ℃預(yù)變性3 min;98 ℃變性10 s，60 ℃退火8 s，72 ℃延伸5 s，共35個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸2 min。將擴(kuò)增片段進(jìn)行純化，并按照說明書將其連接到pMD18-T載體上，送交哈爾濱市擎科嘉美生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 PdPapGH12基因的生物信息學(xué)分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫的ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析PdPapGH12的開放讀框長(zhǎng)度;利用ExPASy網(wǎng)站中ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析PdPapGH12的氨基酸組分及理化性質(zhì)。利用NCBI的BLASTx程序（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）比對(duì)獲得PdPapGH12同源蛋白序列;利用NCBI的Conserve Domains（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測(cè)蛋白保守區(qū);運(yùn)用PsortⅡ prediction（http：//psort.hgc.jp/form2.html）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè);利用TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)PdPapGH12蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域;利用Prot Scale（http：//web.expasy.org/protscale/）進(jìn)行PdPapGH12蛋白疏水性分析。利用MEME軟件（https：//meme-suite.org/meme/）對(duì)PdPapGH12同源序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，應(yīng)用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）在線預(yù)測(cè)PdPapGH12蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，并用Mega6.0軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建進(jìn)化樹（Bootstrap=1000）。

1.2.3 PdPapGH12基因在組織中的差異表達(dá)量分析

無菌條件下，生長(zhǎng)在固體WPM培養(yǎng)基上的山新楊4周齡組培苗轉(zhuǎn)接到含有12 mL液體WPM培養(yǎng)基的試管中進(jìn)行生根培養(yǎng)2周。培養(yǎng)條件為：溫度23 ℃，濕度40%，16 h/8 h（光/暗）。分別收集組培生根苗頂芽（芽、未展開葉及莖為ST）、幼莖（帶有第1和第2完全展開葉片的 2個(gè)節(jié)間為S1），S1上的2片嫩葉為L(zhǎng)1;莖最下邊2個(gè)節(jié)間為S3，S3上的2片葉為L(zhǎng)3;莖中部的2個(gè)節(jié)間為 S2，S2上的2片葉為L(zhǎng)2;還有根（R）等。將樣品包好后迅速置于液氮中，然后置于-80 ℃冰箱中，用于提取總RNA及分析PdPapGH12基因在不同組織中的表達(dá)量。

1.2.4 PdPapGH12基因在非生物、生物脅迫及激素誘導(dǎo)下組織表達(dá)量分析

無菌條件下將6周齡山新楊組培苗（不定根長(zhǎng)度為10～20 cm）分別置于含有NaCl（200 mmol/L）、Na2CO3溶液（pH為10）和含有聚乙二醇6000（Polyethylene glycol，PEG6000）30%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的液體WPM培養(yǎng)基中，進(jìn)行鹽、堿和高滲透壓3種非生物脅迫實(shí)驗(yàn)。處理48 h后，分別收集S（莖）、L2（成熟葉）和R（根）部位樣品。

無菌條件下將活化后的5種植物土傳致病真菌接種到PDA培養(yǎng)基中，在26 ℃條件下培養(yǎng)10 d獲得大量分生孢子或菌絲體。細(xì)致刮取立枯絲核菌PDA培養(yǎng)基（1 cm×4 cm×3塊）上的菌絲溶于WPM液體培養(yǎng)基中制備菌絲體懸浮液。其他4種真菌用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，計(jì)算分生孢子懸浮液濃度，備用。再將6周齡組培苗的根部分別接種尖孢鐮刀菌、核盤菌、金黃殼囊孢菌和鏈格孢菌分生孢子，使其終濃度為1×105 cfu/mL?；蚪臃N已配制的立枯絲核菌的菌絲體。接種48 h后，分別收集S、L2和R部位樣品。

無菌條件下將6周齡山新楊組培苗分別置于含有100 μmol/L ABA（abscisic acid）、JA（jasmonic acid）或 SA（salicylic acid）的液體WPM培養(yǎng)基中，處理48 h后，分別收集S、L2和R部位樣品。

上述樣品以同齡非處理山新楊組培苗為對(duì)照，分別分析PdPapGH12基因在3種非生物脅迫、5種生物脅迫和3種激素誘導(dǎo)下的組織差異表達(dá)量。每實(shí)驗(yàn)組設(shè)3株苗，每處理3次重復(fù)。

1.2.5 RT-qPCR 分析

收集的山新楊各個(gè)樣品采用CTAB法提取總 RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa）參照說明書合成cDNA。以cDNA為模板，利用北京全式金生物公司（TransGen Biotech）的TransStart Top Green qPCR SuperMix 酶和羅氏公司的熒光定量 RT-qPCR 儀器（LightCycler 96;Roche）進(jìn)行熒光定量 RT-qPCR 反應(yīng)。3個(gè)內(nèi)參基因及其 GenBank 登錄號(hào)分別為：PdPapACT2（MN196665）、PdPapEF1-α（MN196666）和 PdPapTub（MN196667）?；虻囊镄蛄幸姳?1。實(shí)時(shí)定量 qPCR 的反應(yīng)體系為：20 μL（2×Taq Master Mix 10 μL;10 μmol/L雙向引物各0.8 μL;模板2 μL;DEPC處理水6.4 μL）。為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性，對(duì)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的樣品進(jìn)行了 3個(gè)技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)程序：為95 ℃預(yù)變性10 min;94 ℃變性5 s，59 ℃退火15 s， 45個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 s。熔解曲線按照95℃ 10 s，65℃ 60 s，97℃ 1 s進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔCt方法[24]對(duì)無誘導(dǎo)條件下山新楊PdPapGH12基因在不同組織部位的組成型表達(dá)和不同誘導(dǎo)條件下不同組織部位的表達(dá)進(jìn)行計(jì)算，Ct代表每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，該方法計(jì)算所得的結(jié)果為PdPapGH12基因相對(duì)于3個(gè)內(nèi)參基因的平均表達(dá)水平的相對(duì)表達(dá)量。使用Microsoft Office Excel 2007軟件包和SPSS 19統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、作圖和分析。對(duì)同一時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)組之間的差異顯著性進(jìn)行ANOVA分析，在P<0.05下比較差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PdPapGH12基因序列分析

測(cè)序結(jié)果獲得的PdPapGH12基因序列長(zhǎng)度為1 560 bp。該基因編碼蛋白的起始密碼子在第1個(gè)氨基酸處，終止密碼子在第519個(gè)氨基酸處，編碼519個(gè)氨基酸，如圖1（a）所示。具有完整的Glyco_hydro（pfam00232， Glycosyl hydrolase superfamily member）保守域，位于PdPapGH12的第11至483氨基酸之間（E= 1.48×10-176），如圖1 （b）所示。PdPapGH12編碼蛋白分子式為C2687H4004N720O798S15，相對(duì)分子質(zhì)量為59 643，理論等電點(diǎn)為5.83，屬于酸性、親水性穩(wěn)定蛋白。無跨膜結(jié)構(gòu)，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析表明其在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)中的分布情況分別占17.4%、69.6%。由此可以初步推測(cè)PdPapGH12在胞內(nèi)發(fā)揮水解的作用。

2.2 PdPapGH12蛋白的結(jié)構(gòu)特性分析

對(duì)山新楊PdPapGH12蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的結(jié)果表明，該蛋白主要由無規(guī)則卷曲與 α-螺旋構(gòu)成，其中無規(guī)則卷曲占 41.81%、α螺旋占 34.87%、β-轉(zhuǎn)角占 7.32%、延伸鏈占 15.99%。

對(duì)PdPapGH12蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果可見，共比對(duì)上50個(gè)模板，在GMQE值最大為0.82的條件下，該蛋白與模型3gno.1.A的Identity較高，為53.04%;coverage為0.92，范圍在6～484氨基酸處。此模型為水稻β-葡萄糖苷酶（Beta-glucosidase，Os03g0212800）蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，如圖2（a）所示。

在Genbank數(shù)據(jù)庫中利用BLASTx進(jìn)行序列搜索，獲得9條（來源于4個(gè)楊樹品種）與PdPapGH12一致性最高的GHs序列（Total Score >1 030; Query Cover >99%; E =0.0; Ident >97%），將PdPapGH12與此9條GHs蛋白序列進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果顯示：這10條蛋白序列均具有位置靠近N端高度保守的3個(gè)基序，如圖2（b）所示。第1個(gè)基序位于31—80處，第2個(gè)（位于146—195）與第3個(gè)（位于202—251）基序相隔很近，靠近N端的2個(gè)保守基序一個(gè)是催化結(jié)構(gòu)域，功能是催化酸堿和親核試劑;一個(gè)是結(jié)合結(jié)構(gòu)域，功能是將酶分子連到纖維素上[5]。采用MEGA軟件NJ法構(gòu)建PdPapGH12和與9條同源基因遺傳進(jìn)化樹，如圖2（c）所示，將進(jìn)化樹分為2組。第I組只包括毛果楊（P. trichocarpa）中的4個(gè)和毛白楊（P. tomentosa）中的2個(gè)β-葡萄糖苷酶，第Ⅱ組含有新疆楊（P. alba）中1個(gè)、山新楊中1個(gè)和毛白楊中的2個(gè)β-葡萄糖苷酶。在NCBI數(shù)據(jù)庫中通過BLASTx比對(duì)得到的9條與PdPapGH12相似GH蛋白中，新疆楊的GH與PdPapGH12親緣關(guān)系最近。

2.3 PdPapGH12在莖尖、莖、葉和根組織中的表達(dá)分析

采用qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行基因表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，山新楊PdPapGH12在莖尖、莖、葉和根中均有表達(dá)，如圖3所示。其在R中的表達(dá)量最高，S1中的表達(dá)量最低，R中的表達(dá)量是S1的332.86倍（P<0.05）。莖尖部位ST的表達(dá)量是S1的3.6倍，葉組織L1、L2和L3的表達(dá)量分別是S1的6.4、6.7和9.3倍。在莖S2和S3中的表達(dá)量分別是S1的1.8和28.6倍。

2.4 脅迫處理對(duì)PdPapGH12的組織表達(dá)變化分析

2.4.1非生物脅迫下PdPapGH12在莖尖、葉和根中的表達(dá)變化

采用NaCl、Na2CO3和PEG溶液模擬山新楊在鹽、堿或干旱（高滲透壓）等非生物脅迫條件下PdPapGH12的組織差異表達(dá)變化。由圖4可見：在莖尖、成熟葉和根組織中，鹽脅迫組、堿脅迫組、高滲透壓脅迫下PdPapGH12表達(dá)量均為上調(diào)，在莖尖部位中分別為對(duì)照的8.66、2.46、2.68倍;在成熟葉中，分別為對(duì)照的4.83、2.08、1.95倍;而在根中分別為對(duì)照的19.15、62.48、6.11倍。

2.4.2 生物脅迫下PdPapGH12在莖尖、葉和根中的表達(dá)變化

山新楊組培苗根部接種5種植物土傳致病真菌48 h后，在莖尖部位，由于根部接種Fo、Cc、Ss、Aa和Rs等真菌致病菌，PdPapGH12表達(dá)量均為下降，分別為對(duì)照的0.20、0.16、0.44、0.31、0.06倍;其中Rs菌對(duì)PdPapGH12表達(dá)量的影響最大，如圖5所示。

在成熟葉中，只有根部接種Ss菌使PdPapGH12表達(dá)量上調(diào)，為對(duì)照的37.37倍，而其余真菌均使得PdPapGH12表達(dá)量下降，其中接種Fo菌使PdPapGH12表達(dá)量最低，為對(duì)照組的0.03倍，如圖5所示。

在根組織中，接種Cc菌和Ss菌使PdPapGH12表達(dá)量均為下降，分別為對(duì)照的0.41、0.13倍，而接種Fo菌、Aa菌和Rs菌均使得PdPapGH12表達(dá)量上調(diào)，其中接種Fo菌使其上調(diào)量最大，為對(duì)照的577.47倍。

2.4.3 激素 SA、JA 和 ABA 誘導(dǎo)下PdPapGH12在莖尖、葉和根中的表達(dá)變化

在3種植物激素誘導(dǎo)48 h后，山新楊PdPapGH12基因的組織表達(dá)量發(fā)生不同的變化，如圖6所示。在莖尖部位，受根部JA、SA和ABA誘導(dǎo)，PdPapGH12表達(dá)量均為下降，分別為對(duì)照的0.14、0.33、0.19倍;在成熟葉中，根部ABA誘導(dǎo)使PdPapGH12表達(dá)量下降，為對(duì)照的0.37倍，受根部JA和SA誘導(dǎo)PdPapGH12表達(dá)量均為上調(diào)，分別為對(duì)照的1.18和20.26倍。在根組織中，JA和ABA誘導(dǎo)使PdPapGH12表達(dá)量均為上調(diào)，分別為對(duì)照的18.55和8.79倍，SA誘導(dǎo)使其表達(dá)量下降，為對(duì)照的0.47倍。

3 討論與結(jié)論

β-葡萄糖苷酶在植物中廣泛存在，并且發(fā)揮出多種功能，對(duì)生物體的生理代謝有重要作用。不僅參與防御病原體及其他食草動(dòng)物的侵害，還能響應(yīng)滲透脅迫、被生物或非生物脅迫誘導(dǎo)，參與植物激素的激活、細(xì)胞壁的木質(zhì)化和植物的次級(jí)代謝等多種途徑[17-18，20，25-26]。在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）和毛果楊中已分別發(fā)現(xiàn)48、40和46個(gè)GH1β-葡萄糖苷酶基因，對(duì)擬南芥和水稻中β-葡萄糖苷酶在多種脅迫條件下的表達(dá)譜已見報(bào)道[5]，然而，有關(guān)GH1β-葡萄糖苷酶基因在木本植物中的表達(dá)模式研究相對(duì)很少，對(duì)山新楊PdPapGH基因在脅迫條件下的表達(dá)模式未見報(bào)道。因此，在山新楊中克隆GH1新基因并研究其組織表達(dá)特異性和在多種逆境脅迫下的調(diào)控規(guī)律具有創(chuàng)新性。

基于本團(tuán)隊(duì)獲得的特異表達(dá)基因Potri.004G109200.1 v3.1在毛果楊基因組數(shù)據(jù)庫中被注釋為（1 of 46）3.2.1.21-Beta-glucosidase/Gentobiase。采用PCR技術(shù)克隆到山新楊PdPapGH12基因序列，此序列含有1 560個(gè)核酸。編碼519個(gè)氨基酸，蛋白序列具有完整的Glyco_hydro保守域（圖1），屬于非跨膜親水性酸性蛋白。預(yù)測(cè)其主要在細(xì)胞質(zhì)中分布，故推測(cè)PdPapGH12在胞內(nèi)發(fā)揮水解的作用。序列比對(duì)結(jié)果顯示PdPapGH12與4個(gè)楊樹品種的9條GHs基因具有高度一致性，且均具有3個(gè)高度保守靠近N端的motif（圖2（a）和（b）），這與蘇振峰[5]的分析結(jié)果水稻β-葡萄糖苷酶的3個(gè)保守基序靠近N端的結(jié)果一致。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示PdPapGH12與新疆楊的XP_034893356.1（beta-glucosidase 12-like）親緣關(guān)系最近。對(duì)PdPapGH12蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白與模型3gno.1.A的Identity 較高，此模型為水稻Beta-glucosidase Os4BGlu12的晶體結(jié)構(gòu)（圖2（c）），研究認(rèn)為水稻Os4BGlu12蛋白可能在植物的防御過程中發(fā)揮功能，其分子功能可能是降解細(xì)胞壁受病原菌侵染時(shí)被分解而產(chǎn)生的寡聚糖[27]。故推測(cè)山新楊PdPapGH12可能與水稻Os4BGlu12蛋白的功能有相似之處。

本研究以山新楊6周齡組培苗為材料，采用qRT-PCR技術(shù)分析PdPapGH12的組織表達(dá)特性，發(fā)現(xiàn)其在莖尖、葉、莖和根中均有表達(dá)，并且PdPapGH12的表達(dá)模式從幼嫩到老化的組織表達(dá)量逐漸升高，在根中的表達(dá)量最高，為幼嫩莖的332.86倍（P<0.01）。說明PdPapGH12隨楊樹發(fā)育梯度而表達(dá)提升，其生物功能可能僅在成熟組織中特異性發(fā)揮。植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中會(huì)遇到干旱、高鹽堿和極端溫度等各種非生物脅迫。此時(shí)，植物常常通過調(diào)節(jié)自身基因的表達(dá)來響應(yīng)非生物逆境的脅迫[5，16，28-29]。本研究發(fā)現(xiàn)山新楊PdPapGH12受到鹽、堿和高滲透壓脅迫，在莖尖、成熟葉和根等組織中的轉(zhuǎn)錄水平均受誘導(dǎo)而上調(diào)，說明PdPapGH12可能是楊樹響應(yīng)和抵御脅迫過程中一個(gè)重要的蛋白，并且具有正向調(diào)控抗鹽、堿和高滲透壓脅迫的能力。

尖孢鐮刀菌、核盤菌、立枯絲核菌、鏈格孢菌和金黃殼囊孢菌為常見的5種土傳植物病害致病菌，在一定環(huán)境條件下可引起植物不同程度發(fā)生根腐、莖腐、莖基腐、花腐病，及菌核病、褐斑病、葉枯病等多種病害癥狀，并且寄主較廣。本研究發(fā)現(xiàn)，山新楊根際接種不同致病真菌后，不同組織部位中PdPapGH12的響應(yīng)不同。在莖尖部位，PdPapGH12表達(dá)量均為下降，受影響程度由大到小分別為：Rs>Cc >Fo >Aa>Ss（圖5）。在成熟葉中，只有根部接種Ss菌使PdPapGH12表達(dá)量上調(diào)，而其余4種真菌均使PdPapGH12表達(dá)量下降，其中接種Fo菌使PdPapGH12表達(dá)量最低（圖5）。說明植物根系侵染病原菌48 h，莖尖和成熟葉中細(xì)胞壁的降解相對(duì)較少?？赡芨扛腥镜腟s菌對(duì)楊樹苗的葉片會(huì)產(chǎn)生影響，PdPapGH12表達(dá)量上調(diào)可能與降解葉中細(xì)胞壁被分解而產(chǎn)生的寡聚糖相關(guān)[26]。在根組織中，接種Cc菌和Ss菌使PdPapGH12表達(dá)量均為下降，而接種Fo菌、Aa菌和Rs菌均使得PdPapGH12表達(dá)量上調(diào)，其中接種Fo菌使其上調(diào)量最大，為對(duì)照的577.47倍（圖5）。由于Fo是營(yíng)半活體病原，其他致病菌是完全營(yíng)腐生病原，而PdPapGH12被具有營(yíng)活體營(yíng)養(yǎng)的病原直接接觸誘導(dǎo)表達(dá)提升最劇烈，故推測(cè)PdPapGH12可能是直接響應(yīng)這類病原的一個(gè)重要基因。研究發(fā)現(xiàn)， 擬南芥AtBGLU26在抵御真菌侵害方面起著決定性的作用，AtBGLU23在和內(nèi)寄生真菌建立共生關(guān)系方面起著決定性作用，通過阻止真菌的過度生長(zhǎng)進(jìn)而引發(fā)防御反應(yīng)[17， 30-33]。內(nèi)生真菌是營(yíng)活體營(yíng)養(yǎng)菌，F(xiàn)o是半活體，說明PdPapGH12可能在對(duì)內(nèi)生真菌的識(shí)別和響應(yīng)中也扮演重要角色，具體的作用機(jī)制有待于今后深入研究。

自然界中的植物總是受到各種病原物（如細(xì)菌、真菌和病毒等）的侵襲。植物在與病原物相互作用的過程中體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列的信號(hào)傳遞，激發(fā)植物的防御體系來產(chǎn)生抗病性反應(yīng)[33]。SA和JA在調(diào)控抗病和防衛(wèi)信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中扮演了重要的角色[34]。在進(jìn)化過程中植物同樣進(jìn)化出一系列響應(yīng)非生物脅迫（包括干旱脅迫、高鹽脅迫和冷脅迫）的信號(hào)通路，ABA是調(diào)控植物對(duì)非生物脅迫響應(yīng)的首要激素，本研究發(fā)現(xiàn)鹽、堿和PEG均誘導(dǎo)PdPapGH12在根部的轉(zhuǎn)錄水平提高，與ABA對(duì)根部誘導(dǎo)結(jié)果一致，進(jìn)一步說明PdPapGH12可能是楊樹響應(yīng)鹽、堿和干旱脅迫并做出抵御脅迫生理響應(yīng)的重要響應(yīng)蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)受根部JA、SA和ABA誘導(dǎo)，PdPapGH12在莖尖部位的表達(dá)量均下調(diào);受根部JA和SA誘導(dǎo)PdPapGH12在成熟葉中表達(dá)量均為上調(diào);在根組織中，JA和ABA誘導(dǎo)使PdPapGH12表達(dá)量均為上調(diào)。說明PdPapGH12可能參與SA、JA和ABA的信號(hào)途徑。Fo、Aa和Rs對(duì)根部PdPapGH12轉(zhuǎn)錄水平的直接誘導(dǎo)結(jié)果和JA一致，說明三者侵染可能誘導(dǎo)楊樹根部JA升高，推測(cè)PdPapGH12轉(zhuǎn)錄水平可能受JA誘導(dǎo)。因此，未來有必要對(duì)PdPapGH12應(yīng)答SA和JA介導(dǎo)的植物抗病相關(guān)途徑的調(diào)控機(jī)制和植物響應(yīng)非生物脅迫的ABA依賴性信號(hào)途徑進(jìn)行深入研究。

綜上，本研究說明了山新楊PdPapGH12基因組織表達(dá)模式為隨楊樹發(fā)育梯度而表達(dá)提升，其生物功能可能僅在成熟組織中特異性發(fā)揮。PdPapGH12是特異性地響應(yīng)鹽、堿和高滲透壓脅迫的重要蛋白。PdPapGH12能對(duì)根部多種致病真菌侵染產(chǎn)生不同程度的應(yīng)答，尤其是對(duì)Fo侵染表達(dá)高度上調(diào)，說明PdPapGH12可能是直接響應(yīng)具有營(yíng)活體營(yíng)養(yǎng)的病原的一個(gè)重要基因，并且可能在對(duì)內(nèi)生真菌的識(shí)別和響應(yīng)中也扮演重要角色。此外，PdPapGH12參與了植物激素SA、JA和ABA誘導(dǎo)的信號(hào)途徑。本研究結(jié)果將為進(jìn)一步揭示PdPapGH12基因的功能和通過分子植物育種構(gòu)建高抗速生楊樹品種提供依據(jù)。

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