破壁靈芝孢子粉對大鼠睡眠功能改善效果及機(jī)制的研究

袁群 胡海林 毛欣 王能 曹淼 何清湖

〔摘要〕 目的 觀察破壁靈芝孢子粉對正常大鼠睡眠功能的影響，初步探討其作用機(jī)制。方法 將雄性SD大鼠隨機(jī)分成正常對照組、陽性對照組、破壁靈芝孢子粉低、中、高劑量組（0.42、0.84、1.68 g/kg），每組9只，灌胃劑量為10 mL/（kg·d-1），連續(xù)灌胃14 d。末次灌胃后分別進(jìn)行直接睡眠實(shí)驗(yàn)、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)、閾上劑量睡眠潛伏期及睡眠時間實(shí)驗(yàn)，并測定大鼠血漿5-羥色胺（5-hydroxytryptamine， 5-HT）、多巴胺（dopamine， DA），及下丘腦中5-HT、谷氨酸（glutamic acid， Glu）、γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid， GABA）的含量。結(jié)果 破壁靈芝孢子粉能明顯縮短大鼠睡眠潛伏期，提高大鼠睡眠率（P<0.05），對睡眠總時長的影響雖無統(tǒng)計學(xué)差異，但有延長睡眠時間的趨勢。中、高劑量的破壁靈芝孢子粉能夠提高大鼠下丘腦5-HT、GABA含量（P<0.05，P<0.01），同時也能提高血漿中5-HT水平、降低DA的含量（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 破壁靈芝孢子粉具有睡眠改善作用，其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)大鼠腦內(nèi)5-HT和Glu/GABA平衡，以及血中興奮-抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 靈芝孢子粉;睡眠;5-羥色胺;多巴胺;γ-氨基丁酸

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.07.011

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of broken wall ganoderma spores powder on sleep function in normal rats， and explore the mechanisms. Methods Male SD rats were randomly divided into five groups， normal group， positive group and low， medium and high dose （0.42， 0.84， 1.68 g/kg） broken wall ganoderma spores group， 9 rats in each group， 10 mL/（kg·d） in intragastric administration for 14 days. After the last intragastric administration， direct sleep test， pentobarbital sodium subthreshold dose hypnotism test， supra threshold dose sleep latency test and sleep time test were conducted， and plasma 5-hydroxytryptamine （5-HT）， dopamine （DA） and the content of 5-HT， glutamic acid （Glu） and gamma-aminobutyric acid （GABA） in the hypothalamus were measured. Results Broken wall ganoderma spore powder could significantly shorten sleep latency and increase sleep rate （P<0.05）. There was no statistical difference in sleep time， but there was a tendency to prolong sleep time. Medium and

high doses of broken wall ganoderma spore powder could increase the content of 5-HT and GABA in hypothalamus and decrease the content of Glu （P<0.05， P<0.001）， at the same time， the concentration of 5-HT in plasma was increased while the DA were decreased （P<0.05， P<0.001）. Conclusion Broken wall ganoderma spores powder can improve sleep， the mechanism of which is related to the regulation of 5-HT and Glu/GABA balance in rat brain， and the neurotransmitter of excitation-inhibition of central nervous system in blood.

〔Keywords〕 broken wall ganoderma spores powder; sleep; 5-hydroxytryptamine; dopamine; gamma-aminobutyric acid

靈芝，屬于擔(dān)子菌門擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬藥用真菌[1]，是一味珍貴的中藥藥材，具有益氣安神、扶正固本之功效[2]。成熟靈芝形成擔(dān)子孢子，為繁殖細(xì)胞，收集后即為靈芝孢子粉，其含有靈芝子實(shí)體幾乎所有的活性物質(zhì)和功效作用[3]。大量的研究表明靈芝孢子粉能有效調(diào)節(jié)免疫力[4-5]，在抗腫瘤、防輻射過程中發(fā)揮著重要作用[6]，同時兼具有降血脂、護(hù)肝[7]及促眠[8]等功能。破壁靈芝孢子粉是一種靈芝深加工產(chǎn)品，有研究表明靈芝孢子粉在破壁后多糖與總?cè)坪烤哂谖雌票阪咦臃踇9]，且更容易被人體吸收[10]。目前對于靈芝孢子粉改善睡眠的研究多集中在臨床療效的觀察，而對于其改善睡眠的機(jī)制研究還鮮有報道。本研究通過觀察不同劑量破壁靈芝孢子粉對戊巴比妥鈉所致大鼠催眠作用及血漿、腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化，初步探討其作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究靈芝孢子粉改善睡眠的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 ?實(shí)驗(yàn)動物

實(shí)驗(yàn)動物為健康SPF級雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量（200±20） g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供[許可證號：SCXK（湘）2019-0004]。在湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心開展實(shí)驗(yàn)[許可證號SYZK（湘）2019-0009]。實(shí)驗(yàn)過程中動物自由飲水?dāng)z食，喂養(yǎng)的飼料相同。所用飼料和墊料均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 ?實(shí)驗(yàn)藥品與主要試劑

破壁靈芝孢子粉（浙江金華壽仙谷藥業(yè)有限公司，批號：20200306）;艾司唑侖片（華中藥業(yè)股份有限公司，批號20181203）;戊巴比妥鈉（上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站分裝廠，批號20200529）;5-羥色胺（5-hydroxytryptamine， 5-HT）、谷氨酸（glutamic acid，Glu）、γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid， GABA）、多巴胺（dopamine， DA）均購自南京建成生物科技有限公司。

1.3 ?主要儀器設(shè)備

低速離心機(jī)（型號Fresco17， Thermo公司）;多功能酶標(biāo)儀（型號VarioskanLUX， Thermo公司）等。

2 方法

2.1 ?實(shí)驗(yàn)動物分組與給藥

90只實(shí)驗(yàn)動物適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后稱質(zhì)量，隨機(jī)分為2個批次（n=45），第1批次大鼠進(jìn)行直接睡眠實(shí)驗(yàn)和戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)，第2批次大鼠進(jìn)行戊巴比妥鈉閾上劑量睡眠時間、睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)。每批大鼠分為5組（n=9），分別為正常對照組、陽性對照組、破壁靈芝孢子粉低、中、高劑量組，本實(shí)驗(yàn)的受試藥物破壁靈芝孢子粉人體推薦量4 g/d。大鼠給藥劑量根據(jù)體表面積法換算即70 kg體質(zhì)量人與1 kg體質(zhì)量大鼠之間的藥物等效劑量比值為6.25[11]，以此1、2、4倍設(shè)置低、中、高3個劑量組（簡稱低、中、高劑量組），各組每日分別給予0.42、0.84、1.68 g/kg劑量，灌胃1次/d，陽性對照組藥物（艾司唑侖，0.089 mg/kg），各組大鼠按照10 mL/kg劑量灌胃，對照組每日灌胃經(jīng)消毒處理后的蒸餾水，體積與實(shí)驗(yàn)組相同。連續(xù)灌胃14 d后檢測大鼠各項指標(biāo)。

2.2 ?行為學(xué)評價方法

2.2.1 ?直接睡眠實(shí)驗(yàn) ?大鼠睡眠以翻正反射消失為標(biāo)準(zhǔn)（當(dāng)大鼠置于背臥位時超過1 min不能翻正者，即認(rèn)為翻正反射消失）[12]，進(jìn)入睡眠狀態(tài)。灌胃1 h內(nèi)觀察各組大鼠睡眠情況，記錄各組大鼠入睡數(shù)量計算構(gòu)成比及睡眠時間，以觀察受試藥物對大鼠是否存在直接睡眠的作用。

2.2.2 ?戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn) ?閾下劑量睡眠發(fā)生率是評判藥物協(xié)同睡眠作用的一個常用指標(biāo)。根據(jù)本課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)已測得本組實(shí)驗(yàn)大鼠的戊巴比妥鈉閾下劑量為28 mg/kg（使90%～100%大鼠翻正反射不消失的最大劑量），各組動物末次灌胃后藥物作用峰值前10～15 min，按28 mg/kg腹腔注射戊巴比妥鈉，注射劑量為10 mL/kg。記錄30 min內(nèi)各組大鼠入睡的數(shù)量。

2.2.3 ?延長戊巴比妥鈉睡眠及睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn) ?戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的大鼠睡眠實(shí)驗(yàn)是評價睡眠藥物研究中必不可少的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)測得本實(shí)驗(yàn)大鼠閾上劑量為37 mg/kg（100%的大鼠發(fā)生翻正反射消失的最小劑量）[13]。即觀察在閾上劑量的干預(yù)下，各組大鼠睡眠潛伏期及睡眠時間。各組動物末次給予灌胃出現(xiàn)藥物作用峰值前10～15 min，按37 mg/kg劑量腹腔注射戊巴比妥鈉，注射劑量為10 mL/kg。從注藥至翻正反射消失這段時間為睡眠潛伏期;從翻正反射消失到其恢復(fù)這段時間為睡眠時間，記錄各組動物睡眠潛伏期和睡眠時間。

2.3 ?觀察各組大鼠血（DA、5-HT）及下丘腦組織中（5-HT、GABA、Glu）的水平

第一批次45只大鼠完成閾下劑量睡眠實(shí)驗(yàn)后禁食不禁水1 d，于次日晨稱質(zhì)量后采取戊巴比妥鈉腹腔注射（劑量40 mg/kg，注射劑量為10 mL/kg）麻醉，進(jìn)行腹主動脈采血，新鮮促凝血4 mL，離心收集上層血清;分離肝、脾、胸腺等器官并稱質(zhì)量，計算大鼠臟器指數(shù);最后采取頸椎脫臼處死大鼠，冰上斷頭取腦，分離出下丘腦組織，用預(yù)冷生理鹽水漂洗、濾紙拭干，稱質(zhì)量。按體質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶9比例，加入9倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下玻璃勻漿器勻漿，使組織勻漿化。離心半徑13.5 cm，2 500 r/min，離心10 min，取上清液待測。根據(jù)各指標(biāo)操作流程進(jìn)行，用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測和分析。

2.4 ?實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)采用雙人雙錄入的方法，用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料采用方差分析，根據(jù)方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果，方差齊則計算F值，方差不齊則采用非參數(shù)檢驗(yàn)的秩和檢驗(yàn);計數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，本研究總例數(shù)>40，1<最小的理論頻數(shù)<5，所以選擇“校正法”，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ?破壁靈芝孢子粉對大鼠行為學(xué)的影響

3.1.1 ?破壁靈芝孢子粉對大鼠直接睡眠的影響 ?干預(yù)14 d后，觀察各組大鼠灌胃后60 min內(nèi)的活動情況。各組大鼠活動正常，均未出現(xiàn)翻正反射消失，睡眠發(fā)生率為零。見表1。

3.1.2 ?破壁靈芝孢子粉對大鼠閾下劑量睡眠率的影響 ?陽性對照組睡眠率88.9%，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;靈芝孢子粉低、中、高劑量組與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

3.1.3 ?破壁靈芝孢子粉對大鼠睡眠潛伏期及睡眠時間的影響 ?在睡眠潛伏期方面，陽性對照組與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;靈芝孢子粉各劑量組與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但高劑量組大鼠入睡潛伏期最短。在睡眠總時長方面，各組大鼠睡眠時間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

3.2 ?破壁靈芝孢子粉對大鼠神經(jīng)遞質(zhì)的影響

各組隨機(jī)抽取4只大鼠進(jìn)行干預(yù)后腦組織及血漿神經(jīng)遞質(zhì)的檢測。陽性對照組較正常對照組大鼠腦組織5-HT、GABA、Glu含量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但5-HT、GABA含量有增加的趨勢，而Glu的含量卻有下降的趨勢。與正常對照組大鼠比較，靈芝孢子粉高劑量組大鼠下丘腦組織中5-HT、GABA含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），且與陽性對照組比較，靈芝孢子粉高劑量組大鼠下丘腦組織內(nèi)5-HT、GABA含量均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。靈芝孢子粉各組與正常對照組大鼠下丘腦組織中Glu含量雖有下降趨勢，但均無顯著性差異（P>0.05）。見表4。

陽性對照組較正常對照組大鼠血漿中DA含量顯著下降，而5-HT含量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而靈芝孢子粉各劑量組大鼠較正常對照組大鼠血漿中DA含量均有下降，5-HT含量均有升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），但與陽性對照組大鼠比較，靈芝孢子粉各組血漿DA含量差異卻無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;在血漿5-HT方面，僅靈芝孢子粉中劑量組大鼠較陽性對照組大鼠顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表5。

4 討論

目前對于睡眠改善的動物實(shí)驗(yàn)研究主要從行為學(xué)、免疫因子學(xué)和中樞神經(jīng)遞質(zhì)等方面著手。其中通過戊巴比妥鈉催眠實(shí)驗(yàn)[11]及中樞神經(jīng)遞質(zhì)水平來探討其效果及機(jī)制已成為中藥研究的重要途徑[14]，涉及的神經(jīng)遞質(zhì)主要有GABA、Glu、5-HT、色氨酸羥化酶（tryptophan hydroxylase， TPH）、DA、去甲腎上腺素（norepinephrine， NE）、組胺等。

4.1 ?破壁靈芝孢子粉對對大鼠睡眠改善效果觀察

本研究發(fā)現(xiàn)干預(yù)后各組大鼠均未發(fā)生睡眠現(xiàn)象，靈芝孢子粉各組大鼠自主活動有所下降，表明靈芝孢子粉具有一定的鎮(zhèn)靜作用，能夠減少動物自發(fā)性的活動，但其本身并沒有直接催眠或麻醉的作用，這一結(jié)果與肖科金等人的結(jié)果一致[15-16]。在本睡眠潛伏期研究中發(fā)現(xiàn)，靈芝孢子粉各劑量組都能顯著提高大鼠的睡眠率，且與陽性對照組在提高入睡率效果上無差異，表明靈芝孢子粉能縮短戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的大鼠睡眠潛伏期，存在延長睡眠時間的趨勢，增加閾下劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的大鼠睡眠發(fā)生率，說明靈芝孢子粉能夠增強(qiáng)巴比妥類藥物的中樞抑制作用，從而起到改善睡眠的效果，本實(shí)驗(yàn)可能因原料來源、劑量不同、干預(yù)時間長短不一致等，實(shí)驗(yàn)效果也有所不同，但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)改善睡眠的效果與受試物劑量有一定的線性關(guān)系。該結(jié)果與以往相關(guān)結(jié)果基本一致[8]。

4.2 ?破壁靈芝孢子粉對大鼠神經(jīng)遞質(zhì)的影響

5-HT主要來自胃腸道及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，血中也分布有5-HT。本研究發(fā)現(xiàn)受試藥物組大鼠下丘腦及血漿中5-HT濃度高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），說明破壁靈芝孢子粉能有效提高大鼠下丘腦及血漿5-HT含量。5-HT又名血清素，是目前較為公認(rèn)的參與睡眠-覺醒機(jī)制的經(jīng)典神經(jīng)遞質(zhì)，被認(rèn)為是腦內(nèi)的“致眠因子”，早在1968年就有研究者發(fā)現(xiàn)藥物拮抗[17]或者手術(shù)切除5-羥色胺能細(xì)胞可導(dǎo)致失眠，并得出5-羥色胺可促進(jìn)睡眠的結(jié)論[18]。本研究發(fā)現(xiàn)破壁靈芝孢子粉對下丘腦、血清中5-HT有一定的調(diào)節(jié)作用，通過提高5-HT的水平起到促進(jìn)睡眠的作用。

GABA是腦內(nèi)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，對睡眠的開始與維持起著重要的作用[19-20]。Glu作為興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)，能夠在谷氨酸脫羧酶的作用下轉(zhuǎn)化為GABA[14]，因此，認(rèn)為GABA與Glu作為腦內(nèi)主要的抑制性與興奮性神經(jīng)遞質(zhì)[21]，維持他們之間的穩(wěn)態(tài)平衡對改善睡眠也是至關(guān)重要的[22]。本研究對大鼠下丘腦組織中GABA、Glu水平進(jìn)行了檢測，中、高劑量組大鼠GABA水平高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），經(jīng)兩兩組間比較發(fā)現(xiàn)，提高水平與受試物劑量存在一定的量效關(guān)系，高劑量組增高最明顯。該結(jié)果表明破壁靈芝孢子粉能夠降低因Glu占比過高或GABA占比過低所引起的興奮，使其處于平衡狀態(tài)。

DA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布的神經(jīng)遞質(zhì)，在睡眠-覺醒調(diào)控中發(fā)揮重要的作用[23]。目前研究認(rèn)為DA在覺醒狀態(tài)中起著極其重要的作用[24]，主要通過腦內(nèi)的DA能神經(jīng)系統(tǒng)來發(fā)揮其作用，Li等[25]發(fā)現(xiàn)一些擬DA藥物是通過對前腦基底部及腦干區(qū)域的作用而促進(jìn)覺醒延長。本研究中受試藥物各組大鼠血漿DA水平顯著低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），證明靈芝孢子粉在改善睡眠方面不單是提高抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的水平，同時對興奮性遞質(zhì)水平也有一定的調(diào)節(jié)作用。

5 小結(jié)

區(qū)別于以往以疾病為基礎(chǔ)的機(jī)制研究，本研究從正常大鼠著手，探討靈芝孢子粉對正常大鼠睡眠效果的影響機(jī)制，并針對中藥成分多、途徑多的特點(diǎn)，將大鼠下丘腦GABA、5-HT和Glu以及血漿5-HT和DA作為檢測對象，研究結(jié)果表明破壁靈芝孢子粉不僅能夠提高下丘腦與血漿中5-HT含量，還能有效調(diào)節(jié)下丘腦GABA與Glu的含量，維持Glu/GABA平衡，并且能降低血漿中DA水平，說明靈芝孢子粉不僅通過提高抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的水平、降低興奮性神經(jīng)遞質(zhì)含量，還能調(diào)節(jié)Glu與GABA含量，維持興奮性神經(jīng)遞質(zhì)與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之間的穩(wěn)態(tài)平衡，從而發(fā)揮改善睡眠的作用，這為靈芝孢子粉治療失眠提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并為本課題組深入探討靈芝孢子粉改善失眠的作用機(jī)制提供了參考。本研究在設(shè)計上也存在一些不足，如未對TPH進(jìn)行檢測，該酶作為5-HT生物合成中的起始酶和限速酶，被認(rèn)為對調(diào)節(jié)5-HT濃度有關(guān)鍵作用。在后期的研究中將補(bǔ)充研究5-HT與TPH之間的平衡關(guān)系，以探討靈芝孢子粉對5-HT能系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制。

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