禽流感病毒的監(jiān)測(cè)及診斷

譚 偉,李 孟，謝芝勛

流感大流行嚴(yán)重地危害人們的身體健康、影響人們的日常工作和生活。1918年發(fā)生的“西班牙流感”(H1N1亞型)曾造成全球大約四千多萬人的死亡,疫情波及到世界上許多國家[1]。此后,還陸續(xù)發(fā)生過1957年的“亞洲流感”(H2N2亞型)、1968年的“香港流感”(H3N2亞型)及2009年的“墨西哥流感”(H1N1亞型)[1]。

2003-2004年,在香港、荷蘭、泰國及越南等國家又分別發(fā)現(xiàn)了HPAIV感染人的病例[4]。2013年3月底在我國上海和安徽等一些省份也陸續(xù)發(fā)生了AIV(H7N9亞型)感染人并引發(fā)死亡的病例[5]。雖然目前人們普遍認(rèn)為AIV通過人傳播給人的概率很低,但AIV極易發(fā)生變異及近些年來有關(guān)AIV感染人的報(bào)道呈逐漸增多的趨勢(shì),迫切需要政府和防疫部門去更多地關(guān)注禽流感的監(jiān)測(cè)、診斷及預(yù)防等問題。因此研發(fā)快速、特異、靈敏、簡(jiǎn)便的AIV監(jiān)測(cè)及診斷試劑目前已成為AIV研究的熱點(diǎn)問題。

短暫等待和延遲滿足不一樣，它給了孩子一個(gè)確定的指向，并且時(shí)間相對(duì)較短。很多時(shí)候，我們?nèi)菀椎凸篮⒆拥牡却芰Γ驗(yàn)樗麄兛偸潜憩F(xiàn)出馬上就要反饋的樣子，讓我們覺得孩子都是急性子。其實(shí)，兒童心理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，一歲到三歲的孩子，慢慢就具備了短暫等待的能力，比如他們能等到別的小朋友玩過后，再玩同一個(gè)玩具。

1 禽流感病毒的特點(diǎn)

AIV的天然宿主包括水禽、野生鳥類和候鳥等[6]。AIV能夠通過消化道或呼吸道感染水禽。AIV若傳染給人則會(huì)造成嚴(yán)重的危害,重者可導(dǎo)致患者呼吸系統(tǒng)功能衰竭、甚至死亡。AIV屬于正粘病毒科(Orthomyxovirdae)甲型流感病毒屬,是有囊膜的、單股、分節(jié)段、負(fù)鏈RNA病毒[1]。AIV含有8個(gè)基因片段, 可以編碼10個(gè)不同的病毒蛋白,包括血凝素(Hemagglutinin,HA)、神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase,NA)、基質(zhì)蛋白(M1、M2)、核蛋白(NP)、非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2)以及RNA聚合酶P蛋白復(fù)合體(PB1、PB2、PA)[1]。HA蛋白含有中和抗原決定簇,可以刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體,而NA蛋白刺激產(chǎn)生中和抗體的能力則稍弱。

A型流感病毒的宿主范圍廣,既可以感染人,也能夠感染其它種屬的宿主,如雞、鴨、鵝、野生鳥類、豬、馬、狗、貓、虎、水貂等[7]。季節(jié)性流感大多是由A型流感病毒所引起。值得指出的是,目前已知的流感大流行均是由A型流感病毒所造成的。雖然過去關(guān)于AIV直接感染人的報(bào)道不多,但近些年來有不少這方面的報(bào)道[3,5]。根據(jù)AIV兩個(gè)表面蛋白(HA和NA)抗原性的不同，可將AIV分成16個(gè)HA亞型(H1-H16)及9個(gè)NA亞型(N1-N9)[6]。還可根據(jù)病毒基因組序列及地理分布的差異,將AIV分為北美譜系(North American lineage)和歐亞譜系(Eurasian lineage)[8]。

克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇快速檢測(cè)卡由北京維德康生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，國家獸藥安全評(píng)價(jià)中心監(jiān)制，貴州省獸藥飼料監(jiān)察所提供。快速檢測(cè)卡需保存在（20±5） ℃的環(huán)境中，有效期為12個(gè)月，具體生產(chǎn)日期見批號(hào)。該種檢測(cè)卡主要檢測(cè)豬、牛、羊等動(dòng)物，可以檢測(cè)其尿液和屠宰后的酮體。

2 禽流感病毒的傳統(tǒng)檢測(cè)方法

AIV的特異性核酸序列經(jīng)過常規(guī)RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增后,通過電泳后觀察特異性PCR產(chǎn)物片段的大小來判斷是否在檢測(cè)樣本中含有AIV的特定基因片段。由于常規(guī)RT-PCR方法的特異性及敏感性較高,且不需要復(fù)雜昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備,因此這一方法被廣泛用于AIV的檢測(cè)及診斷。

病毒分離的具體做法是: 采用9～11 d齡無特異性病原體的雞胚，在其尿囊腔內(nèi)接種懷疑有AIV的樣本,將接種后的雞胚在35～37 ℃的條件下孵育3～7 d[9]。收集接種24 h后死亡的雞胚及第7 d未死雞胚中的尿囊液測(cè)定其血凝活性。若血凝試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果為陽性,則說明尿囊液中很可能含有AIV。如果第一代分離物血凝試驗(yàn)結(jié)果呈陰性,尿囊液樣本再用雞胚傳1～2代,采用相同方法觀察雞胚的發(fā)育情況和檢測(cè)尿囊液中的血凝活性。因?yàn)橛行z測(cè)樣本中的病毒含量很低，需要通過雞胚連續(xù)培養(yǎng)來獲得高滴度的病毒。

（2）夏季強(qiáng)輻射和高溫使得大氣的氧化性提高。夏季O3能夠顯著地影響大氣氧化性，強(qiáng)的大氣氧化性促進(jìn)二次顆粒物形成。在冬季，O3對(duì)于大氣氧化性的貢獻(xiàn)不顯著，NO2對(duì)于大氣氧化性的增強(qiáng)有更多的貢獻(xiàn)。

母液循環(huán)套用時(shí)，作為起催化作用的甲醇鈉不加或者減少加入量是否對(duì)產(chǎn)品的收率有一定的影響？在保持其他反應(yīng)條件不變的前提下，逐步增加甲醇鈉的量，觀察收率與含量的變化，如表4所示。

歷經(jīng)風(fēng)雨之后，方知社會(huì)是復(fù)雜的，水仙芝不想把它看得更復(fù)雜。她想過一種簡(jiǎn)單的生活，一種純凈、沒有污染的生活。讀了很多書，她更不相信書，倒相信感覺。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由Notomi等人于2000年最先報(bào)導(dǎo)的[22]。該反應(yīng)體系在等溫條件下擴(kuò)增DNA，不用對(duì)核酸進(jìn)行變性和復(fù)性，但需要設(shè)計(jì)4個(gè)引物來識(shí)別靶DNA序列上的6個(gè)不同結(jié)合位點(diǎn)。此法能在很短時(shí)間內(nèi)復(fù)制模板獲得109的擴(kuò)增產(chǎn)物。后來人們又建立了使用6個(gè)簡(jiǎn)并引物的逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(RT-LAMP)[23]。

2.3AIV的毒力測(cè)定 AIV的毒力主要是通過6 w齡雞體實(shí)驗(yàn)的靜脈內(nèi)致病指數(shù)(Intravenous pathogenicity index,IVPI)來判定,即若AIV在6 w齡雞體內(nèi)的IVPI大于1.2時(shí),則認(rèn)為被檢毒株屬于HPAIV[9]。另一常用的判定毒力方法是,當(dāng)AIV經(jīng)靜脈途徑感染4～8 w齡雞后,若在10 d內(nèi)引起至少75%的雞群死亡,則也可以將所測(cè)定的AIV毒株劃歸為HPAIV[9]。研究結(jié)果表明,目前所發(fā)現(xiàn)的HPAIV大多是H5或H7亞型。盡管仍有不少H5或H7亞型的AIV是LPAIV,可是一旦它們經(jīng)基因突變或基因重配后就很有可能形成HPAIV，感染新的宿主。

NASBA法的優(yōu)點(diǎn)在于它在細(xì)胞基因組DNA存在的情況下仍能特異性地?cái)U(kuò)增病毒單鏈RNA序列。實(shí)時(shí)熒光NASBA也已被用于檢測(cè)不同亞型的AIV[10]。由于此法特異、簡(jiǎn)便易行,不需要PCR反應(yīng)儀及熒光檢測(cè)器等設(shè)備,因此該方法已成為發(fā)展中國家禽流感疫情監(jiān)測(cè)和診斷的重要手段之一。

3 分子生物學(xué)手段檢測(cè)禽流感病毒

應(yīng)用分子生物學(xué)手段檢測(cè)禽流感病毒是近十多年來的發(fā)展趨勢(shì)[9-10,15,17],其優(yōu)點(diǎn)是快速、敏感、特異、可靠且便于操作。一旦發(fā)現(xiàn)疑似禽流感流行,首先采取的措施是“撲殺政策”以清除傳染源。因此建立快速、特異、敏感、便捷的檢測(cè)AIV的分子生物學(xué)手段對(duì)監(jiān)測(cè)、控制及預(yù)防禽流感意義重大。

貨幣資金是重要的企業(yè)資產(chǎn)，在正常生產(chǎn)經(jīng)營過程中起關(guān)鍵性的作用，是企業(yè)關(guān)注的重點(diǎn)資產(chǎn)之一，而正由于貨幣資金的重要性和流動(dòng)性，貨幣資金舞弊現(xiàn)象也常有發(fā)生。加強(qiáng)貨幣資金的內(nèi)部控制，對(duì)于保證資金安全,提高資金運(yùn)營效率,促進(jìn)企業(yè)持續(xù)健康發(fā)展起著非常重要的作用。

3.1逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)可分為一步法和兩步法[18]。一步法的優(yōu)點(diǎn)是快速、簡(jiǎn)便。病毒RNA分子的轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)均在同一個(gè)管內(nèi)進(jìn)行,從而減少了交叉污染的機(jī)會(huì)。兩步法是先進(jìn)行病毒RNA的轉(zhuǎn)錄,然后再啟動(dòng)PCR反應(yīng)。由于病毒RNA的逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)條件分別進(jìn)行優(yōu)化,所以兩步RT-PCR法要比一步法檢測(cè)靈敏度更高。同時(shí)兩步法中得到的病毒互補(bǔ)DNA產(chǎn)物的量足以用于多次檢測(cè)，便于優(yōu)化最佳的PCR反應(yīng)條件及重復(fù)實(shí)驗(yàn)。而一步法則在每次實(shí)驗(yàn)中都會(huì)直接消耗病毒RNA模板。因此當(dāng)臨床上得到的病毒RNA樣本量很少的情況下，采用兩步法似乎更為可取。

2.1病毒分離及血清學(xué)檢測(cè)方法 AIV的鑒別診斷相對(duì)比較復(fù)雜,一方面是由于AIV的抗原性容易發(fā)生改變,另一方面則是因?yàn)锳IV在其天然宿主中一般不引起嚴(yán)重的病癥,即使出現(xiàn)一些臨床癥狀也不典型、不明顯。檢測(cè)AIV的常用方法有病毒分離鑒定和血清中AIV特異性抗體的檢測(cè)。病毒分離方法特異、敏感、可靠，是檢測(cè)AIV的“金標(biāo)準(zhǔn)”(Gold Standard)[9]。這一方法能對(duì)病毒的生物學(xué)性狀進(jìn)行分析,同時(shí)增殖大量的病毒也為測(cè)定病毒全基因組序列或進(jìn)行其它檢測(cè)和生物學(xué)特性分析準(zhǔn)備了充足的材料。

3.2實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) Spackman等人于2002年首次報(bào)道了采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time RT-PCR,RRT-PCR)來檢測(cè)H5及H7亞型的AIV核酸序列[19]。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR不僅需要一對(duì)PCR引物來特異性地?cái)U(kuò)增AIV的基因序列,同時(shí)還需要一個(gè)用熒光標(biāo)記的探針來監(jiān)測(cè)PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增狀態(tài)。此法與常規(guī)RT-PCR的最大不同之處在于,它可以監(jiān)測(cè)到每一時(shí)刻產(chǎn)物的積聚程度。RRT-PCR的特點(diǎn)是快速,特異性及敏感性也很好,不需要傳統(tǒng)的電泳分析步驟,既省時(shí)又能對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物做定量分析。但需注意的是應(yīng)同時(shí)測(cè)定反應(yīng)體系中內(nèi)參基因的表達(dá)水平以排除假陰性。

影響RRT-PCR敏感性的因素有很多,例如,抽提得到的病毒RNA的量、純度以及RNA是否被降解、RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中引物、PCR反應(yīng)條件、PCR反應(yīng)體系中是否存在DNA聚合酶的抑制劑、以及PCR引物和探針的設(shè)計(jì)等。目前用RRT-PCR來檢測(cè)AIV已成為世界上許多國家和地區(qū)的AIV參考實(shí)驗(yàn)室所常規(guī)使用的診斷方法之一[15]。多重RRT-PCR可以用于快速檢測(cè)和區(qū)分不同亞型的AIV[20]，適合臨床樣本的檢測(cè)。

3.3核酸序列依賴性擴(kuò)增法 核酸序列依賴性擴(kuò)增法(Nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)最早是由Kwoh等人報(bào)道[21],此法是根據(jù)轉(zhuǎn)錄及逆轉(zhuǎn)錄原理來等溫?cái)U(kuò)增病毒核酸序列[21]。擴(kuò)增反應(yīng)需要上游及下游引物,其上游引物的5′末端含有啟動(dòng)子序列，可以被噬菌體T7依賴于DNA的RNA聚合酶所識(shí)別。而下游引物的5′末端則含有一段特殊設(shè)計(jì)的序列,它能與經(jīng)電化學(xué)發(fā)光物標(biāo)記的檢測(cè)探針互補(bǔ)結(jié)合。

學(xué)生干部群體作為優(yōu)秀學(xué)生的集合體，有更多與外校優(yōu)秀學(xué)生交流的機(jī)會(huì)，并且容易從各種途徑獲得參加國際競(jìng)賽的信息，他們之間相互鼓勵(lì)，形成良性循環(huán)，因此，學(xué)生干部對(duì)專業(yè)英語的重要性認(rèn)知高于非學(xué)生干部學(xué)生。教師可以利用課堂時(shí)間，給予學(xué)生相互交流的機(jī)會(huì)，不定期開展跨班、跨年級(jí)，甚至跨專業(yè)、跨院系的小講座，豐富課余生活的同時(shí)也能開闊學(xué)生眼界，認(rèn)清自身不足，激發(fā)學(xué)習(xí)動(dòng)力。

判斷H5或H7亞型的LPAIV有無可能成為HPAIV的一個(gè)常用標(biāo)準(zhǔn)是:通過序列測(cè)定檢查病毒HA前體中的蛋白酶裂解位點(diǎn)附近是否含有多個(gè)堿性氨基酸。人們發(fā)現(xiàn)在HA前體蛋白裂解位點(diǎn)附近,LPAIV大多含有一個(gè)精氨酸,而HPAIV則常含有多個(gè)堿性氨基酸,除了含精氨酸外還含有賴氨酸[9]。然而值得注意的是例外的情況也時(shí)有發(fā)生。

3.4環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法

值得注意的是,AIV經(jīng)過適應(yīng)后也可以感染其它畜類(像豬、馬等)。因此這些被感染的動(dòng)物亦可以作為AIV的短期中間宿主。根據(jù)對(duì)雞或火雞致病性的不同，可將AIV分為高致病性(Highly pathogenic avian influenza virus, HPAIV)和低致病性禽流感病毒(Low pathogenic avian influenza virus, LPAIV)[9]。HPAIV可感染不同組織中的多種細(xì)胞引起全身性感染,而LPAIV引起的感染則常局限于呼吸道或消化道。

2.2病毒特異性抗原的檢測(cè)法 病毒特異性抗原檢測(cè)法采用的原理主要利用針對(duì)AIV特異性抗原的抗體來捕獲AIV特異性抗原，例如瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等[11]。目前已有檢測(cè)AIV特異性抗原的試劑盒問世[12]。由于AIV的核蛋白(NP)相對(duì)保守,不易變異,所以目前采用的病毒抗原捕獲免疫測(cè)定主要是用來檢測(cè)AIV的核蛋白。AIV特異性抗原檢測(cè)法的優(yōu)點(diǎn)是快速,據(jù)報(bào)道有些方法可以在30 min之內(nèi)得到檢測(cè)結(jié)果[13]。目前可以檢測(cè)AIV N1、N2、N3及N7亞型的抗體的ELISA方法均已建立[14]。但抗原測(cè)定法目前存在的主要問題是檢測(cè)敏感度低于病毒分離法及病毒核酸檢測(cè)法,同時(shí)對(duì)所測(cè)樣品的質(zhì)量要求較高。檢測(cè)AIV特異性抗體的試劑盒則可用于評(píng)估鳥類或禽類是否曾接觸或感染過AIV。

此法快速、簡(jiǎn)便、易于操作、不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備、且反應(yīng)可在水浴中完成，因此這一方法用于發(fā)展中國家AIV的野外篩查、監(jiān)測(cè)和診斷有著廣泛的應(yīng)用前景。LAMP及RT-LAMP的檢測(cè)靈敏度受其檢測(cè)體系中引物的影響。因此應(yīng)收集和分析新出現(xiàn)的AIV變異株的序列結(jié)構(gòu),并以此來不斷優(yōu)化RT-LAMP的引物從而提高RT-LAMP法檢測(cè)AIV流行變異株的敏感性。

3.5基因芯片法 基因芯片法(DNA Microarray)是在20世紀(jì)90年代發(fā)展起來高通量檢測(cè)技術(shù)[24]。它可以用來同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞基因組中上萬個(gè)基因RNA轉(zhuǎn)錄體表達(dá)的變化。此法采用的基本原理是DNA與其互補(bǔ)序列彼此雜交?；蛐酒ò?個(gè)基本操作步驟：基因芯片的制作、樣本制備、雜交、檢測(cè)、數(shù)據(jù)的采集和分析。簡(jiǎn)單來說，就是在固狀載體表面結(jié)合上預(yù)先選擇設(shè)計(jì)好的檢測(cè)捕獲探針，然后將待測(cè)及對(duì)照樣本用不同的熒光物進(jìn)行標(biāo)記。等比例混合熒光標(biāo)記產(chǎn)物后再加入基因芯片中使之與不同的檢測(cè)探針雜交。雜交信號(hào)通過熒光激光掃描檢測(cè)器收集后，再用計(jì)算機(jī)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理[24]。

基因芯片法可以比較多種基因的表達(dá)圖譜，用于檢測(cè)AIV樣品中的基因型、基因的缺失、擴(kuò)增以及基因測(cè)序等。FluChip及M基因芯片法已被用來特異性地檢測(cè)A型流感病毒的不同亞型[25]。據(jù)報(bào)道采用M基因芯片法，從病人臨床樣本中提取病毒RNA到完成基因芯片檢測(cè)只需要不到7個(gè)小時(shí)的時(shí)間[25]。基因芯片法也可用于測(cè)定HPAIV或LPAIV感染細(xì)胞后宿主基因表達(dá)的變化，從而了解AIV的強(qiáng)、弱毒株通過哪些細(xì)胞內(nèi)通路來影響細(xì)胞基因的表達(dá)?；蛐酒ㄒ嗫梢杂脕頇z測(cè)AIV基因組的堿基突變。

3.6常規(guī)測(cè)序及新一代DNA測(cè)序方法 DNA測(cè)序法最早是分別由Maxam和Gilbert(化學(xué)法)以及Sanger(酶法)等人所建立[26-27]。以后Sanger測(cè)序法逐漸被世界上許多實(shí)驗(yàn)室所廣泛采用。傳統(tǒng)的、手工操作的Sanger測(cè)序法現(xiàn)已發(fā)展成為半自動(dòng)的毛細(xì)管電泳法。Sanger法可以直接測(cè)定細(xì)胞基因組DNA或?qū)⒏信d趣的DNA片段擴(kuò)增放大后再測(cè)序。一般來講，Sanger測(cè)序法的一個(gè)反應(yīng)可以準(zhǔn)確測(cè)定約800 bp左右的DNA序列[28-29]。至今Sanger法在AIV亞型及全基因組序列的測(cè)定中仍發(fā)揮著重要作用。

經(jīng)雞胚培養(yǎng)分離出具有血凝活性的AIV后,可以通過血凝抑制試驗(yàn)(HI)、神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)(NI)來鑒定AIV的亞型。病毒分離法和血清學(xué)方法的優(yōu)點(diǎn)在于它們可以用來準(zhǔn)確判斷是否發(fā)生了AIV的感染。然而它們卻難以監(jiān)測(cè)環(huán)境中由于突變不斷產(chǎn)生的新的AIV變異株[10]，這主要是由于人們常常缺乏針對(duì)新出現(xiàn)的AIV抗原變異株起特異性反應(yīng)的血清、抗體及相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)診斷試劑。

近年來發(fā)展起來的新一代測(cè)序方法包括Roche的454基因組測(cè)序儀(454 Genome Sequencer)，Illumina的基因組分析儀(the Genome Analyzer)以及Applied Biosystems的SOliD系統(tǒng)等[28-29]。這些測(cè)序技術(shù)的最大特點(diǎn)是高通量檢測(cè)，一次反應(yīng)測(cè)定出的堿基序列可達(dá)gigabase(109)[30]。與常規(guī)測(cè)序法不同，新一代測(cè)序法測(cè)定的DNA長度較短，從25～400 bp不等。但新一代測(cè)序技術(shù)不是簡(jiǎn)單地測(cè)定單一的DNA分子序列，而是同時(shí)對(duì)高達(dá)10萬(Roche 454系統(tǒng))甚至數(shù)百萬(the Genome Analyzer和SOLiD系統(tǒng))的DNA分子進(jìn)行反復(fù)多次的測(cè)定，因此這種測(cè)序方法的精確度很高。

新一代測(cè)序法主要用來發(fā)現(xiàn)DNA中新突變的堿基，而常規(guī)測(cè)序法則可用來進(jìn)一步驗(yàn)證新一代測(cè)序法得到的結(jié)果。AIV是RNA病毒，只要將其RNA基因經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)變成互補(bǔ)DNA就可以對(duì)其基因進(jìn)行測(cè)序。新一代測(cè)序法不僅可用于檢測(cè)多種AIV毒株的亞型，同時(shí)還可以測(cè)定病毒基因組的全序列[24,28]。基因芯片法和新一代測(cè)序法的特點(diǎn)是高通量、快速，自動(dòng)化程度高，并能精確檢測(cè)到單個(gè)核苷酸的水平。但是基因芯片法在設(shè)計(jì)檢測(cè)探針的時(shí)候必須事先知道所要測(cè)定的細(xì)胞或病毒基因組的核苷酸序列，而新一代測(cè)序法則沒有這個(gè)限制。因此在監(jiān)測(cè)新出現(xiàn)的AIV變異株這方面，新一代測(cè)序法可能要比基因芯片法有更大的優(yōu)勢(shì)。盡管以上兩種方法優(yōu)點(diǎn)明顯，但由于需要昂貴的儀器設(shè)備及分析軟件，所以它們目前在一般的臨床檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室里還沒有被廣泛采用。

隨著檢測(cè)技術(shù)的更新、發(fā)展及檢測(cè)成本的逐步降低，基因芯片法和新一代測(cè)序法很可能會(huì)在不遠(yuǎn)的將來發(fā)展成為檢測(cè)AIV亞型及其全基因組測(cè)序的重要手段。

4 結(jié) 語

監(jiān)測(cè)AIV的流行變異株有助于流感疫苗株的選用,同時(shí)也是監(jiān)測(cè)評(píng)估AIV在環(huán)境及易感宿主中變化的重要一環(huán)?？焖贆z測(cè)及診斷AIV在野鳥、家禽及其它種屬動(dòng)物中的流行分布及流行株遺傳變異等對(duì)控制AIV的傳播意義重大。一方面人們應(yīng)在現(xiàn)有方法的基礎(chǔ)上不斷改善目前已使用的AIV檢測(cè)方法,新型檢測(cè)方法及試劑盒應(yīng)能準(zhǔn)確地區(qū)分AIV的16個(gè)HA亞型及9個(gè)NA亞型, 同時(shí)還應(yīng)能鑒別區(qū)分HPAIV與LPAIV。

目前所開展的校企合作還不夠深入，不少企業(yè)在校企合作培養(yǎng)人才過程中積極性不高，更愿意提供學(xué)生實(shí)踐的場(chǎng)所，不愿意花更多精力參與培養(yǎng)過程。為了提高企業(yè)的參與度，有學(xué)者認(rèn)為“政校企”合作應(yīng)是我國教育發(fā)展的新模式，在地方政府部門的支持和引導(dǎo)下，企業(yè)與高校密切合作，形成地方政府、高校、企業(yè)三方共同參與，建立相互依賴、互利互惠的合作伙伴關(guān)系[5]。根據(jù)德國校企合作經(jīng)驗(yàn)，開展深度的校企合作，應(yīng)建立、健全、完善校企合作的激勵(lì)機(jī)制，充分考慮各種因素，全面激發(fā)各參與主體合作的熱情，制定一系列科學(xué)合理的獎(jiǎng)勵(lì)措施、一攬子行之有效的懲戒舉措，充分挖掘產(chǎn)學(xué)研合作各方的潛力[6]。

應(yīng)探索開發(fā)新型的分子生物學(xué)檢測(cè)手段,使其在快速檢測(cè)，亞型鑒別，毒力監(jiān)測(cè)和變異株篩查等方面取得新進(jìn)展和突破。今后AIV檢測(cè)方法的研究應(yīng)朝快速、特異、靈敏、準(zhǔn)確、高通量、價(jià)廉、便于攜帶并可用于野外操作的方向來發(fā)展。早期檢測(cè)、快速應(yīng)對(duì)、及時(shí)采取適當(dāng)?shù)姆婪洞胧┦穷A(yù)防,控制流感大流行的關(guān)鍵。堅(jiān)持長期監(jiān)測(cè)、對(duì)AIV流行變異株做序列相關(guān)性分析及流行病學(xué)的調(diào)查將會(huì)為預(yù)測(cè)禽流感的發(fā)生趨勢(shì)、掌握其變化規(guī)律提供有力的科學(xué)依據(jù)。

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